劉 健， 郝倩云， 劉婉華， 刁振琦， 唐偉躍

(1.鄭州大學(xué) 信息工程學(xué)院 河南 鄭州 450001； 2.北京大學(xué) 人民醫(yī)院 北京 100045； 3.鄭州大學(xué) 物理工程學(xué)院 河南 鄭州 450001)

DOI: 10.13705/j.issn.1671-6841.2017208

不同金屬納米溶膠對(duì)小鼠血清表面增強(qiáng)拉曼光譜的增強(qiáng)效應(yīng)

劉 健1， 郝倩云2， 劉婉華3， 刁振琦3， 唐偉躍3

(1.鄭州大學(xué) 信息工程學(xué)院 河南 鄭州 450001； 2.北京大學(xué) 人民醫(yī)院 北京 100045； 3.鄭州大學(xué) 物理工程學(xué)院 河南 鄭州 450001)

以金納米溶膠、銀納米溶膠和金-銀合金納米溶膠為基底測(cè)定了小鼠血清表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS).觀察了血清蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主鏈、側(cè)鏈和二級(jí)結(jié)構(gòu)的振動(dòng)峰(958、1 003、1 015、1 146、1 352 cm-1)，以及血清中少量碳水化合物D-甘露醇和脂類的特征峰(527、1 469 cm-1)，并比較了3種金屬溶膠基底的SERS增強(qiáng)效應(yīng).結(jié)果表明，以金-銀合金納米溶膠為基底的SERS譜峰都得到增強(qiáng)，特別是527、958、1 003、1 146、1 352、1 469 cm-1處信號(hào)加強(qiáng)明顯.以銀納米溶膠為基底的SERS中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的振動(dòng)峰也有一定的增強(qiáng)，但是在527 cm-1處只有一小峰，未見(jiàn)1 469 cm-1峰.以金納米溶膠為基底的SERS中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的振動(dòng)峰也有所加強(qiáng)，但527、1 469、1 547 cm-1峰消失.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金-銀合金納米溶膠的SERS活性最強(qiáng)，銀納米溶膠其次，金納米溶膠最差.

金屬納米溶膠； 表面增強(qiáng)拉曼光譜； 血清； 小鼠

DOI: 10.13705/j.issn.1671-6841.2017208

0 引言

表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)表征的是分子振動(dòng)的信息，是以金屬粗糙表面或金屬納米粒子作為基底對(duì)分子進(jìn)行檢測(cè)的一種光譜測(cè)量技術(shù)，在生物體系測(cè)量中能反映核酸、蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子的結(jié)構(gòu)信息.SERS技術(shù)能使拉曼信號(hào)增強(qiáng)若干個(gè)數(shù)量級(jí)，并能在一定程度上減弱熒光背景, 所以非常適合對(duì)熒光背景很強(qiáng)的生物體系的檢測(cè).近幾年SERS技術(shù)在檢測(cè)腫瘤血清方面得到初步發(fā)展，利用SERS技術(shù)能夠檢測(cè)腫瘤血清中分子結(jié)構(gòu)、構(gòu)象的微小變化.因此，根據(jù)血清拉曼光譜的改變可以對(duì)惡性腫瘤進(jìn)行早期篩查.

在血清SERS研究中，要獲得高信噪比的SERS信號(hào)，對(duì)活性基底的研究至關(guān)重要.增強(qiáng)基底不同，對(duì)相同樣品的SERS增強(qiáng)效果不同.基底的表面形貌、血清分子與納米粒子的結(jié)合方式都會(huì)影響基底的活性[1-3].在所有的SERS活性基底中，金屬溶膠制備簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性高，具有很高的SERS增強(qiáng)因子.因此，本文以金納米溶膠、銀納米溶膠和金-銀合金納米溶膠作為血清SERS的增強(qiáng)基底，研究了不同金屬納米溶膠對(duì)血清SERS的增強(qiáng)效應(yīng)，以期尋找到適合血清SERS檢測(cè)的高活性增強(qiáng)基底，研究結(jié)果將對(duì)利用血清SERS早期診斷惡性腫瘤具有重要的意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)所用氯金酸、硝酸銀、枸櫞酸鈉均為分析純，購(gòu)于上海化學(xué)試劑有限公司.實(shí)驗(yàn)用水均為三次去離子水.硝酸銀溶液置于暗處，氯金酸溶液置于冰箱冷藏.

