曾 智，閻紅琳，陳龍艷，田 山，黃亞冰，古麗娟，熊曉星,4，袁靜萍

·論 著·

結(jié)直腸腺癌組織中USP10的表達及生物信息學(xué)分析

曾 智1，閻紅琳1，陳龍艷2，田 山2，黃亞冰1，古麗娟3，熊曉星3,4，袁靜萍1

目的探討泛素特異性蛋白酶10(Ubiquitin-specific protease 10, USP10)及其mRNA在人結(jié)直腸腺癌組織中的表達及意義，并分析表達失調(diào)的原因。方法選取99例人結(jié)直腸腺癌及83例正常腸黏膜組織，采用組織芯片和免疫組化法檢測USP10蛋白表達，并分析該蛋白表達與臨床病理特征及患者預(yù)后生存的關(guān)系。采用GEO數(shù)據(jù)庫分析USP10 mRNA表達水平。通過生物信息學(xué)法篩選出負性調(diào)控USP10蛋白表達的miRNA。采用免疫印跡及實時熒光定量PCR法分別檢測不同腸癌細胞系中USP10蛋白和miR-149的表達。結(jié)果USP10蛋白在正常腸黏膜組織中的陽性率為71.08%(59/83)，明顯高于腸腺癌組織(53.54%，53/99)(P=0.015)。USP10蛋白表達與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征及患者預(yù)后生存無相關(guān)性(P>0.05)。USP10 mRNA在結(jié)直腸腺癌中的表達水平是正常腸黏膜組織的1.07～1.45倍，表明USP10蛋白表達下調(diào)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。生物信息學(xué)分析顯示，結(jié)直腸腺癌組織中呈高水平表達的miR-149與USP10 mRNA的3′UTR端具有高度保守的潛在結(jié)合位點，且腸癌細胞系中miR-149與USP10蛋白表達呈負相關(guān)。結(jié)論USP10蛋白低水平表達與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，其表達下調(diào)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，miR-149高水平表達可能是負性調(diào)控USP10蛋白表達的因子之一。

結(jié)直腸腫瘤；結(jié)直腸腺癌；USP10；miR-149；生物信息學(xué)

結(jié)直腸腺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率位居全球所有腫瘤的第3位，僅次于肺癌及乳腺癌[1]。目前研究普遍認為，泛素-蛋白酶體途徑與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶10(ubiquitin-specific protease 10, USP10)與胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。最新分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌中，USP10可以通過去泛素化作用，增強抑癌基因SIRT6的蛋白穩(wěn)定性，從而拮抗癌基因c-myc的轉(zhuǎn)錄激活，進而抑制結(jié)腸癌細胞的增殖，提示USP10在結(jié)直腸腺癌的發(fā)生過程中起重要作用[5]。本實驗采用組織芯片和免疫組化法檢測結(jié)直腸腺癌組織中USP10蛋白的表達，旨在通過大樣本的臨床病例進一步闡明USP10在人結(jié)直腸腺癌組織中的表達及其臨床意義。此外，本實驗還通過基因芯片數(shù)據(jù)庫分析結(jié)合生物信息學(xué)的方法，試圖探討USP10在結(jié)直腸腺癌中表達下調(diào)的原因。

1 材料與方法

1.1材料人結(jié)直腸腺癌組織芯片購自武漢愛威爾生物公司，組織芯片編號為IWLT-N-70C41、IWLT-N-70C42、IWLT-N-70C43，共包含105例人結(jié)直腸腺癌組織及其配對的105例正常腸黏膜組織樣本，并附帶相應(yīng)的臨床病理資料(患者性別、年齡、腫塊大小、部位、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期情況)，其中83例有生存隨訪信息。三種組織芯片中的臨床樣本無交叉重疊，所有結(jié)直腸腺癌樣本均為原發(fā)癌，取材前未行放、化療，未服用非類固醇類抗炎藥。此外，三種組織芯片附帶常規(guī)HE染色的虛擬切片，經(jīng)病理學(xué)復(fù)查，均證實為結(jié)直腸腺癌。

