魏子龍 狄沖 樓美清 趙耀東

·基礎(chǔ)研究·

五味子甲素通過ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子B1逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞耐藥性研究

魏子龍 狄沖 樓美清 趙耀東

目的探討五味子甲素對(duì)膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞耐藥性的影響及作用機(jī)制。方法自人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG?44中分離培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞SHG?44s，予五味子甲素0、12.50、25.00和50.00 μmol/L 聯(lián)合長(zhǎng)春新堿400、800和1200 nmol/L，細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒CCK?8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SHG?44s細(xì)胞增殖活性，羅丹明123染色檢測(cè)SHG?44s細(xì)胞泵出藥物能力，實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和Western blotting法檢測(cè)SHG?44s細(xì)胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子B1（ABCB1）基因轉(zhuǎn)錄和翻譯能力。結(jié)果五味子甲素50 μmol/L即可抑制SHG?44s細(xì)胞增殖活性（P=0.001，0.001，0.039），剔除這一濃度后無論長(zhǎng)春新堿濃度為400、800或1200 nmol/L，聯(lián)合應(yīng)用五味子甲素均可抑制SHG?44s細(xì)胞增殖活性（長(zhǎng)春新堿400 nmol/L組：P=0.007，0.001；長(zhǎng)春新堿800 nmol/L組：P=0.001，0.000；長(zhǎng)春新堿1200 nmol/L組：P=0.000，0.000）。倒置熒光顯微鏡觀察，五味子甲素12.50 μmol/L組和25.00 μmol/L組SHG?44s細(xì)胞可見明顯綠色熒光。流式細(xì)胞術(shù)顯示，隨著五味子甲素濃度的增加，SHG?44s細(xì)胞羅丹明123染色陽性細(xì)胞比例分別為10.40%、39.20%和45.20%。實(shí)時(shí)PCR法顯示，五味子甲素12.50 μmol/L組和25.00 μmol/L組SHG?44s細(xì)胞ABCB1基因表達(dá)水平較 0 μmol/L組降低（P=0.027，0.006），尤以 25.00 μmol/L組顯著（P=0.034）。Western blotting法顯示，隨著五味子甲素濃度的增加，SHG?44s細(xì)胞P?糖蛋白表達(dá)水平下降。結(jié)論五味子甲素通過抑制膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞表面已存在的ABCB1基因編碼的P?糖蛋白泵出藥物能力并降低ABCB1基因轉(zhuǎn)錄和翻譯能力，逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞耐藥性。

五味子素； ATP結(jié)合匣式轉(zhuǎn)運(yùn)子； 神經(jīng)膠質(zhì)瘤； 腫瘤干細(xì)胞； 藥物耐受性； 顯微鏡檢查，熒光； 流式細(xì)胞術(shù)； 聚合酶鏈反應(yīng)； 免疫印跡法； 腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)的

膠質(zhì)瘤是臨床最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤（約占50%），患者預(yù)后較差。盡管隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，膠質(zhì)瘤診斷與治療技術(shù)有較大提高，但近20年患者預(yù)后并未獲得顯著改善，成為困擾臨床醫(yī)師的難題。近年來，癌癥干細(xì)胞（CSCs）假說的提出和膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞（GSPCs）的發(fā)現(xiàn)，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的切入點(diǎn)［1］。研究證實(shí)癌癥干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2］。五味子甲素是從五味子果實(shí)中分離出來的具有生物活性的木脂素。國(guó)內(nèi)多項(xiàng)研究顯示，五味子粗提取物及其有效成分五味子甲素具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞［3］特別是結(jié)腸癌細(xì)胞［4］和乳腺癌細(xì)胞［5］耐藥性的作用。但是對(duì)于五味子甲素能否逆轉(zhuǎn)癌癥干細(xì)胞特別是膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞耐藥性及其作用機(jī)制尚不清楚。本研究以膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞系SHG?44s為研究對(duì)象，采用細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒（CCK?8）細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、羅丹明123（Rhodamine 123）熒光染色、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反 應(yīng)（real time?PCR）和 免 疫 印 跡 法（Western blotting），探討五味子甲素對(duì)膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞耐藥性的影響及其作用機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.細(xì)胞系來源 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG?44購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，來源于1例32歲女性額葉星形細(xì)胞瘤（WHOⅡ～Ⅲ級(jí)）患者，經(jīng)分離、體外培養(yǎng)、鑒定和擴(kuò)增，傳代129代。

