楊劍萍，蘇婷婷，張韓潔，林曉純，劉小意，黃 灝，汪雅麗

(廣東第二師范學(xué)院化學(xué)系，廣東 廣州 510303)

甘草黃酮的提取分離及其葡萄糖苷酶抑制活性研究

楊劍萍，蘇婷婷，張韓潔，林曉純，劉小意，黃 灝，汪雅麗

(廣東第二師范學(xué)院化學(xué)系，廣東 廣州 510303)

采用超聲提取和堿溶酸沉法提取甘草的活性成分甘草黃酮；通過化學(xué)顯色法進(jìn)行定性鑒定，采用分光光度法測(cè)定甘草黃酮含量；并建立了一種基于電化學(xué)法的葡萄糖苷酶抑制活性篩選新方法，以臨床降糖藥阿卡波糖驗(yàn)證了電化學(xué)篩選法的可靠性。結(jié)果表明，甘草黃酮具有較好的葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50為67.6 mg·L-1。葡萄糖苷酶抑制活性電化學(xué)篩選法具有良好的準(zhǔn)確性和抗干擾能力，為中藥葡萄糖苷酶抑制劑的研發(fā)提供了有價(jià)值的參考。

甘草黃酮；葡萄糖苷酶抑制活性；電化學(xué)法；酶抑制劑

甘草是多年生豆科草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，有效成分主要為甘草黃酮、甘草酸和甘草多糖。文獻(xiàn)報(bào)道，甘草黃酮具有良好的抗氧化、抗病毒、止咳平喘、調(diào)和諸藥等生理活性[1-2]，但有關(guān)甘草黃酮的葡萄糖苷酶抑制活性尚不明確。

我國(guó)天然藥物資源豐富，采用中藥治療糖尿病已有多年的臨床實(shí)踐；此外，中藥的毒副作用相對(duì)較小且療效顯著，從天然藥物中篩選葡萄糖苷酶抑制藥物具有廣闊的應(yīng)用前景[3-4]。目前，藥物葡萄糖苷酶抑制活性篩選常采用碘量法和分光光度法，容易受溶液背景顏色的干擾從而造成實(shí)驗(yàn)誤差大。由于中藥提取物大部分具有較深的顏色，不可避免會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5]。因此，開發(fā)一種篩選中藥葡萄糖苷酶抑制活性的新方法很有必要。作者采用超聲提取和堿溶酸沉法提取甘草黃酮，建立了一種適用于天然藥物有效成分的葡萄糖苷酶抑制劑快速篩選的電化學(xué)法，并對(duì)電化學(xué)篩選法的可靠性和抗干擾性進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

甘草，大森林藥店，粉碎過四號(hào)篩。

α-葡萄糖苷酶、葡萄糖、淀粉，上海伯奧生物科技有限公司；阿卡波糖(每片含阿卡波糖50 mg)，德國(guó)拜耳公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；硝酸銅，分析純，廣州試劑廠。

TU-1900型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析儀器公司；CS電化學(xué)工作站，武漢科恩特儀器有限公司；玻碳電極、Ag/AgCl電極和鉑絲電極。

1.2 甘草黃酮的提取分離

稱取甘草粉末50 g于燒杯中，加入500 mL 95%乙醇溶液浸漬過夜，置于超聲波清洗器中提取1 h，過濾。濾液減壓濃縮成浸膏狀，然后加5% Na2CO3溶液溶解，再加入濃鹽酸調(diào)至pH值為1～2，甘草黃酮沉淀析出，抽濾。重復(fù)2次堿溶酸沉過程，干燥，得到較純的甘草黃酮提取物[6]。

1.3 甘草黃酮提取物的定性鑒定

取少量提取物溶于1 mL乙醇中，撒一點(diǎn)鎂粉，滴加2滴濃鹽酸，觀察顏色變化。用玻璃棒蘸取提取液于濾紙上，干燥后噴灑1%乙酸鎂甲醇溶液，置于紫外光下觀察。

1.4 甘草黃酮含量的測(cè)定

稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用50%乙醇溶解，定容到50 mL容量瓶中，配成濃度為0.20 g·L-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，加50%乙醇定容到5 mL，加5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加4%NaOH溶液2 mL，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，于510 nm處測(cè)吸光度。

稱取甘草黃酮提取物40.0 mg，用50%乙醇溶解，定容到50 mL容量瓶中，準(zhǔn)確移取1 mL溶液至10 mL容量瓶中，同法測(cè)定溶液吸光度，計(jì)算甘草黃酮含量。

1.5 葡萄糖濃度的電化學(xué)法測(cè)定

以沉積了氧化銅的玻碳電極為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，Ag/AgCl電極為參比電極，構(gòu)成一個(gè)簡(jiǎn)便的電化學(xué)安培傳感器用于測(cè)定葡萄糖濃度。電沉積方法如下：在0.1 mol·L-1Cu(NO3)2(0.1 mol·L-1KCl作為支持電解質(zhì))溶液中對(duì)玻碳電極進(jìn)行電沉積。恒電位極化電位為-0.4 V，時(shí)間為3 min，常溫下晾干；電位設(shè)為-0.5～0.3 V，在0.1 mol·L-1NaOH溶液里循環(huán)伏安循環(huán)20圈，得到沉積了氧化銅的玻碳電極[7]。