紫外分光光度計(jì)(Hitachi UV-3900)；透射電子顯微鏡(Hitachi H-600)；拉曼共焦顯微拉曼儀(法國(guó) HORIBA Jobin Yvon，LabRAM HR Evolution), 激發(fā)光源為氦-氖離子激光器，激發(fā)光波長(zhǎng)為632.8 nm, 光譜分辨率≤0.4 cm-1，到達(dá)樣品表面功率約為2 mW；電磁加熱攪拌器(上海司樂(lè)儀器有限公司，B11-2)；電子天平(艾德姆衡器有限公司，PGC753e).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1金屬納米溶膠的制備 銀納米溶膠的制備采用文獻(xiàn)[4]的方法，用枸櫞酸鈉還原硝酸銀溶液得到.具體步驟如下：將裝有200 mL質(zhì)量濃度為1×10-4g/mL的硝酸銀溶液的燒杯放置到微波爐中加熱至沸騰, 取出后緩慢滴入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的枸櫞酸鈉溶液, 并伴隨劇烈地磁力攪拌，加熱攪拌60 min后，停止加熱，攪拌冷卻至室溫，得到銀納米溶膠.

金納米溶膠的制備采用文獻(xiàn)[5]的方法，用枸櫞酸鈉還原氯金酸溶液得到.具體步驟如下：將裝有100 mL質(zhì)量濃度為5×10-4g/mL的氯金酸溶液的燒杯放置到微波爐中加熱至沸騰，將2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的枸櫞酸鈉溶液緩慢加入到沸騰的氯金酸溶液中，然后放在磁力攪拌器上繼續(xù)加熱攪拌40 min后，停止加熱，使其自然冷卻至室溫，得到金納米溶膠，放入4 ℃的冰箱里備用.

金-銀合金納米溶膠的制備采用文獻(xiàn)[6]的方法，以枸櫞酸鈉為還原劑，將氯金酸和硝酸銀的混合溶液與枸櫞酸鈉反應(yīng)制成金-銀合金納米溶膠.具體步驟如下：將總濃度為0.5 mmol/L的硝酸銀和氯金酸混合溶液100 mL(通過(guò)改變加入硝酸銀和氯金酸溶液的體積比控制金的摩爾分?jǐn)?shù)分別為0.5和0.7)在微波爐中加熱至沸騰, 然后加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的枸櫞酸鈉溶液，放在磁力攪拌器上保持沸騰60 min后攪拌至室溫，得到的金-銀合金納米溶膠.

1.2.2小鼠血清的制備 在麻醉狀態(tài)下抽取活體小鼠血液，不加抗凝劑，靜置1 h后，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min去除紅細(xì)胞，取淡黃色上清液得到小鼠血清.

1.2.3拉曼光譜的測(cè)量 將制備的金屬溶膠與樣品血清按體積比1∶1等量混合后放在樣品池中, 激發(fā)光源為氦-氖激光器，波長(zhǎng)為632.8 nm, 曝光時(shí)間10 s, 累加次數(shù)3次，采用180°背散射接收方式，400～1 800 cm-1范圍內(nèi)掃描.