2.試劑與儀器 （1）主要試劑：五味子甲素和長(zhǎng)春新堿購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。羅丹明123（20 μg/ml）由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供。DMEM/F12無血清培養(yǎng)基（體積比1∶1）、B27培養(yǎng)基添加劑和堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，20 ng/ml）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。表皮生長(zhǎng)因子（EGF，20 ng/ml）由美國(guó)Invitrogen公司提供。免疫試劑Ⅰ抗工作液中兔抗人CD133單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司，小鼠抗人巢蛋白（Nes）單克隆抗體、兔抗人ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子B1（ABCB1）單克隆抗體和小鼠抗人β?肌動(dòng)蛋白（β?actin）單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；工作濃度均為1∶1000。山羊抗兔熒光Ⅱ抗和山羊抗小鼠熒光Ⅱ抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，3H?吲哚菁染料Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgGⅡ抗購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司，異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgGⅡ抗購(gòu)自美國(guó)Miltenyi Biotec公司，工作濃度均為1∶2500。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。CCK?8試劑盒由日本Dojindo化學(xué)研究所提供。（2）主要儀器：TCS SP2激光掃描共聚焦顯微鏡為德國(guó)Leica公司產(chǎn)品。XDS?220C型倒置相差顯微鏡購(gòu)自上海蔡康光學(xué)儀器有限公司。Nikon ECLIPSE TE2000?U型倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。多功能酶標(biāo)儀由美國(guó)BioTek公司提供。FCASCalibur流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。Odyssey紅外雙色激光成像系統(tǒng)由美國(guó)LI?COR公司提供。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞分離與培養(yǎng) 將SHG?44細(xì)胞置于37℃、含5%二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基，細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶底部表面大部分（＞80%）時(shí)，胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)［6］方法，將SHG?44細(xì)胞置于干細(xì)胞培養(yǎng)基［含DMEM/F12無血清培養(yǎng)基（體積比1∶1）、B27培養(yǎng)基添加劑（體積比1∶50）、20 ng/ml堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子和20 ng/ml表皮生長(zhǎng)因子］中培養(yǎng)，以CD133免疫磁珠分離克隆出膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞SHG?44s，并經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)鑒定。將SHG?44s細(xì)胞置于37℃、含5%二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為干細(xì)胞培養(yǎng)基。每3天半量換液1次，7～10 d傳代1次，于倒置相差顯微鏡下觀察SHG?44s細(xì)胞形態(tài)，傳代33代。

2.CCK?8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SHG?44s細(xì)胞增殖活性 當(dāng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中SHG?44s細(xì)胞球生長(zhǎng)至約100個(gè)細(xì)胞時(shí)（通常4～5 d），以離心半徑5.50 cm、1000 r/min離心5 min，棄上清，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吸管反復(fù)吹打，制備單細(xì)胞懸液。分別予不同濃度五味子甲素（0、12.50、25.00和50.00 μmol/L共4組），以細(xì)胞密度為2×103/100 μl接種于96孔培養(yǎng)板，每組3孔。培養(yǎng)72 h后每孔加入10 μl CCK?8試劑，37℃恒溫3 h，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值（OD值）。然后將不同濃度五味子甲素組（0、12.50和25.00 μmol/L共3組）進(jìn)一步分為3個(gè)亞組，每亞組各1孔，分別予以不同濃度長(zhǎng)春新堿（400、800和1200 nmol/L），共培養(yǎng)72 h，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，代表腫瘤細(xì)胞增殖活性。每孔重復(fù)3次，取平均值。

3.羅丹明123熒光染色檢測(cè)SHG?44s細(xì)胞泵出藥物能力 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHG?44s細(xì)胞制備成100×103/ml的細(xì)胞懸液，以細(xì)胞密度為200×103/2 ml接種于6孔板，分別予以不同濃度五味子甲素（0、12.50和 25.00 μmol/L），培養(yǎng) 48 h，以離心半徑5.50 cm、2000 r/min離心5 min，棄上清液，收集沉淀細(xì)胞，吸管反復(fù)吹打，制備單細(xì)胞懸液。以4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌（×3次），加入40 μg羅丹明123，于37℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌（×2次），流式細(xì)胞儀（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm）計(jì)數(shù)SHG?44s細(xì)胞中熒光染色陽性細(xì)胞比例，倒置熒光顯微鏡觀察SHG?44s細(xì)胞熒光強(qiáng)度。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