循環(huán)伏安的檢測(cè)條件：電解質(zhì)溶液為0.1 mol·L-1NaOH溶液，電位范圍為0～0.8 V，掃描速率為100 mV·s-1，電流量程為20 mA，檢測(cè)葡萄糖濃度為0.005 mol·L-1。電流與葡萄糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定條件：在不斷磁力攪拌下滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，電位設(shè)為0.6 V，葡萄糖濃度在1 000 s內(nèi)從0.1 mmol·L-1到10 mmol·L-1，每個(gè)濃度檢測(cè)3次[8]。

1.6 葡萄糖苷酶抑制活性實(shí)驗(yàn)

1.6.1 酶液的配制

稱取α-葡萄糖苷酶16.0 mg置于50 mL燒杯中，加入0.1 mol·L-1pH值6.8的磷酸鈉緩沖溶液30 mL，攪拌溶解后將上清液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用磷酸鈉緩沖溶液定容至刻度，搖勻，配成濃度為5 U·mL-1的酶液。置于4 ℃冰箱內(nèi)靜置過夜，過濾，移取0.2 mL濾液于10 mL容量瓶中，用磷酸鈉緩沖溶液定容至刻度，搖勻，配成濃度為0.1 U·mL-1的酶液。

1.6.2 淀粉溶液的配制

稱取2.0 g淀粉，加蒸餾水溶解，邊攪拌邊加入約80 mL熱水，煮沸3 min，靜置冷卻過濾至100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，配成濃度為2.0%淀粉溶液。

1.6.3 酶抑制活性的測(cè)定

6支試管分別標(biāo)號(hào)a、b、c、d、e、f ，其中a為空白組，不加酶也不加阿卡波糖；b為陰性對(duì)照組，加酶不加阿卡波糖；c為陽(yáng)性對(duì)照組，加酶、加0.1 mL阿卡波糖；d、e、f為樣品組，加酶、加不同濃度的甘草黃酮提取物溶液。試劑加入的順序?yàn)椋簆H值6.8的磷酸鈉緩沖溶液2.5 mL，酶液0.5 mL(空白組加0.5 mL磷酸鈉緩沖溶液)，0.1 mL阿卡波糖，置于37 ℃水浴10 min，再加入5 mL 2.0%淀粉溶液，37 ℃水浴中恒溫20 min，加入6 mL 0.5 mol·L-1NaOH溶液終止反應(yīng)。迅速冷卻至室溫，蒸餾水定容至30 mL，分別檢測(cè)各反應(yīng)體系的葡萄糖濃度。按下式計(jì)算酶抑制率(I)：

式中：b為陰性對(duì)照組葡萄糖濃度；d為樣品組葡萄糖濃度；a為空白組葡萄糖濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取物的定性分析

提取物遇鎂粉和濃鹽酸出現(xiàn)紅色；再噴灑乙酸鎂溶液，在紫外光下可觀察到熒光，這是黃酮類物質(zhì)特有的顯色反應(yīng)，可判斷提取物為黃酮類物質(zhì)。

2.2 甘草黃酮含量的測(cè)定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度的關(guān)系見表1。

表1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度的關(guān)系

Tab.1Correlation between the concentration ofrutin standard solution and absorbance

測(cè)定甘草黃酮樣品溶液吸光度為0.685，查得濃度為69.0 mg·L-1，經(jīng)計(jì)算提取物中甘草黃酮含量為86.50%。

2.3 電化學(xué)法測(cè)定葡萄糖濃度

葡萄糖的循環(huán)伏安曲線及響應(yīng)電流與葡萄糖濃度的線性曲線如圖1所示。

從圖1a可以看出，電極在氫氧化鈉溶液中沒有明顯的響應(yīng)電流，添加了葡萄糖溶液后，氧化峰電流急增，并且在電位0.6 V處出現(xiàn)明顯的葡萄糖氧化峰，循環(huán)伏安曲線證明了制備的電極對(duì)葡萄糖有良好的檢測(cè)效果。從圖1b可以看出，隨著葡萄糖濃度的增加，響應(yīng)電流也呈階梯式上升，且在一定的濃度范圍內(nèi)，響應(yīng)電流與葡萄糖濃度呈線性關(guān)系，線性方程為：y=139.1x+10，R2=0.9928。

2.4 葡萄糖苷酶抑制活性電化學(xué)篩選法的可靠性

采用臨床降糖藥α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖驗(yàn)證電化學(xué)篩選法的可靠性。電化學(xué)篩選法和碘量法測(cè)定阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率如表2所示。