2 結(jié)果與討論

2.1 金屬納米溶膠的表征

SERS是基于金屬納米粒子的表面等離子體共振現(xiàn)象, 在納米級(jí)尺度上粒子粗糙表面的電磁場(chǎng)會(huì)得到極大增強(qiáng).在SERS中，納米粒子的形貌、尺寸大小和組成決定著納米粒子的光學(xué)特性和SERS增強(qiáng)效應(yīng).

a：銀納米溶膠； b：金-銀合金(金0.5)納米溶膠； c：金-銀合金(金0.7)納米溶膠； d：金納米溶膠圖1 金屬納米溶膠的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig．1 UV-Vis absorption spectra of metal nano sols

2.1.1紫外光譜表征 圖1為金屬納米溶膠的紫外-可見(jiàn)吸收光譜.根據(jù)紫外-可見(jiàn)吸收光譜的表面等離子體吸收峰(SPR)的位置和形狀，可以判斷納米粒子的形狀和粒徑分布[7].從圖1中可以看出，銀納米溶膠的吸收峰在390 nm，吸收峰向長(zhǎng)波方向展寬，表明銀納米粒子尺寸分布較寬，溶液中有不規(guī)則的粒子存在.金納米溶膠紫外吸收光譜在520 nm處有1個(gè)吸收峰, 峰的寬度較寬，表明制得的金納米顆粒的粒徑不均勻.金-銀合金納米溶膠的紫外吸收光譜只有1個(gè)吸收峰，位于金納米溶膠和銀納米溶膠的最大吸收峰之間，2種由不同金銀比例制備的合金納米粒子的SPR分別在480、502 nm處，表明合金納米粒子的SPR具有可調(diào)性，隨著金所占比例的增加，金-銀合金納米溶膠的離子共振吸收峰發(fā)生紅移.因?yàn)楹辖鸺{米粒子的SPR具有可調(diào)性，所以可以通過(guò)調(diào)整金含量的比例改變SPR的頻率，實(shí)現(xiàn)與不同頻率激發(fā)光的耦合.

2.1.2透射電鏡表征 圖2為金屬納米溶膠的透射電鏡(TEM)圖.TEM結(jié)果顯示，銀納米粒子(圖2a)的形狀基本呈球形，有少量的棒狀顆粒，粒徑相差較大，出現(xiàn)直徑為20～60 nm的不同粒徑大小的顆粒.金-銀合金納米粒子(圖2b和圖2c)基本是球形結(jié)構(gòu)，粒徑約為40 nm，粒子大小比較均勻、分散性好，粒子之間存在著能增強(qiáng)SERS效應(yīng)的“熱點(diǎn)”.金納米粒子(圖2d)呈球形，粒徑20 nm左右，粒子大小不均勻、分散性不好，出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，并且粒子之間缺少能提高SERS強(qiáng)度的“熱點(diǎn)”，影響其SERS的增強(qiáng)效應(yīng).

a: 銀納米溶膠； b:金-銀合金(金0.5)納米溶膠； c:金-銀合金(金0.7)納米溶膠； d:金納米溶膠圖2 金屬納米溶膠的透射電鏡圖Fig．2 TEM images of metal nano sols

a: 金-銀合金(金0.5)納米溶膠； b: 銀納米溶膠； c: 金納米溶膠； d:無(wú)基底圖3 小鼠血清的普通拉曼光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜Fig．3 Normal Raman spectra and surface-enhanced Raman spectra of mice serum

2.2金屬納米溶膠對(duì)小鼠血清SERS增強(qiáng)效應(yīng)的比較

所用的3種金屬溶膠中，金納米溶膠具有很好的生物兼容性，銀納米溶膠具有很高的穩(wěn)定性，兩種溶膠是SERS中常見(jiàn)的基底.金-銀合金納米溶膠的SPR有可調(diào)性，具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，是近些年備受關(guān)注的基底.因?yàn)樾∈笈c人類有很多相近的基因，本實(shí)驗(yàn)采用正常小鼠的血清作為生物樣品, 以金納米膠、銀納米膠和金-銀合金(金0.5)納米溶膠為基底，測(cè)得小鼠血清的SERS，比較3種金屬納米溶膠對(duì)血清SERS的增強(qiáng)效果.圖3為小鼠血清的普通拉曼光譜和3種金屬溶膠基底血清的SERS.