4.實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)ABCB1基因表達(dá)變化 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHG?44s細(xì)胞提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），ABCB1基 因 上 游 引 物（P1）序 列 ：5'?AAGGCCTAATGCCGAACACA?3'、下游引物（P2）序列：5'?GTCTGGCCCTTCTTCACCTC?3'，內(nèi)參照物甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物序列：5'?ACGGATTTGGTCGTATTGGG?3'、下游引物序列：5'?CGCTCCTGGAAGATGGTGAT?3'。PCR 擴(kuò)增條件：95℃ 10 min；SYBR GreenⅠ熒光染色反應(yīng)95℃15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析反應(yīng)95℃ 15 s，60℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，37 ℃15 min，85℃ 5 s。繪制實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增和溶解曲線，計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量2-△△Ct，代表ABCB1基因表達(dá)水平。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

5.Western blotting法檢測(cè)P?糖蛋白表達(dá)變化

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHG?44s細(xì)胞制備成100×103/ml的細(xì)胞懸液，以細(xì)胞密度為200×103/2 ml接種于6孔板，分別予不同濃度五味子甲素（0、12.50和 25.00 μmol/L），培養(yǎng) 48 h，以離心半徑 5.50 cm、2000 r/min離心5 min，棄上清液，收集沉淀細(xì)胞，向細(xì)胞沉淀中加預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）的細(xì)胞裂解液RIPA，0℃冰浴5～10 min，冰上超聲2 min，以12 000×g離心10 min，收集上清液，即為P?糖蛋白（P?gp）。目標(biāo)蛋白行十二烷基磺酸鈉?聚苯稀酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE），濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，滴加兔抗人ABCB1單克隆抗體（1∶1000）1 ml，4℃孵育過夜，TBST洗膜（×3次），滴加山羊抗兔 IgGⅡ抗（1∶2500）2 ml，孵育 1 h，TBST洗膜（×3次），電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色，Odyssey紅外雙色激光成像系統(tǒng)檢測(cè)目標(biāo)蛋白電泳條帶。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

6.統(tǒng)計(jì)分析方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較行SNK?q檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不同濃度五味子甲素組SHG?44s細(xì)胞增殖活性的比較（x± s，OD450nm）Table 1. Comparison of proliferative activity of SHG?44s cells among different concentrations of schizandrin A(x±s,OD450nm)

表2 不同濃度五味子甲素組SHG?44s細(xì)胞增殖活性的兩兩比較Table 2. Paired comparison of proliferative activity of SHG ?44s cells among different concentrations of schizandrin A

表3 不同濃度五味子甲素聯(lián)合長(zhǎng)春新堿亞組SHG?44s細(xì)胞增殖活性的比較（x±s，OD450nm）Table 3. Comparison of proliferative activity of SHG?44s cells among different concentrations of schizandrin A and vincristine(x±s,OD450nm)

表4 不同濃度五味子甲素聯(lián)合長(zhǎng)春新堿亞組SHG?44s細(xì)胞增殖活性的兩兩比較Table 4. Paired comparison of proliferative activity of SHG?44s cells among different concentrations of schizandrin A combining with vincristine

結(jié) 果

一、膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞增殖活性

以含不同濃度五味子甲素的干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)SHG?44s細(xì)胞，結(jié)果顯示，五味子甲素50 μmol/L即可抑制SHG?44s細(xì)胞增殖活性（P=0.001，0.001，0.039；表1，2）。因此，后續(xù)的研究剔除五味子甲素50 μmol/L組，以排除自身毒性作用。將不同濃度五味子甲素（0、12.50和 25.00 μ mol/L）和長(zhǎng)春新堿（400、800和 1200 nmol/L）共同作用于 SHG?44s細(xì)胞，結(jié)果顯示，無論長(zhǎng)春新堿濃度為400、800或1200 nmol/L，聯(lián)合五味子甲素均可以抑制SHG?44s細(xì)胞增殖活性（長(zhǎng)春新堿400 nmol/L組：P=0.007，0.001；長(zhǎng)春新堿 800 nmol/L 組：P=0.001，0.000；長(zhǎng)春新堿1200 nmol/L組：P=0.000，0.000；表3，4）。