1.2免疫組化采用免疫組化SP法染色，即用型免疫組化UltraSensitive SP超敏試劑盒(鼠/兔，KIT-9710)和DAB顯色試劑盒均購自福州邁新公司。一抗為USP10兔抗人單克隆抗體(ab109219；Abcam, Cambridge, MA, USA)，工作濃度為1 ∶250。石蠟組織芯片常規(guī)脫蠟、水化，其余操作按試劑盒說明書進行，其中一抗為4 ℃孵育過夜，修復(fù)方式為微波抗原熱修復(fù)。用人腎上腺組織作為內(nèi)對照，其中腎上腺皮質(zhì)成分為陽性對照，髓質(zhì)成分為陰性對照[6]。

1.3免疫組化結(jié)果判讀免疫組化結(jié)果由兩位病理專家獨立閱片，閱片前均不知曉結(jié)果。識別組織芯片上每一芯點中的組織，意見分歧時協(xié)商以雙方最后達成一致為準(zhǔn)。USP10蛋白表達結(jié)果采用半定量積分法，即著色強度呈淺黃色為1分，黃色為2分，黃褐色為3分，無陽性著色為0分；陽性細胞比例<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。USP10表達水平采用以上兩項結(jié)果乘積(Score=0～12，圖1)為最終結(jié)果：≤6分為陰性組，>6分為陽性組。

1.4基因芯片數(shù)據(jù)分析從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的腫瘤公共數(shù)據(jù)庫GEO Datasets(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中下載人結(jié)直腸腺癌樣本基因表達譜數(shù)據(jù)集(GSE44076、GDS4382、GSE37364)[7-9]，并通過NCBI 自帶的GEO2R分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。以人USP10為靶基因，應(yīng)用microRNA分析軟件TargetScan(http://www.targetscan.org)和Pictar(http://pictar.mdc-berlin.de)預(yù)測，篩選獲得可能與USP10結(jié)合的microRNA，將預(yù)測出的9種miRNA分別調(diào)入GEO數(shù)據(jù)庫，下載microRNA表達譜數(shù)據(jù)集(GSE48267：包含62例新鮮組織，其中31例為結(jié)直腸腺癌、31例為配對的正常腸黏膜組織)[10]，同上述方法進行miRNA表達含量分析，篩選出在結(jié)直腸腺癌中表達上調(diào)的miRNA。

1.5細胞培養(yǎng)4種不同的腸癌細胞系(LOVO細胞系、SW48細胞系、SW480細胞系、DLD1細胞系)為武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實驗室保存。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，并置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。待細胞密度達80%～90%時，通過胰酶消化更換培養(yǎng)基傳代。

1.6實時熒光定量PCR采用Trizol法提取細胞總RNA，包括miRNA。miRNA的逆轉(zhuǎn)錄采用莖環(huán)法，根據(jù)miRNA成熟體序列設(shè)計特異性莖環(huán)引物(表1)。逆轉(zhuǎn)錄分兩步完成，第一步反應(yīng)體系包括：4 μL的樣品總RNA，1 μL莖環(huán)引物，7 μL RNase Free ddH2O；反應(yīng)程序：65 ℃ 5 min，然后冰上5 min；第二步在上述體系中繼續(xù)加入4 μL 5×RT buffer，2 μL dNTP(10 mmol/L)，1 μL RT-Ace逆轉(zhuǎn)錄酶和1 μL 40 U/μL的RNase Inhibitor；反應(yīng)程序：30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，95 ℃ 5 min，然后4 ℃保存。實時熒光定量PCR采用雙鏈DNA染料Power SYBR Green試劑盒(ABI)和ABI 7500 fast系統(tǒng)。反應(yīng)體系：5 μL PCR Master Mix(2×)，0.2 μL上游引物(10 μmol/L)，0.2 μL下游引物(10 μmol/L)，1 μL cDNA，3.6 μL ddH2O。所有反應(yīng)在96孔板(MicroAmp optical 96-well)中進行，用Optical adhesive covers(Applied Biosystems)進行封口，擴增反應(yīng)采用三復(fù)孔，并計算標(biāo)準(zhǔn)差來衡量實驗誤差。通過計算miR-149與內(nèi)參U6的Ct值之差(ΔCt)，來反映在等量RNA起始反應(yīng)的情況下目的miRNA表達的差異。

