張 磊，盛文文，陳術合，孫景洲

趨化因子SDF-1調(diào)控結(jié)直腸癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

張 磊，盛文文，陳術合，孫景洲

目的通過檢測Twist、SDF-1、E-cadherin在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達，探討三者與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的相關性，為腫瘤的分子靶向治療提供可能的靶標。方法收集結(jié)直腸癌和對應癌旁正常新鮮標本組織40例和結(jié)直腸癌組織及對應癌旁組織蠟塊90例，利用免疫組化SP法和qRT-PCR法檢測結(jié)直腸癌組織中SDF-1及EMT相關因子E-cadherin、Twist的表達，統(tǒng)計學分析SDF-1表達與E-cadherin、Twist表達之間的相關性。結(jié)果qRT-PCR結(jié)果顯示，與對應癌旁組織相比，結(jié)直腸癌組織中SDF-1、Twist mRNA的表達水平明顯升高，而E-cadherin mRNA表達水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；結(jié)直腸癌組織中SDF-1、Twist的陽性率分別為75.56%、62.22%，明顯高于對應癌旁組織，而E-cadherin在腫瘤中的陽性率為28.89%，顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SDF-1表達與E-cadherin表達呈負相關，而與Twist表達呈正相關。結(jié)論趨化因子SDF-1高表達可能參與結(jié)直腸癌細胞的EMT過程，Twist高表達和E-cadherin低表達提示EMT現(xiàn)象參與結(jié)直腸癌的形成及轉(zhuǎn)移過程，并促進腫瘤的生成和轉(zhuǎn)移。

結(jié)直腸腫瘤；趨化因子；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；SDF-1

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，已經(jīng)嚴重危害我國人們的身體健康。探討結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移機制對患者的早期診治及提高生存率有重要意義[1-2]。基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)及其受體CXCR4信號通路在腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，有望成為潛在的腫瘤治療靶向位點[3-4]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是腫瘤細胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移過程中首先發(fā)生的形態(tài)學變化[5]。在EMT過程中，腫瘤細胞很可能受到趨化因子的趨化作用，目前國內(nèi)外也有相關文獻報道趨化因子SDF-1與EMT之間的關系。本實驗采用免疫組化SP法和qRT-PCR法聯(lián)合檢測，初步確認結(jié)直腸癌組織中SDF-1表達與EMT相關因子E-cadherin及Twist之間的相關性，探討SDF-1在EMT過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1一般資料收集皖西衛(wèi)生職業(yè)學院附屬醫(yī)院以及安徽醫(yī)科大學附屬醫(yī)院外科2014～2016年手術切除的結(jié)直腸癌和對應癌旁正常新鮮標本組織40例(癌旁正常組織距離切緣6 cm、癌組織均經(jīng)病理證實)。將標本組織放置在液氮罐中留存，待提取組織中總的RNA。同時調(diào)取該兩家醫(yī)院病理科結(jié)直腸癌組織及對應癌旁組織蠟塊90例(病理已證實)?；颊吣挲g35～80歲，平均59.5歲。女性34例，男性56例。組織學分級：低分化60例，中+高分化30例。浸潤深度分級：肌層及漿膜下層56例，黏膜和黏膜下層34例。腫瘤直徑<5 cm者32例，直徑≥5 cm者58例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者66例。遠處轉(zhuǎn)移者45例。TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期37例，Ⅲ+Ⅳ期53例。蠟塊4 μm厚切片，烤干以備用。

1.2試劑和方法

1.2.1試劑 兔抗人SDF-1、E-cadherin及Twist多克隆抗體購自美國Invitrogen公司，SDF-1稀釋度為1 ∶50，E-cadherin及Twist稀釋度為1 ∶100；二抗試劑盒(sp9001)及DAB顯色液購自福州邁新公司。提取總RNA的試劑RNAiso Plus及qRT-PCR Sybr Green I試劑盒為Takara公司產(chǎn)品，英濰捷基合成SDF-1、E-cadherin、Twist及GAPDH引物，7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2.2方法 標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋后切片，行HE和免疫組化SP法染色。免疫組化操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，以PBS作為陰性對照或兔IgG替代一抗。

qRT-PCR操作：把之前保存在液氮罐內(nèi)的標本取出，并按照試劑盒說明書的操作流程進行總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR。qRT-PCR引物序列：SDF-1上游5′-ATTCTCAA CACTCCAAACTGTGC-3′，下游5′-ACTTTAGCTTCGGGTCA ATGC-3′；E-cadherin上游5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′，下游5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′；Twist上游5′-GCCTAGAGTTGCCGACTTATG-3′，下游5′-TGCGTTTCCTGT TAAGGTAGC-3′；GAPDH上游5′-CTCACCGGATGCACCAAT GTT-3′，下游5′-CGCGTTGCTCACAATGTTCAT-3′。qRT-PCR反應程序：58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s；94 ℃ 2 min；一共進行40個循環(huán)，72 ℃ 5 min。每個標本組織設有3個復孔。定量結(jié)果為反應完成后計算機進行測算。

1.3結(jié)果判斷

1.3.1免疫組化結(jié)果判斷 E-cadherin、SDF-1及Twist均呈陽性，SDF-1及Twist陽性細胞以胞質(zhì)顯色清晰棕黃色，E-cadherin陽性細胞則以細胞膜和胞質(zhì)顯色清晰黃色。采用半定量積分法判斷陽性結(jié)果[6]：根據(jù)細胞染色強度和陽性細胞占同類細胞總數(shù)的百分比(隨機選取10個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)100個細胞)兩方面進行綜合判定。(1)按染色強度計分：0分為無染色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。(2)按陽性細胞數(shù)計分：0～25%為0分；25%～50%為1分；50%～75%為2分；>75%為3分。將兩項得分結(jié)果相乘：≥2分為陽性，<2分為陰性。