二、膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞泵出藥物能力

羅丹明123是一種能夠穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞內(nèi)蓄積的熒光染料，其熒光強(qiáng)度可以反映腫瘤細(xì)胞經(jīng)藥泵蛋白泵出藥物能力。倒置熒光顯微鏡觀察顯示，五味子甲素0 μmol/L組SHG?44s細(xì)胞罕見綠色熒光，五味子甲素12.50 μmol/L組和25.00 μmol/L組SHG?44s細(xì)胞可見明顯綠色熒光（圖1a～1c）。流式細(xì)胞術(shù)顯示，五味子甲素 0 μmol/L 組、12.50 μmol/L組和25.00 μmol/L組SHG?44s細(xì)胞羅丹明 123染色陽性細(xì)胞比例逐漸增加，分別為10.40%、39.20%和45.20%（圖2a～2c）。

三、膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞ABCB1基因轉(zhuǎn)錄和翻譯能力

實(shí)時(shí)PCR法顯示，與五味子甲素0 μmol/L組相比，五味子甲素 12.50 μmol/L 組和 25.00 μmol/L 組SHG?44s細(xì)胞ABCB1基因表達(dá)水平降低（P=0.027，0.006），尤以五味子甲素 25.00 μmol/L組顯著（P=0.034），表明隨著五味子甲素濃度的增加，對(duì)ABCB1基因的抑制作用逐漸增強(qiáng)（表5，6）。Western blotting法顯示，隨著五味子甲素濃度的增加（0、12.50和 25.00 μmol/L），SHG?44s細(xì)胞 P?糖蛋白表達(dá)水平逐漸降低（圖3）。

圖1 倒置熒光顯微鏡觀察所見 羅丹明123染色 ×100 1a 五味子甲素0 μmol/L組SHG?44s細(xì)胞罕見綠色熒光 1b 五味子甲素12.50 μmol/L組SHG?44s細(xì)胞可見綠色熒光 1c 五味子甲素25.00 μmol/L組SHG?44s細(xì)胞可見明顯綠色熒光Figure 1 Inverted fluorescence microscopy findings Rhodamine 123 staining ×100 SHG?44s cells rarely showed green fluorescence in schizandrin A 0 μ mol/L group (Panel 1a). SHG ?44s cells showed green fluorescence in schizandrin A 12.50 μ mol/L group(Panel 1b).SHG?44s cells showed obvious green fluorescence in schizandrin A 25.00 μmol/L group(Panel 1c).

討 論

膠質(zhì)瘤是臨床常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的50%，預(yù)后較差。隨著癌癥干細(xì)胞理論的提出和研究的深入，目前認(rèn)為癌癥干細(xì)胞是惡性腫瘤復(fù)發(fā)的根源，其中重要特征是放射治療耐受性和多藥耐藥性（MDR）［2］。多藥耐藥性系指細(xì)胞對(duì)作用不同的藥物具有抗藥性現(xiàn)象。導(dǎo)致癌癥干細(xì)胞多藥耐藥性的原因有多種，除因其常處于G0期外，還與ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高表達(dá)以及凋亡和自噬減弱等機(jī)制有關(guān)［7?10］。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是跨膜蛋白，是介導(dǎo)多藥耐藥性家族的重要一員，通過ATP釋放的能量將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，避免細(xì)胞毒性作用［11］。目前與多藥耐藥性有關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包括乳腺癌耐藥蛋白（BCRP/ABCG2）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）和 P?糖蛋白，是腫瘤多藥耐藥性中最關(guān)鍵的途徑［12?13］，其中，ABCB1蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥性機(jī)制最為重要。ABCB1蛋白作為藥物泵，可以將多種藥物泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積減少，減輕細(xì)胞毒性作用，從而產(chǎn)生多藥耐藥性［14］。