表1 引物序列

圖1 USP10蛋白在結(jié)直腸腺癌及正常腸黏膜組織中不同表達評分的代表圖，SP法

1.7Westernblot用RIPA裂解液裂解腸癌細胞后，采用BCA法測定蛋白濃度。定量后取各樣本40 μg進行SDS-PAGE電泳，電壓保持在40～60 V，待樣品跑齊至濃縮膠與分離膠的界限時，再恒壓100 V電泳1.5 h。然后應(yīng)用PVDF膜轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂牛奶封閉1 h。USP10兔抗人單克隆抗體(ab109219；Abcam，Cambridge，MA，USA，工作濃度1 ∶1 000)和GAPDH鼠抗人單克隆抗體(60004-1-Ig，Proteintech，Wuhan，China，工作濃度1 ∶2 000)4 ℃孵育過夜，洗膜后分別加入辣根酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠二抗孵育1 h，洗滌后與ECL發(fā)光試劑反應(yīng)，曝光洗片，掃描圖像。條帶灰度值采用Image J軟件測算，以GAPDH作為內(nèi)參進行標(biāo)準(zhǔn)對照。每組實驗重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，對計數(shù)資料用率表示，采取χ2檢驗、Fisher精確檢驗；繪制Kaplan-Merier生存曲線，采用Log-rank檢驗生存率的比較；以單樣本K-S檢驗方法驗證基因表達譜數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用t檢驗，對不符合正態(tài)分布者行兩獨立樣本非參數(shù)檢驗(Mann-Whitney Test)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1USP10蛋白在結(jié)直腸腺癌及正常腸黏膜組織中的表達3張組織芯片共包含105例腸腺癌組織及配對的105例正常腸黏膜組織，經(jīng)過免疫組化染色及形態(tài)學(xué)閱片后，有99例腸腺癌組織具有完整的腫瘤成分，有83例正常腸黏膜組織具有完整的黏膜上皮。其余芯片位點存在掉點或結(jié)果無法判讀的情況。

USP10蛋白陽性信號主要定位于細胞質(zhì)及部分細胞膜。其中在結(jié)直腸腺癌組織，USP10蛋白主要表達于腫瘤細胞；在正常腸黏膜組織，該蛋白主要表達于正常腺體的上皮細胞；此外，在間質(zhì)中的部分淋巴細胞、漿細胞及神經(jīng)纖維也可見USP10的散在陽性信號(圖1)。本實驗主要分析USP10蛋白在實質(zhì)上皮成分中的表達，發(fā)現(xiàn)USP10蛋白在正常腸黏膜組織的陽性率為71.08%(59/83)，明顯高于腸腺癌組織(53.54%，53/99)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.875，P=0.015，圖2)。

2.2USP10蛋白與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系99例結(jié)直腸腺癌患者平均年齡為60歲，腫塊平均直徑為4.8 cm。結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP10蛋白表達與患者年齡、性別、腫塊大小、腫瘤部位、細胞分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期均無明顯相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。

圖2 USP10蛋白在結(jié)直腸腺癌及正常腸黏膜組織中的表達

表2 USP10蛋白表達與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3USP10蛋白表達與結(jié)直腸腺癌患者的生存率的關(guān)系在隨訪成功的83例患者中，死亡19例，存活64例，隨訪時間23～45個月。USP10陰性組：死亡7例，存活30例，中位生存時間34.82個月；USP10陽性組：死亡12例，存活34例，中位生存時間32.31個月；Log-rank檢驗顯示，USP10蛋白表達與患者預(yù)后生存時間之間無相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.699，P=0.192，圖3)。