小鼠血清的SERS是由白蛋白和各類球蛋白質(zhì)分子中肽鍵引起不同類型的特征振動(dòng)、主鏈骨架C—C和C—N振動(dòng)和側(cè)鏈構(gòu)象的振動(dòng)，以及蛋白質(zhì)空間二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α螺旋、β折疊和酰胺Ⅰ-Ⅶ等組成[8].從譜峰指認(rèn)可知，621、1 015、 1 146 cm-1是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)主鏈骨架的振動(dòng)峰.1 224、1 315、1 687 cm-1歸屬于血清蛋白酰胺鍵，屬于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu).1 003、1 636 cm-1是蛋白質(zhì)的側(cè)鏈苯丙氨酸的單基取代苯基環(huán)的貢獻(xiàn)，在光譜中屬于強(qiáng)峰.652、958、1 352、1 547 cm-1是酪氨酸和色氨酸的特征峰.在小鼠血清SERS中還包括少量糖類和脂類，其中527 cm-1是碳水化合物D-甘露醇的特征峰，1 469 cm-1屬于脂類特征峰.

從圖3可以看出，以金-銀合金納米溶膠(圖3a)為基底的SERS譜峰在527、958、1 003、1 146、1 352、1 469 cm-1處信號(hào)增強(qiáng)明顯，表明以金-銀合金納米溶膠為基底測(cè)得的血清SERS，不僅能夠較準(zhǔn)確地反映血清中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，還能夠獲得血清中含量非常低的糖和脂類的信息.以銀納米溶膠(圖3b)為基底的SERS譜峰也有一定的增強(qiáng)，958、1 003、1 146、1 352、1 636 cm-1譜峰較強(qiáng)，但是在527 cm-1處只有一小峰，未見(jiàn)1 469 cm-1峰，說(shuō)明以銀納米溶膠為基底的SERS可以用于血清蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主鏈、側(cè)鏈和二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，但是對(duì)脂類和糖的測(cè)定效果較差.以金納米溶膠(圖3c)為基底的SERS譜峰也得到增強(qiáng)，但增強(qiáng)幅度較小.在1 003、1 146、1 352、1 636 cm-1處信號(hào)得到加強(qiáng)，但在1 224、1 315、1 687 cm-1處峰強(qiáng)較弱， 527、1 469、1 547 cm-1峰消失，表明金納米溶膠的SERS活性比銀納米溶膠差，可能是銀納米溶膠在可見(jiàn)光范圍表面增強(qiáng)因子好于金納米溶膠的緣故.

圖3顯示所有金屬納米溶膠對(duì)血清SERS均有增強(qiáng)，但增強(qiáng)效果不同.金納米溶膠對(duì)血清SERS的增強(qiáng)效果較弱，這是由于金納米顆粒粒徑較小，無(wú)法吸附血清分子而形成良好的單分子吸附層，所以產(chǎn)生的表面等離子體共振效應(yīng)也較弱[1]，此外，可能是由于金納米粒子不均勻，出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，影響SERS增強(qiáng)效果.銀納米溶膠對(duì)血清的增強(qiáng)效果比金納米溶膠強(qiáng)，可能是由于激發(fā)光波長(zhǎng)對(duì)銀納米溶膠比金納米溶膠靈敏[2].金-銀合金納米溶膠對(duì)血清SERS的增強(qiáng)效果好于銀納米溶膠，主要峰都得到增強(qiáng)，這是因?yàn)榻?銀合金納米溶膠粒徑適中，血清分子吸附在其上能夠形成較好的單分子吸附層，從而形成強(qiáng)烈的表面等離子共振.而銀納米顆粒粒徑較大，雖然理論上能夠吸附更多的血清分子，但同時(shí)粒子間斥力也會(huì)增大[3]，所以表面等離子體共振效應(yīng)比金-銀合金納米溶膠弱.金-銀合金納米溶膠既有金納米溶膠生物兼容性好的特點(diǎn)，又有銀納米溶膠高穩(wěn)定性的特點(diǎn)，從而使SERS得到最大的增強(qiáng).因此，金-銀合金納米溶膠是檢測(cè)小鼠血清比較理想的基底.

