劉 棗，付相敏，潘海亮，王金華，王永澤*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068；2.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068)

玉米漿對大腸桿菌JH-B22發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的影響

劉 棗1，2，付相敏1，2，潘海亮1，2，王金華1，2，王永澤1，2*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068；2.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068)

為了進(jìn)一步降低L-丙氨酸的生產(chǎn)成本，以大腸桿菌JH-B22為發(fā)酵菌株，以玉米漿為氮源、葡萄糖結(jié)晶廢糖液為碳源進(jìn)行L-丙氨酸的發(fā)酵。結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿添加量為20 g·L-1較為適宜。在玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行L-丙氨酸的發(fā)酵，L-丙氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別為54.30 g·L-1和90.5%；其L-丙氨酸產(chǎn)量略低于無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基的 56.12 g·L-1和LB發(fā)酵培養(yǎng)基的56.48 g·L-1，但玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基具有配制更簡單、無需額外添加無機(jī)鹽或者成本較高的酵母粉等優(yōu)點(diǎn)，可作為L-丙氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的不錯(cuò)選擇。

玉米漿；大腸桿菌；L-丙氨酸

L-丙氨酸在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著十分重要的應(yīng)用價(jià)值。在食品領(lǐng)域，L-丙氨酸和谷氨酸鈉制成混合調(diào)味品，在保證食物原有風(fēng)格的條件下不改變食品的風(fēng)味，L-丙氨酸還是甜味劑阿力甜的合成前體。在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-丙氨酸不但可作為補(bǔ)糖氨基酸直接用作營養(yǎng)液，更是維生素B5、B6和L-氨基丙醇(氧氟沙星)的合成前體，還可用于制造抗癌藥4-羥基水楊醛丙氨酸合鋅[1-3]。

L-丙氨酸工業(yè)生產(chǎn)方法一般采用蛋白水解提取法、酶法和微生物發(fā)酵法[4]。微生物發(fā)酵法以其生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品純度高、對環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)受到了人們的普遍關(guān)注。工業(yè)上生產(chǎn)L-丙氨酸是借助德阿昆合假單胞菌(Pseudomonasdacunhae)的菌懸液，以 L-天冬氨酸為底物脫羧生產(chǎn)， L-天冬氨酸由富馬酸經(jīng)天冬氨酸酶催化合成，該工藝成本較高且有由二氧化碳排放引起的碳流失[5]。而通過富馬酸采用大腸桿菌工程菌直接生產(chǎn)L-丙氨酸，具有成本低的優(yōu)勢[1-2]，但有研究者認(rèn)為富馬酸是經(jīng)石油煉制生產(chǎn)，反應(yīng)底物屬于不可再生資源[6]。因此如何降低微生物發(fā)酵法合成L-丙氨酸的成本且保障原料來源的可再生性是目前相關(guān)研究的熱點(diǎn)。

借助基因工程的技術(shù)和手段，目前已有多個(gè)工程菌能直接利用各種易得碳源和氮源合成L-丙氨酸[6-8]。如能換用廉價(jià)的氮源或碳源進(jìn)行L-丙氨酸發(fā)酵，無疑對降低L-丙氨酸的生物合成成本有著積極的促進(jìn)作用。已有報(bào)道經(jīng)基因改造的大腸桿菌可利用甘油作為碳源發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸[6]。

為了進(jìn)一步降低L-丙氨酸的生產(chǎn)成本，擬從培養(yǎng)基入手降低發(fā)酵成本。玉米漿為玉米制淀粉過程中的副產(chǎn)物，含有豐富的可溶性蛋白、無機(jī)鹽和可溶性糖，可作為微生物發(fā)酵的廉價(jià)氮源,還能減少培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的添加，從而降低生產(chǎn)成本[9-10]，廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)中[11]。前期作者所在課題組利用玉米漿為主的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌工程菌生產(chǎn)L-乳酸，取得了不錯(cuò)的發(fā)酵效果[12]。因此，作者采用大腸桿菌JH-B22作為發(fā)酵菌株，以玉米漿為氮源、葡萄糖結(jié)晶廢糖液為碳源，取代葡萄糖和酵母粉為主的培養(yǎng)基生產(chǎn)L-丙氨酸，考察了發(fā)酵效果，擬為降低L-丙氨酸發(fā)酵成本提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