圖3 USP10蛋白表達與結(jié)直腸腺癌患者預(yù)后的生存曲線

2.4結(jié)直腸腺癌及正常腸黏膜組織中USP10mRNA的表達GEO Datasets表達譜數(shù)據(jù)顯示，USP10 mRNA在結(jié)直腸腺癌組織中的表達水平略高于正常腸黏膜組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但差異倍數(shù)僅為1.07～1.45倍(圖4)。

2.5結(jié)直腸腺癌及正常腸黏膜組織中與USP10有結(jié)合位點的miRNA的表達TargetScan預(yù)測出與USP10有結(jié)合位點的8種miRNA分別為miR-129-5p、miR-132-3p、miR-212-3p、miR-138-5p、miR-24-3p、miR-142-5p、miR-103-3p及miR-107，其中與USP10 3’UTR具有高度保守結(jié)合位點的為miR-138-5p及miR-142-5p。PicTar預(yù)測出miR-138及miR-149。將這9種miRNA調(diào)入GEO數(shù)據(jù)庫(GSE48267)進行miRNA表達含量分析，篩選出在結(jié)直腸腺癌中表達上調(diào)的3種miRNA。其中miR-149上調(diào)最為顯著，結(jié)直腸腺癌組織中的表達含量是正常腸黏膜組織的7.67倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5)。miR-129-5p及miR-212-3p僅上調(diào)1.08倍及1.15倍，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表3)。

表3 miRNA基因芯片數(shù)據(jù)

圖4 USP10 mRNA表達水平的散點圖

A.在基因芯片GSE44076中，USP10 mRNA在98例結(jié)直腸腺癌中的表達水平是98例正常腸黏膜的1.07倍；B.在GDS4382中，17例結(jié)直腸腺癌的表達水平是17例正常腸黏膜的1.16倍；C.在GSE37364中，27例結(jié)直腸腺癌的表達水平是38例正常腸黏膜的1.45倍

圖5 GSE48267數(shù)據(jù)分析

miR-149在結(jié)直腸腺癌及正常腸黏膜組織中的表達水平散點圖

2.6腸癌細胞系中miR-149與USP10蛋白表達的相關(guān)性鑒于GEO數(shù)據(jù)庫芯片結(jié)果顯示，miR-149在結(jié)直腸腺癌組織中的表達上調(diào)，而本實驗中USP10蛋白在結(jié)直腸腺癌組織中表達下調(diào)，為探討兩者之間的相關(guān)性，本組實驗進一步在4種不同腸癌細胞系(LOVO細胞系、SW48細胞系、SW480細胞系、DLD1細胞系)中檢測miR-149和USP10蛋白表達水平。結(jié)果顯示，在LOVO細胞系中，miR-149的表達相較于其他三種細胞系下降(P<0.05，圖6A)，而USP10蛋白表達上升(圖6B)；同樣，在SW48細胞系、SW480細胞系和DLD1細胞系中，miR-149與USP10蛋白表達也呈相反變化趨勢，提示腸癌細胞系中miR-149與USP10蛋白的表達呈負相關(guān)。

圖6 腸癌細胞系中miR-149與USP10蛋白表達的相關(guān)性

A.miR-149在腸癌細胞系中的相對表達，*P<0.05；B.USP10蛋白在腸癌細胞系中的表達

3 討論

泛素-蛋白酶體途徑是細胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解調(diào)節(jié)系統(tǒng)。通過對底物蛋白的多聚泛素化并經(jīng)蛋白酶體降解，影響或調(diào)節(jié)多種細胞活動。USP10，又名UBPO，位于16號染色體長臂24.1上。該基因編碼的蛋白由798個氨基酸構(gòu)成，能特異性地將泛素分子從泛素結(jié)合的蛋白底物中切割出來，主要參與泛素依賴的蛋白分解代謝、泛素周期等生命過程[4,11]。早期研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)涵體中USP10能夠促進囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)去泛素化，進而增強CFTR的內(nèi)吞回收功能[12]。