圖1 葡萄糖的循環(huán)伏安曲線(a)及響應(yīng)電流與葡萄糖濃度的線性曲線(b)Fig.1 Cyclic voltammetry curve of glucose(a) and linear curve of current and glucose concentration(b)

表2阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率

Tab.2Inhibition rate of α-glucosaccharase by acarbose

從表2可以看出，2種方法測(cè)得的α-葡萄糖苷酶的抑制率比較接近，且在一定的濃度范圍內(nèi)，阿卡波糖濃度與抑制率呈正比。電化學(xué)篩選法和碘量法測(cè)得的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為42.2 mg·L-1和43.6 mg·L-1，表明阿卡波糖具有很強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，與臨床效果吻合，2種方法沒有顯著性差異。

2.5 電化學(xué)篩選法的抗干擾性研究

為驗(yàn)證葡萄糖苷酶抑制活性電化學(xué)篩選法的抗干擾性，加入酶抑制活性反應(yīng)體系可能的干擾物質(zhì)。分別往體系里添加反應(yīng)濃度的磷酸鹽緩沖溶液、淀粉、阿卡波糖、甘草黃酮、α-葡萄糖苷酶和葡萄糖溶液(5 mmol·L-1)，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，電極只對(duì)葡萄糖具有很強(qiáng)的響應(yīng)電流，而對(duì)干擾物沒有明顯的響應(yīng)。表明電化學(xué)篩選法具有良好的抗干擾能力。

2.6 甘草黃酮的葡萄糖苷酶抑制活性研究

采用電化學(xué)法研究甘草黃酮的葡萄糖苷酶抑制活性，結(jié)果見表3。

圖2 電化學(xué)篩選法的抗干擾性Fig.2 Anti-interference of electrochemical screening method

表3甘草黃酮的α-葡萄糖苷酶抑制率

Tab.3Inhibitionrateofα-glucosaccharasebylicoflavone

樣品甘草黃酮濃度/(mg·L-1)抑制率/%空白組--陰性對(duì)照組--陽(yáng)性對(duì)照組60.062.66樣品組160.045.20樣品組240.036.60樣品組320.023.65

由表3可以看出，甘草黃酮具有一定的葡萄糖苷酶抑制活性，且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。根據(jù)甘草黃酮濃度和抑制率的關(guān)系可以求出其對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50為67.6 mg·L-1，甘草黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制效果相當(dāng)于阿卡波糖的72%。

3 結(jié)論

采用超聲提取和堿溶酸沉法提取甘草黃酮，并測(cè)定其葡萄糖苷酶抑制活性，建立了中藥活性成分的提取分離、定性鑒定和含量測(cè)定以及其葡萄糖苷酶抑制活性篩選的系統(tǒng)方法。結(jié)果表明，酶抑制活性電化學(xué)篩選法具有良好的準(zhǔn)確性和選擇性，甘草黃酮具有較好的葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50為67.6 mg·L-1。該電化學(xué)篩選法操作簡(jiǎn)單方便，為中藥有效成分的葡萄糖苷酶抑制活性研究提供了一種新穎的研究方法。

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ExtractionandSeparationofLicoflavoneandItsInhibitoryActivityonGlucosaccharase

YANG Jian-ping，SU Ting-ting，ZHANG Han-jie，LIN Xiao-chun，LIU Xiao-yi,HUANG Hao，WANG Ya-li

(SchoolofChemistry，GuangdongUniversityofEducation，Guangzhou510303,China)

We extracted active constituent licoflavone fromRadixliquiritiaeusing ultrasonic extraction and alkali-soluble acid precipitation extraction methods.We qualitatively identified it by a chemical coloration method，and determined its content by spectrophotometry.Moreover,we established a new glucosaccharase inhibitor screening method based on an electrochemical amperometric method.And we demonstrated the reliability of electrochemical screening method by clinical hypoglycemic drug acarbose.The results show that the licoflavone has good glucosaccharase inhibitory activity and its IC50is 67.6 mg·L-1.The electrochemical screening method forα-glucosidase inhibition activity has high accuracy and anti-interference.This study provides a valuable reference for screening glucosaccharase inhibitor from Chinese tradition medicine.

licoflavone；glucosaccharase inhibitory activity；electrochemical method；enzyme inhibitor

廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目 (2015A030310202)，廣東省教育廳強(qiáng)校工程青年創(chuàng)新人才類項(xiàng)目(2014KQNCX230)，廣東第二師范學(xué)院博士專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(2013ARF04)，高等教育教學(xué)改革項(xiàng)目(2016ybzz08)，大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201714278005，201714278075)

2017-06-25

楊劍萍(1979-)，女，廣東開平人，博士，講師，研究方向：藥物分析與藥物篩選、分析化學(xué)新儀器新方法等，E-mail:yangjianping@gdei.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.004

楊劍萍，蘇婷婷，張韓潔，等.甘草黃酮的提取分離及其葡萄糖苷酶抑制活性研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(11)：15-18.

TQ461 R284.1

A

1672-5425(2017)11-0015-04