朱曉靜，許鵬飛，曹 彥，謝開鵬，唐冉冉

肺癌組織及細(xì)胞中MED27的表達(dá)及意義

朱曉靜1，許鵬飛2，曹 彥2，謝開鵬2，唐冉冉2

目的探討中介因子復(fù)合體(mediator 27, MED27)在肺癌組織樣本和肺癌細(xì)胞中的表達(dá)并進(jìn)一步觀察MED27在肺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。方法采用免疫組化法和Western blot法檢測MED27在70例肺癌組織以及5種不同肺癌細(xì)胞中的表達(dá)，分析MED27蛋白表達(dá)與肺癌臨床病理特征的相關(guān)性；設(shè)計(jì)沉默MED27基因的siRNA，利用Western blot法檢測MED27 siRNA在肺癌細(xì)胞中的沉默效率；CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力的變化，劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞的遷移和侵襲能力的變化；Western blot法檢測遷移侵襲相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果免疫組化和Western blot檢測結(jié)果表明，MED27在肺癌組織以及肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。MED27表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(χ2=9.438，P=0.002，P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤T分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等均無相關(guān)性(P>0.05)；利用小干擾RNA沉默MED27的表達(dá)，可以抑制H460細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲(P<0.05)。同時(shí)，遷移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)明顯下調(diào)，侵襲相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)也明顯下調(diào)，而E-cadherin的負(fù)性調(diào)控蛋白Snail表達(dá)升高。結(jié)論MED27在肺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，且MED27陽性肺癌患者預(yù)后更差。沉默MED27的表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，以上結(jié)果提示MED27可以作為臨床肺癌基因治療的潛在靶標(biāo)。

肺腫瘤；中介因子復(fù)合體27；遷移；侵襲

雖然肺癌的研究近年來已取得一定的進(jìn)展，但是非小細(xì)胞肺癌的5年生存率并未顯著提高[5-6]。MED27作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在人體各組織中廣泛表達(dá)。目前，對MED27功能的研究主要集中在其轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面。如MED27可以與甲狀腺激素受體相互作用，或通過與其它轉(zhuǎn)錄因子和輔因子結(jié)合一起行使甲狀腺激素受體功能[7]。但是，MED27在癌癥發(fā)生、發(fā)展中的功能和機(jī)制卻知之甚少。前期研究發(fā)現(xiàn)，MED27在黑色素瘤中異常高表達(dá)，可以作為評估黑色素瘤預(yù)后的潛在標(biāo)志物[8]。本實(shí)驗(yàn)擬通過分析MED27在肺癌組織中的表達(dá)和與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系，以及MED27對肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，闡明MED27在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，以期為肺癌的臨床靶向治療提供新的靶點(diǎn)和思路。

1 材料與方法

1.1臨床資料肺癌組織芯片購自上海芯超生物公司，含70例肺腺癌和對應(yīng)的癌旁組織。所有的肺癌患者在手術(shù)之前均未行放、化療，腫瘤的邊緣組織經(jīng)過病理證實(shí)無腫瘤侵犯為癌旁組織。其中，男性37例，女性33例；年齡36～83歲，中位年齡59歲；根據(jù)國際肺癌TNM標(biāo)準(zhǔn)分期：T1+T2者58例，T3+T4者12例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：N0+N1者44例，N2+N3者26例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M0者67例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M1者3例。