國(guó)內(nèi)多項(xiàng)研究顯示，五味子粗提取物及其有效成分五味子甲素具有逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用［3?4］，但是對(duì)于五味子甲素能否逆轉(zhuǎn)腫瘤干/祖細(xì)胞（TSPCs）尤其是膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞耐藥性及其作用機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，低濃度五味子甲素（0、12.50和25.00 μmol/L）對(duì)SHG?44s細(xì)胞未產(chǎn)生明顯的增殖抑制作用，當(dāng)五味子甲素達(dá)50 μmol/L時(shí)方表現(xiàn)出增殖抑制作用，因此本研究采用低濃度五味子甲素（0、12.50和25.00 μmol/L）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CCK?8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，SHG?44s細(xì)胞在五味子甲素和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合作用下較單純長(zhǎng)春新堿增殖活性明顯下降，表明五味子甲素可以部分逆轉(zhuǎn)SHG?44s細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。

多數(shù)細(xì)胞可以蓄積熒光染料，如Hoechst 33342和羅丹明123。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如ABCG2和ABCB1蛋白可以通過泵出藥物作用，將二者像化療藥物一樣泵出細(xì)胞外而使細(xì)胞不著色，與普通細(xì)胞分離。這些不著色的腫瘤細(xì)胞稱為側(cè)群細(xì)胞（SP細(xì)胞），研究證實(shí)多種腫瘤細(xì)胞中均存在側(cè)群細(xì)胞［15］。本研究對(duì)不同濃度五味子甲素組SHG?44s細(xì)胞進(jìn)行羅丹明123染色，倒置熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)顯示，隨著五味子甲素濃度的增加，SHG?44s細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加、熒光染色陽性細(xì)胞比例增加，表明五味子甲素可以抑制ABCB1蛋白泵出藥物能力。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)所見 2a 五味子甲素0 μmol/L組SHG?44s細(xì)胞羅丹明123染色陽性細(xì)胞比例為10.40% 2b 五味子甲素12.50 μmol/L組SHG?44s細(xì)胞羅丹明123染色陽性細(xì)胞比例為39.20% 2c 五味子甲素25.00 μmol/L組SHG?44s細(xì)胞羅丹明123染色陽性細(xì)胞比例為45.20%Figure 2 Flow cytometry findings The percentage of positive SHG?44s cells by Rhodamine 123 staining was 10.40% in schizandrin A 0 μ mol/L group(Panel 2a). The percentage of positive SHG?44s cells by Rhodamine 123 staining was 39.20%in schizandrin A 12.50 μmol/L group(Panel 2b).The percentage of positive SHG?44s cells by Rhodamine 123 staining was 45.20%in schizandrin A 25.00 μmol/L group(Panel 2c).

圖3 Western blotting法顯示，隨著五味子甲素濃度的增加（0、12.50和 25.00 μmol/L），SHG?44s細(xì)胞 P?糖蛋白表達(dá)水平逐漸降低Figure 3 Western blotting showed that the expression of P?gp in SHG?44s cells was gradually decreased with the increasing of schizandrin A concentration(0,12.50 and 25.00 μmol/L).

表5 不同濃度五味子甲素組SHG?44s細(xì)胞ABCB1基因表達(dá)水平的比較（x±s）Table 5. Comparison of ABCB1 expression in SHG?44s cells among different concentrations of schizandrin A(x±s)

表6 不同濃度五味子甲素組SHG?44s細(xì)胞ABCB1基因表達(dá)水平的兩兩比較Table 6. Paired comparison of ABCB1 gene expression in SHG?44s cells among different concentrations of schizandrin A

本研究采用實(shí)時(shí)PCR和Western blotting法對(duì)ABCB1基因及其編碼的P?糖蛋白表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，予五味子甲素后SHG?44s細(xì)胞ABCB1基因轉(zhuǎn)錄和翻譯能力均下降。研究顯示，尼卡地平作為多藥耐藥基因ABCG2的作用底物具有逆轉(zhuǎn)其功能的作用［13，16］。五味子甲素通過抑制膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞表面已存在的ABCB1基因編碼的P?糖蛋白泵出藥物能力并降低ABCB1基因轉(zhuǎn)錄和翻譯能力，從而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞耐藥性的作用。尼卡地平與五味子甲素聯(lián)合作用是否能夠進(jìn)一步提高膠質(zhì)瘤療效尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，五味子甲素可以抑制膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞表面已存在的ABCB1基因編碼的P?糖蛋白泵出藥物能力，還可以通過降低ABCB1基因轉(zhuǎn)錄和翻譯能力，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞的耐藥性。