1.3.2qRT-PCR結(jié)果判斷 測量標本組織模板Ct值。Ct值的含義是每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。ΔCt等于Ct(目的基因)減去Ct(內(nèi)參基因)，得到的ΔCt數(shù)值小則說明原始cDNA目的基因表達就高。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0軟件進行計量資料的處理。采用χ2檢驗分析免疫組化結(jié)果，采用配對t檢驗分析qRT-PCR結(jié)果，指標間的相關性利用Spearman秩相關分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1qRT-PCR檢測結(jié)直腸癌和癌旁組織內(nèi)E-cadherin、twistmRNA及SDF-1的表達qRT-PCR檢測SDF-1、E-cadherin及Twist蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達，發(fā)現(xiàn)正常癌旁組織與結(jié)直腸癌組織對比，結(jié)直腸癌組織中SDF-1、Twist mRNA的表達水平明顯提高，而E-cadherin mRNA表達水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。

2.2SDF-1、E-cadherin及Twist在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達免疫組化法檢測SDF-1、E-cadherin及Twist蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達，結(jié)果顯示SDF-1、Twist表達定位于細胞質(zhì)，E-cadherin部分表達定位于細胞質(zhì)和細胞膜，陽性細胞呈現(xiàn)出棕黃色顆粒狀(圖2)。SDF-1在結(jié)直腸癌組織中的陽性率為75.56%，在相應癌旁組織中的陽性率為38.89%；Twist在結(jié)直腸癌組織中的陽性率為62.22%，癌旁組織為34.44%；E-cadherin在結(jié)直腸癌組織中的陽性率為28.89%，在相應癌旁組織中陽性率明顯升高，高達81.11%(P<0.05，表1)。

表1 結(jié)直腸癌和癌旁組織中SDF-1、Twist、E-cadherin的表達

2.3SDF-1表達與Twist及E-cadherin表達之間的相關性本組實驗結(jié)果表明，SDF-1表達與Twist表達呈正相關，與E-cadherin表達呈顯著負相關(P<0.05，表2)。

圖1 結(jié)直腸癌和癌旁組織中SDF-1(A)、Twist(B)、E-cadherin(C) mRNA的表達

ABC

圖2 結(jié)直腸癌組織中Twist(A)、E-cadherin(B)、SDF-1(C)的表達水平，SP法

3 討論

趨化因子通過細胞膜上的特異性受體發(fā)揮其生物學功能。趨化因子受體屬于G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體，目前已鑒定的趨化因子受體至少有20種。根據(jù)結(jié)合配體不同可分為4類，CXC族受體(CXCR)、CC族受體(CCR)、C族受體(XCR1)和CX3C族受體(CX3CR)[7]。趨化因子最初被認為是白細胞的誘導劑，但是目前公認趨化因子可表達于包括腫瘤細胞在內(nèi)的幾乎所有細胞中[8]。最新研究表明趨化因子及其受體在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，并且可能成為腫瘤治療的新靶點[9-10]。

大量研究表明，趨化因子SDF-1在包括食管癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的演進過程中起到重要作用[11-12]。本組實驗發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中SDF-1 RNA及蛋白水平表達均高于相應癌旁組織，并且前期實驗結(jié)果表明，DF-1表達與腫瘤細胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(P<0.05)[13]。這些結(jié)果提示：結(jié)直腸癌中SDF-1可能參與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程，但是具體機制尚不清楚，這與之前的實驗結(jié)果一致。

EMT過程是腫瘤轉(zhuǎn)移的起始階段，在這一過程中上皮細胞逐漸向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變并具有侵襲作用，同時上皮標志物E-cadherin等表達逐漸減少，而間質(zhì)標志物如N-cadherin及Twist等表達顯著升高[14]?，F(xiàn)已有多篇文獻報道EMT參與腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移過程，包括乳腺癌、前列腺癌、胃癌等[15-17]。本組實驗發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織中也存在EMT現(xiàn)象，免疫組化及qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，E-cadherin在結(jié)直腸癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，而Twist在結(jié)直腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，提示EMT現(xiàn)象參與了結(jié)直腸癌的形成及轉(zhuǎn)移過程。

趨化作用在EMT過程中的作用未知，并且國內(nèi)外文獻很少報道。Pang等[18]報道CCR7介導的趨化作用可以誘導乳腺癌細胞發(fā)生EMT，進而促進乳腺癌細胞遷移。本實驗分析了90例結(jié)直腸癌組織中趨化因子SDF-1與EMT因子E-cadherin及Twist表達的相關性，發(fā)現(xiàn)SDF-1表達與E-cadherin表達呈負相關，而與Twist表達呈正相關，表明了趨化因子SDF-1參與結(jié)直腸癌細胞的EMT作用。

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R 735.3

A

1001-7399(2017)10-1126-03

時間：2017-10-23 13:30 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.015.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.015

接受日期：2017-04-06

安徽省高校省級優(yōu)秀青年人才基金重點項目(2013 SQRL147ZD)、安徽省高等學校自然科學研究一般項目(KJ2017B01)

皖西衛(wèi)生職業(yè)學院基礎部解剖教研室，六安 237005

張 磊，男，碩士，副教授。E-mail: 81057268@qq.com

孫景洲，男，教授，通訊作者。E-mail: 289843592@qq.com