1.2實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑免疫組化試劑盒購自康為世紀(jì)公司，人肺癌細(xì)胞H1299、A549、H1975、H1437、H460均購自ATCC細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室凍存保存及傳代培養(yǎng)，正常人支氣管上皮細(xì)胞(HBE)培養(yǎng)在10%的RPMI-1640中。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco公司，胰酶-EDTA購自Sigma公司；MED27人源的雙鏈siRNA由上海吉瑪制藥公司合成(siRNA1：上游5′-GGCUCCAAUUUG UCUAUAATT-3′，下游5′-UUAUAGACAAAUUGGAG CCTT-3′；siRNA2：上游5′-GGUGGCCAUAGUUCG AUAUTT-3′，下游5′-AUAUCGAACUAUGGCCACC TT-3′)，轉(zhuǎn)染使用的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；Transwell小室和Matrigel購自美國BD公司，CCK-8購自東仁化學(xué)科技公司，BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司，MED27、MMP-2、MMP-9抗體購自Santa Cruz公司(1 ∶500)；E-cadherin、Snail抗體購自Cell Signaling Technology(1 ∶1 000)，GAPDH購自Abcam公司(1 ∶1 000)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)與山羊抗鼠IgG(H+L)購自ProteinTech公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化法檢測MED27在肺癌組織中的表達(dá) 免疫組化染色采用SP法，結(jié)果由兩位病理醫(yī)師分別獨(dú)立讀片。組織經(jīng)二甲苯脫蠟，再通過梯度乙醇水化。微波爐中火10 min×5次進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加山羊血清工作液室溫孵育10～15 min，以去除非特異性結(jié)合。一抗4 ℃孵育過夜，PBS漂洗，PV9000室溫孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸、75%乙醇分化，1%氨水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，封片。PBS代替一抗作為陰性對照，免疫組化結(jié)果判斷：本實(shí)驗(yàn)根據(jù)細(xì)胞著色程度和陽性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞百分比的評分乘積進(jìn)行半定量。200倍顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)無交叉重復(fù)的視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，按細(xì)胞著色程度評分：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細(xì)胞占觀察細(xì)胞百分比評分：無陽性細(xì)胞為0分，≤20%為1分，21%～49%為2分，≥50%為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+)，4～6分為中度陽性()，>6分為強(qiáng)陽性()。其中(-)定義為蛋白陰性，(+～)定義為蛋白陽性[5]。

1.3.2細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代 顯微鏡觀察細(xì)胞生長密度，融合率達(dá)80%～90%時(shí)，吸去培養(yǎng)基，PBS緩沖液沖洗2次。加入1 mL胰蛋白酶液，置于37 ℃培養(yǎng)箱，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞收縮變圓時(shí)，加入2 mL培養(yǎng)基中止消化。輕輕吹打待細(xì)胞脫落，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，1 000 r/min×5，棄上清，2 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入5 mL培養(yǎng)基，5%CO237 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3MED27siRNA轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染siRNA，具體操作過程如下：按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的方法培養(yǎng)H460，轉(zhuǎn)染前將對數(shù)生長的細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長到融合度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染前用無血清的培養(yǎng)基分別稀釋MED27siRNA和Lipofectamine 2000，混勻，在室溫下靜置5～10 min后；用無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2～3次后補(bǔ)加2～3 mL培養(yǎng)基，將之前混勻好的轉(zhuǎn)染混合試劑加入到培養(yǎng)板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6～8 h后棄去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，加入新鮮的含血清不含雙抗的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 取對數(shù)期生長的H460細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染對照和特異性的MED27siRNA 48 h以后，計(jì)數(shù)細(xì)胞：每100 μL細(xì)胞數(shù)為1 000～2 000個(gè)，加入到96孔板中，48 h以后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h，酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(A)值。

1.3.5遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 劃痕實(shí)驗(yàn)：先用Marker筆在6孔板背后，采用直尺均勻劃得橫線，每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔。在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過夜；當(dāng)細(xì)胞鋪滿，用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜，用PBS洗細(xì)胞2～3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染MED27siRNA 6～8 h，換正常培養(yǎng)基，放入37 ℃培養(yǎng)，按0、48 h取樣，拍照。Transwell實(shí)驗(yàn)：小室上層加入1 mg/mL的基質(zhì)膠20 μL后自然晾干，下層加入含20%血清的500 μL DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分別計(jì)數(shù)，用100 μL不含血清的培養(yǎng)基重旋3×106個(gè)細(xì)胞，加入到小室上層，小室在24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛固定10 min后，用0.1%的結(jié)晶紫染色30 min后，倒置顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)。