大腸桿菌JH-B22(ΔfrdBC，ΔadhE，Δpta，ΔldhA ΔpflB::alaD)，出發(fā)菌為大腸桿菌EscherichiacoliW (ATCC 9637)，經(jīng)基因工程手段構(gòu)建而成，于甘油管-20 ℃保存。

平板培養(yǎng)基(g·L-1)：酵母粉 5，蛋白胨 10，氯化鈉 5，葡萄糖 20，瓊脂 20。

搖瓶種子培養(yǎng)基(g·L-1)：酵母粉 5，蛋白胨 10，氯化鈉 5，葡萄糖 20。

無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：七水硫酸鎂 0.5，一水硫酸錳 0.05，磷酸二氫鉀 1.5，磷酸氫二鉀 3.6，氯化鈉5，酵母粉 2，葡萄糖 60。

玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：玉米漿 20，葡萄糖(來自葡萄糖結(jié)晶廢糖液)60。

LB發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：酵母粉 5，蛋白胨 10，氯化鈉 5，葡萄糖 20。

玉米漿(含氮1%)、葡萄糖結(jié)晶廢糖液，山東濰坊盛泰藥業(yè)有限公司。其它試劑均為市售分析純。

E2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司；5804R型離心機(jī)，德國Eppendorf公司；SBA-40D型生物傳感儀，山東科學(xué)院生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及種子培養(yǎng)

菌種活化：用滅菌后的竹簽從甘油管中蘸取菌液，劃線至平板培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h。連續(xù)活化2～3代。

種子培養(yǎng)：從活化好的平板培養(yǎng)基上挑取少量菌落，接入400 mL搖瓶種子培養(yǎng)基中，搖床37 ℃培養(yǎng)12 h。

1.2.2 玉米漿添加量對發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的影響

用不同濃度(10 g·L-1、20 g·L-1、30 g·L-1、40 g·L-1)玉米漿和葡萄糖結(jié)晶廢糖液(葡萄糖濃度60 g·L-1)，配制成培養(yǎng)基后滅菌,即得玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基。將搖瓶種子液(OD600為1.0～1.5)按10%接種量接種至裝有4 L不同發(fā)酵培養(yǎng)基的7 L發(fā)酵罐(Sartorius Stedim，Biotech Gmb H 37070)中。發(fā)酵條件設(shè)定為：溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速150 r·min-1，通氣量1 vvm，流加2 mol·L-1氫氧化鈉作為發(fā)酵中和劑控制發(fā)酵液pH值為6.0。每4 h取樣，檢測L-丙氨酸產(chǎn)量和葡萄糖含量，每批次發(fā)酵重復(fù)不少于3次。

1.2.3 玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基和其它發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的比較

將搖瓶種子液按10%接種量分別接種至裝有4 L無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基和LB發(fā)酵培養(yǎng)基的7 L發(fā)酵罐中，初始葡萄糖濃度均為60 g·L-1。發(fā)酵條件同1.2.2。每4 h取樣，檢測L-丙氨酸產(chǎn)量和葡萄糖含量，每批次發(fā)酵重復(fù)不少于3次。

1.2.4 檢測方法

(1)葡萄糖含量的測定

取適量樣品于10 000 r·min-1離心5 min，取上清液稀釋100倍，利用生物傳感儀測定葡萄糖含量。

(2)L-丙氨酸產(chǎn)量的測定

采用高效液相色譜儀測定。色譜條件：依力特C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，流動相為甲醇-磷酸氫二鈉混合液(pH值為6.5的0.05 mol·L-1磷酸氫二鈉與甲醇體積比1∶9)，流速0.8 mL·min-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積5 μL，檢測波長215 nm。

(3)甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸產(chǎn)量的檢測

采用高效液相色譜儀測定。色譜條件：有機(jī)酸柱AminexR HPX-87H ion exclusion column(300 mm×7.8 mm)，流動相為4 mmol·L-1H2SO4，流速0.5 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積5 μL，檢測波長210 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米漿添加量對發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的影響(圖1)