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Study on schizandrin A reversing drug resistance of glioma stem/progenitor cells by ATP binding cassette subfamily B member 1

WEI Zi?long1,DI Chong2,LOU Mei?qing3,ZHAO Yao?dong3
1Department of Neurosurgery,Shanghai Pudong Hospital,Shanghai 201399,China
2Department of Intensive Care Unit,the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University,Xuzhou 221002,Jiangsu,China
3Department of Neurosurgery,Shanghai General Hospital,Shanghai 200080,China
Corresponding author:ZHAO Yao?dong(Email:zhaoyd@aliyun.com)

ObjectiveTo investigate the effect of schizandrin A on drug resistance of glioma stem/progenitor cells(GSPCs)and its mechanism.MethodsIsolate and culture SHG?44s cells from human glioma cell line SHG?44.The SHG?44s cells were treated with different concentrations of schizandrin A(0,12.50,25.00 and 50.00 μmol/L)and vincristine(400,800 and 1200 nmol/L).The cell proliferative activity was measured by cell counting kit?8(CCK?8)assay.Rhodamine 123 staining was used to detect the drug delivery ability of SHG?44s cells. The transcription and translation ability of ATP binding cassette subfamily B member 1(ABCB1)gene of SHG?44s cells was detected by real?time polymerase chain reaction(PCR)and Western blotting.ResultsThe proliferative activity of SHG?44s cells was inhibited when the concentration of schizandrin A was 50 μmol/L(P=0.001,0.001,0.039),so this concentration was removed in the follow?up study.No matter the concentration of vincristine was 400,800 or 1200 nmol/L,combining with schizandrin A could inhibit the proliferative activity of SHG?44s cells(vincristine 400 nmol/L:P=0.007,0.001;vincristine 800 nmol/L:P=0.001,0.000;vincristine 1200 nmol/L:P=0.000,0.000).Inverted fluorescence microscopy findings showed SHG ?44s cells in the group of schizandrin A 0 μ mol/L rarely revealed green fluorescence,while SHG ?44s cells in the groups of schizandrin A 12.50 and 25.00 μ mol/L presented obvious green fluorescence.Flow cytometry showed that with the increasing of schizandrin A concentration,the percentage of positive cells by Rhodamine 123 staining was 10.40%,39.20% and 45.20%,respectively.Real?time PCR showed thatABCB1gene expression levels of SHG?44s cells in schizandrin A 12.50 μ mol/L group and 25.00 μ mol/L group were significantly decreased comparing with schizandrin A 0 μ mol/L group(P=0.027,0.006),especially in schizandrin A 25.00 μ mol/L group(P=0.034).Western blotting showed that the expression level of P?glycoprotein(P?gp)in SHG?44s cells was gradually decreased with the increasing of schizandrin A concentration.ConclusionsSchizandrin A can inhibit the drug delivery ability of P?gp coded byABCB1gene existing in the surface of GSPCs.It can further reverse the drug resistance of GSPCs by reducing the transcription and translation ofABCB1gene.

Schizandrin; ATP ?binding cassette transporters; Glioma; Neoplastic stem cells;Drug tolerance; Microscopy, fluorescence; Flow cytometry; Polymerase chain reaction;Immunoblotting; Tumor cells,cultured

10.3969/j.issn.1672?6731.2017.06.009

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題（項(xiàng)目編號(hào)：201540412）；上海市浦東醫(yī)院基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：201313）；上海市浦東醫(yī)院2012年度優(yōu)秀人才“南菁獎(jiǎng)”項(xiàng)目

201399上海市浦東醫(yī)院神經(jīng)外科（魏子龍）；221002徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（狄沖）；200080上海市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科（樓美清，趙耀東）

趙耀東（Email：zhaoyd@aliyun.com）

This study was supported by Scientific Research Project of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning(No.201540412),Funded Project of Shanghai Pudong Hospital(No.201313)and Personnel Training Program"Nanjing Award 2012"of Shanghai Pudong Hospital.

2017?05?08）