3 結(jié)論

比較了金納米溶膠、銀納米溶膠和金-銀合金納米溶膠對(duì)小鼠血清SERS的活性，結(jié)果表明，3種金屬溶膠都具有一定的SERS增強(qiáng)效應(yīng).從透射電鏡圖可以看出，金-銀合金納米溶膠為球形結(jié)構(gòu)，粒徑約為40 nm，粒子大小均勻，存在能提高SERS強(qiáng)度的“熱點(diǎn)”，極大地增強(qiáng)了合金納米粒子的局域電磁場(chǎng)強(qiáng)度，SERS強(qiáng)度得到提高.銀納米溶膠的粒子大小約為50 nm，粒徑分布不是很理想，納米粒子之間的距離大于2 nm，所以能增強(qiáng)SERS光譜的“熱點(diǎn)”不多.金納米溶膠粒徑在20 nm左右，有團(tuán)聚現(xiàn)象出現(xiàn)，影響其SERS增強(qiáng)效應(yīng).以金-銀納米溶膠為基底測(cè)得的血清SERS，能夠較準(zhǔn)確地反映血清分子的微觀結(jié)構(gòu).以銀納米溶膠為基底的血清SERS光譜可以用于血清蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主鏈、側(cè)鏈和二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，但是對(duì)脂類和糖的測(cè)定效果較差.以金納米溶膠為基底的血清SERS峰強(qiáng)相對(duì)較弱，而且沒(méi)有檢測(cè)到脂類和糖.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金-銀合金納米溶膠的SERS活性最強(qiáng)，銀納米溶膠其次，金納米溶膠最差.

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(責(zé)任編輯：孔 薇)

TheEnhancementEffectsinSurface-enhancedRamanSpectroscopyofMiceSerumwithDifferentMetalNanoSols

LIU Jian1, HAO Qianyun2, LIU Wanhua3, DIAO Zhengqi3, TANG Weiyue3

(1.SchoolofInformationEngineering，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.People’sHospital,PekingUniversity，Beijing100045,China; 3.SchoolofPhysicalEngineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

The surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) in mice serum was determined with the gold, silver and Au-Ag alloy nano sol as substrates. The characteristic peaks at 958,1 003,1 015,1 146,1 352 cm-1which assigned to the main chain, side chain and secondary structure of serum protein were observed. And the vibrating peaks observed at 527, 1 469 cm-1were the characteristic peaks of small amount of carbohydrate D-mannitol and lipid in serum. Moreover, the SERS enhancement effects of three kinds of metal sol substrate were compared. The results indicated that SERS peaks were enhanced by using Au-Ag alloy nano sol as substrate. Especially,the characteristic peaks were enhanced significantly at 527,958,1 003,1 146,1 352, 1 469 cm-1.When using silver nano sol as substrate, the SERS characteristic peaks of protein structure had certain enhancement. But merely there was a small peak at 527 cm-1, the peak of 1 469 cm-1was invisible. When using gold nano sol as substrate, the characteristic peaks of protein structure were also strengthened, but the peaks at 527,1 469, 1 547 cm-1were disappeared. The results showed that the SERS activity of Au-Ag alloy nano sol was the strongest, silver nano sol was moderate, and gold nano sol was the weakest.

metal nano sol; surface-enhanced Raman spectroscopy; serum; mice

2017-07-10

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(152300410029)；河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(162102210009).

劉健(1968—)，男，河南鄭州人，講師，主要從事拉曼光譜在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用研究, E-mail: zzdxlwh@126.com.

O657.3

A

1671-6841(2017)04-0057-04