近年來，USP10與腫瘤相關(guān)的分子機制研究有了較大進展，相繼發(fā)現(xiàn)USP10與p53、T-bet、PCNA、Beclin1、SIRT6及NEMO等蛋白的去泛素化密切相關(guān)，進而參與細胞增殖、分化及自噬等生物學(xué)過程[5,13-16]。其中最具代表性的研究成果是：USP10通過去泛素化作用調(diào)節(jié)p53蛋白的穩(wěn)定性，從而逆轉(zhuǎn)泛素連接酶Mdm2誘導(dǎo)的p53轉(zhuǎn)運和泛素化降解過程[11]。進一步研究發(fā)現(xiàn)USP10不僅可以穩(wěn)定野生型p53蛋白，而且還可以穩(wěn)定突變型p53蛋白，并在腎癌的發(fā)生過程中起重要作用[11]。本組前期實驗報道USP10蛋白作為一種抑癌基因參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，是胃癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測指標(biāo)[4]。本組最新實驗還報道USP10與S100A12、E-cadherin等蛋白表達呈正相關(guān)，后者在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中也起重要作用[17]。此外，USP10蛋白還可以作為一種分子標(biāo)志物，在腎上腺皮質(zhì)腫瘤及髓質(zhì)腫瘤的鑒別診斷中起重要作用，在本實驗應(yīng)用這一表達特點作為免疫組化實驗中USP10蛋白表達的內(nèi)對照[6]。

Lin等[5]通過細胞學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)USP10可以通過去泛素化作用穩(wěn)定SIRT6蛋白，從而拮抗c-myc的轉(zhuǎn)錄激活，最終抑制結(jié)直腸腺癌的發(fā)生。在該研究中，Lin等[5]還檢測了10例結(jié)直腸腺癌及其正常腸黏膜組織中USP10蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)USP10在一部分結(jié)直腸腺癌組織中呈現(xiàn)低水平表達，然而該結(jié)論仍需要大樣本研究證實。在本研究中，本實驗收集了99例結(jié)直腸腺癌組織樣本，發(fā)現(xiàn)USP10蛋白在的腸黏膜上皮細胞中高表達，在結(jié)直腸腺癌中表達下調(diào)，提示USP10蛋白低水平與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，這一結(jié)果支持Lin等的研究。進一步的臨床病理參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，USP10蛋白低表達與患者年齡、性別、腫塊大小、腫瘤部位、細胞分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期之間無明顯相關(guān)性，提示USP10蛋白表達與結(jié)直腸腺癌的發(fā)展過程關(guān)系不大。此外，生存隨訪分析也顯示USP10蛋白表達水平的高低并不能作為結(jié)直腸腺癌患者預(yù)后生存時間長短的預(yù)測指標(biāo)。

在基因芯片表達譜數(shù)據(jù)庫中，作者選取3份有代表性的人結(jié)直腸腺癌及正常腸黏膜組織的基因芯片數(shù)據(jù)集，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP10 mRNA在結(jié)直腸腺癌組織中的表達水平略高于正常腸黏膜組織，但差異倍數(shù)并未超過1.5倍。這一結(jié)果與蛋白水平的表達調(diào)控方向并不一致，提示USP10蛋白在結(jié)直腸腺癌中的低水平表達并非是由該基因的mRNA合成下調(diào)所致，即該分子事件并非發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，可能是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。microRNA (miRNA)由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，不翻譯成蛋白質(zhì)，通過堿基互補配對方式可以與靶基因的3′UTR區(qū)域部分或完全互補，從而剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，進而起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在結(jié)直腸腺癌的發(fā)生過程中起重要作用[18]。本實驗采用生物信息學(xué)方法，通過多種預(yù)測軟件篩選出9種可能與USP10 3′UTR區(qū)域具有結(jié)合位點的miRNA，并將這些miRNA調(diào)入miRNA表達譜數(shù)據(jù)庫后，發(fā)現(xiàn)miR-149是唯一一個在結(jié)直腸腺癌組織中表達明顯上調(diào)且具有USP10 3′UTR區(qū)域結(jié)合位點的miRNA，同時，本實驗發(fā)現(xiàn)腸癌細胞系中miR-149與USP10蛋白的表達呈負相關(guān)，提示在人結(jié)直腸腺癌發(fā)生過程中，miR-149可能可以與USP10 3′UTR區(qū)域結(jié)合，進而負性調(diào)控USP10 mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而抑制USP10蛋白的表達。當(dāng)然這一結(jié)論還有待進一步的雙熒光素酶報告基因等分子生物學(xué)實驗證實。