圖1 玉米漿添加量對發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的影響Fig.1 Effect of corn steep liquor dosage on L-alanineproduction by fermentation

從微生物培養(yǎng)的角度來看，玉米漿添加量不但影響整個(gè)培養(yǎng)基的碳氮比、比耗糖速率[13]，還會調(diào)整維生素和金屬離子含量來影響發(fā)酵[12]。從圖1可以看出，添加一定量的玉米漿作為氮源能提高L-丙氨酸的產(chǎn)量，不添加玉米漿時(shí)也有少量L-丙氨酸生成(小于3 g·L-1)，可能是由于種子液中殘余少量氮源至發(fā)酵液中。當(dāng)玉米漿添加量為20 g·L-1時(shí)，L-丙氨酸產(chǎn)量最高，達(dá)到54.23 g·L-1。玉米漿添加量超過20 g·L-1時(shí)，L-丙氨酸產(chǎn)量提高并不明顯。可能是由于，一方面，玉米漿添加過量，許多金屬離子濃度過高，影響大腸桿菌的生長及發(fā)酵；另一方面，氮源過量容易導(dǎo)致菌體提前衰老自溶，影響產(chǎn)量的提高。綜合考慮，玉米漿添加量為20 g·L-1較為適宜。

2.2 玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基和其它發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的比較

為了進(jìn)一步評估玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵能力，選用2種大腸桿菌發(fā)酵常見的無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基和LB發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照進(jìn)行比較，結(jié)果見圖2及表1。

圖2 3種發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的比較Fig.2 Comparison of L-alanine produced by threefermentation mediums

表13種發(fā)酵培養(yǎng)基對發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的影響

Tab.1Effect of three fermentation mediums on L-alanine production

從圖2可以看出，對于3種培養(yǎng)基，0～8 h時(shí)L-丙氨酸積累都很少，但8 h后，3種培養(yǎng)基的L-丙氨酸產(chǎn)量出現(xiàn)分化。發(fā)酵進(jìn)行到20 h時(shí)，采用LB發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，產(chǎn)量已達(dá)到最高，殘余葡萄糖含量基本趨于零；而采用玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基和無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)酵稍微緩慢，在36 h時(shí)發(fā)酵才結(jié)束。

由表1進(jìn)一步可知，在LB發(fā)酵培養(yǎng)基中L-丙氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別為56.48 g·L-1和94.1%，且發(fā)酵在20 h就基本結(jié)束，其它2種發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵36 h后才結(jié)束；在玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基中L-丙氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別為54.30 g·L-1和90.5%；在無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中L-丙氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別為56.12 g·L-1和93.5%。所有發(fā)酵培養(yǎng)基的副產(chǎn)物如琥珀酸和乙酸產(chǎn)量相差不大，但玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基中乳酸產(chǎn)量略高。

方差分析表明，玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸上，與無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基和LB發(fā)酵培養(yǎng)基差異并不顯著(Plt;0.05)。玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸相對于其它2種發(fā)酵培養(yǎng)基，無論是發(fā)酵產(chǎn)量和發(fā)酵時(shí)間均不占優(yōu)勢，與其它2種發(fā)酵培養(yǎng)基的組分相比，可能在蛋白的可利用性上存在一些差異。LB發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨是蛋白經(jīng)過水解消化的產(chǎn)物；而無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的少量酵母粉無疑在L-丙氨酸發(fā)酵上扮演了重要角色，不少研究也證明酵母粉作為氮源在產(chǎn)量提高上更有優(yōu)勢[14]。當(dāng)然玉米漿經(jīng)過蛋白酶處理，會增加其發(fā)酵上的效能[15]，但這樣無疑又增加了工序和成本。

玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸仍然具有一定優(yōu)勢：首先，玉米漿作為一種混合氮源，在和糖類一起高壓滅菌后，仍有不錯(cuò)的發(fā)酵產(chǎn)量。有文獻(xiàn)[16]認(rèn)為濾菌的方式更能保存玉米漿的營養(yǎng)成分，但從生產(chǎn)實(shí)踐來說，操作難度更大，本實(shí)驗(yàn)對玉米漿和碳源采用混合滅菌的方式，工藝相對簡單。其次，相對其它2種發(fā)酵培養(yǎng)基，沒有添加任何額外的無機(jī)鹽，表明玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基中原有的無機(jī)鹽組分能基本滿足發(fā)酵的需求。最后，完全不使用酵母粉進(jìn)行L-丙氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)，對于降低L-丙氨酸的發(fā)酵成本無疑有較大的幫助。

3 結(jié)論

為了進(jìn)一步降低L-丙氨酸的生產(chǎn)成本，以大腸桿菌JH-B22為發(fā)酵菌株，從培養(yǎng)基入手降低發(fā)酵成本，分別選用玉米生產(chǎn)淀粉副產(chǎn)物玉米漿和葡萄糖結(jié)晶廢糖液為氮源和碳源，發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸，并與2種大腸桿菌發(fā)酵常見的培養(yǎng)基——LB發(fā)酵培養(yǎng)基和無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸進(jìn)行對比。結(jié)果表明：(1)玉米漿最佳添加量為20 g·L-1，配以葡萄糖結(jié)晶廢糖液60 g·L-1，能在36 h結(jié)束發(fā)酵，L-丙氨酸產(chǎn)量可達(dá)54.30 g·L-1，糖酸轉(zhuǎn)化率為90.5%。(2)3種培養(yǎng)基中，LB發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸效果最好，L-丙氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別為56.48 g·L-1和94.1%，且發(fā)酵在20 h基本結(jié)束。無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別為56.12 g·L-1和93.5%，發(fā)酵在36 h基本結(jié)束。(3)相比無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基和LB發(fā)酵培養(yǎng)基，玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)L-丙氨酸產(chǎn)量只有微小差別，但仍然能在36 h內(nèi)完成發(fā)酵，且玉米漿培養(yǎng)基可直接和碳源一起滅菌，無需添加任何酵母粉和額外的無機(jī)鹽，在成本上也具有一定優(yōu)勢。因此玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基可作為L-丙氨酸發(fā)酵的不錯(cuò)選擇。

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EffectofCornSteepLiquoronL-AlanineFermentationbyEscherichiacoliJH-B22

LIU Zao1，2，F(xiàn)U Xiang-min1，2,PAN Hai-liang1，2，WANG Jin-hua1，2，WANG Yong-ze1，2*

(1.KeyLaboratoryofFermentationEngineeringofMinistryofEducation，HubeiUniversityofTechnology，Wuhan430068，China;2.HubeiCooperativeInnovationCenterforIndustrialFermentation，Wuhan430068，China)

In order to reduce the production cost of L-alanine,we usedEscherichiacoliJH-B22 as a fermentation strain,corn steep liquor as a nitrogen resource,and waste sugar liquid of glucose crystallization as a carbon resource to produce L-alanine by fermentation.Results showed that it was suitable to add 20 g·L-1corn steep liquor in fermentation medium.When using corn steep liquor fermentation medium，L-alanine yield and sugar-acid conversion rate would reach 54.30 g·L-1and 90.5%，respectively.Although L-alanine yield of corn steep liquor fermentation medium was less than that of mineral salts fermentation medium(56.12 g·L-1) and LB fermentation medium(56.48 g·L-1),corn steep liquor fermentation medium could be a good choice for L-alanine production because of easy preparation and unnecessary additional mineral salts or high cost yeast powder.

corn steep liquor；Escherichiacoli；L-alanine

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2011CDB076),湖北省教育廳科研基金項(xiàng)目(B20121402)

2017-06-27

劉棗(1980-)，女，湖北武漢人，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：發(fā)酵及檢測技術(shù)，E-mail：24825848@qq.com；通訊作者：王永澤，博士，副教授，E-mail:wyzzju@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.003

劉棗，付相敏，潘海亮，等.玉米漿對大腸桿菌JH-B22發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的影響[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(11)：11-14.

TQ922.2 Q815

A

1672-5425(2017)11-0011-04