綜上所述，USP10蛋白低水平表達主要與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生有關(guān)，而與該腫瘤的發(fā)展過程關(guān)系不大，其在預(yù)測患者預(yù)后生存方面的作用有限。同時，USP10蛋白在結(jié)直腸腺癌與正常腸黏膜組織中的差異性表達主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平，miR-149在這個過程中可能起負性調(diào)控作用。

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ExpressionofUSP10incolorectaladenocarcinomaandanalysisofbioinformatics

ZENG Zhi1, YAN Hong-lin1, CHEN Long-yan2, TIAN Shan2, HUANG Ya-bing1, GU Li-juan3, XIONG Xiao-xing3,4, YUAN Jing-ping1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofGastroenterology,3CentralLaboratory,4DepartmentofNeurosurgery,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

PurposeTo investigate the expression and significance of USP10 protein and mRNA in normal colorectal mucosa and colorectal adenocarcinoma, and to analyze the cause of the disorder.Methods99 cases of colorectal adenocarcinoma and 83 cases of normal intestinal mucosa tissue were selected. Using tissue microarray and immunohistochemistry the expression of USP10 protein was detected, and the relationship was analyzed between USP10 protein and clinical pathological parameters or prognosis survival time. The expression of USP10 mRNA was analyzed by GEO datesets. Some miRNAs that down-regulate the expression of USP10 protein were screened by bioinformatics methods. The expression of USP10 protein and miR-149 in colorectal cancer cell lines were detected by Western blot and real-time quantitative PCR.ResultsThe positive rate of USP10 protein in normal intestinal mucosa tissues was 71.08% (59/83), which was significantly higher than that in colorectal adenocarcinoma tissues (53.54%, 53/99,P=0.015). No correlation were proved between USP10 protein expression and clinical pathological parameters or survival time (P>0.05). The expression level of USP10 mRNA in colorectal adenocarcinoma was 1.07～1.45 times that were higher than that of normal intestinal mucosa, which showed that the down-regulation of USP10 protein was at the post-transcriptional level. The program predicted a putative highly-conserved binding site in the USP10 mRNA 3′UTR for miR-149 which was up regulated in colorectal adenocarcinoma tissues. In addition, the expression of miR-149 was negatively correlated with the expression of USP10 protein in colorectal cancer cell lines.ConclusionThe down-regulation of USP10 protein which occurs at the post-transcriptional level is closely related to the pathogenesis of colorectal adenocarcinoma. The high expression of miR-149 may be one of the factors that negatively regulate the expression of USP10 protein.

colorectal neoplasms; colorectal adenocarcinoma; USP10; miR-149; bioinformatics

R 735.3

A

1001-7399(2017)10-1063-07

時間：2017-10-23 13:30 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.001.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.001

接受日期：2017-08-30

國家自然科學(xué)基金(81602535)、湖北省自然科學(xué)基金面上項目(2016CFB249)

武漢大學(xué)人民醫(yī)院1病理科、2消化內(nèi)科、3中心實驗室、4神經(jīng)外科，武漢 430060

曾 智，男，主治醫(yī)師。E-mail: zhizeng@whu.edu.cn

袁靜萍，女，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: yuanjingping2003@aliyun.com