1.3.6Western blot實(shí)驗(yàn) MED27siRNA轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，RIPA裂解法提取蛋白，收集細(xì)胞總蛋白先進(jìn)行定量，然后進(jìn)行電泳，電泳完成后采用濕法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫下孵育封閉1.5～2 h，加入用抗體稀釋液稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，用TBST漂洗，重復(fù)3次，每次10～15 min，加入HRP標(biāo)記的二抗在室溫下孵育2 h，用TBST漂洗10 min×3次，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影后進(jìn)行機(jī)器曝光，采用相關(guān)圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，測定灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照。

2 結(jié)果

2.1MED27在肺癌組織中的表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示，70例肺癌組織中MED27的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(圖1)。70例肺癌組織中，MED27的陽性率為87.1%(61/70)，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，MED27表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(χ2=9.438，P=0.002，P<0.05，表1)，與患者性別(χ2=0.809，P=0.369)、年齡(χ2=0.282，P=0.595)、腫瘤T分期(χ2=0.001，P=0.968)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P>0.999)等無相關(guān)性(P>0.05，表1)，以上結(jié)果提示，MED27可能是肺癌的潛在標(biāo)志物。

2.2MED27在人支氣管上皮細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中的表達(dá)以人支氣管上皮細(xì)胞HBE為對照，通過Western blot法檢測MED27在不同肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)。結(jié)果顯示，MED27在肺癌細(xì)胞系H1437、A549、H1299、H460中的表達(dá)水平顯著高于HBE細(xì)胞，表明MED27在不同類型肺癌細(xì)胞系中均異常高表達(dá)(P<0.05,圖2)。

AB

圖1MED27的表達(dá)：A.肺癌組織；B.癌旁組織，SP法

圖2MED27在不同肺癌細(xì)胞系和正常細(xì)胞中的表達(dá)：A.電泳圖；B.直方圖

表1 MED27表達(dá)與肺癌臨床病理特征的相關(guān)性

2.3沉默MED27對H460肺癌細(xì)胞增殖的影響鑒于MED27在H460細(xì)胞中表達(dá)量最高，且易轉(zhuǎn)染，因此選擇H460細(xì)胞作為后續(xù)研究對象。在轉(zhuǎn)染MED27siRNA 48 h以后，通過Western blot法檢測H460細(xì)胞中MED27的蛋白水平發(fā)現(xiàn)MED27的沉默成功(圖3A)。進(jìn)一步通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，沉默MED27可明顯抑制H460肺癌細(xì)胞的增殖(P<0.05，圖3B)。

2.4沉默MED27對H460肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響采用劃痕實(shí)驗(yàn)于0、48 h分別檢測沉默MED27對H460肺癌細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，MED27沉默后，H460肺癌細(xì)胞的遷移能力明顯降低(P<0.05)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示，MED27沉默組的侵襲能力同樣顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示沉默MED27的表達(dá)可明顯抑制H460細(xì)胞的遷移(圖4A)和侵襲能力(圖4B)。

圖3 H460細(xì)胞轉(zhuǎn)染MED27siRNA后MED27的表達(dá)水平(A)及對細(xì)胞活力的影響(B)

圖4 沉默MED27的表達(dá)對H460細(xì)胞遷移(A)和侵襲(B)的影響

2.5MED27調(diào)控H460細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示：與siCtrl組相比，MED27siRNA組抑制了遷移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)，同時(shí)抑制了侵襲相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)，而E-cadherin的負(fù)性調(diào)控蛋白Snail的表達(dá)水平明顯升高(圖5)。

圖5 MED27沉默調(diào)控遷移(A)、侵襲(B)相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

隨著醫(yī)療水平的不斷提高，肺癌的治療手段也日益豐富，已發(fā)展為手術(shù)為主，化學(xué)藥物、放射、免疫等治療手段為輔的綜合性治療[9-11]，但仍未達(dá)到令人滿意的預(yù)后。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的飛速發(fā)展，隨著腫瘤生物治療研究的不斷加深和進(jìn)步，基因治療現(xiàn)已成為肺癌治療的一種新模式，而理想的靶基因選擇則成為研究的熱點(diǎn)。鑒于各種人類腫瘤中一些中介復(fù)合物亞基(MED)的突變或過表達(dá)的出現(xiàn)，MED家族蛋白已在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮越來越重要的作用，如MED1和MED15在前列腺癌中異常高表達(dá)[12-13]，MED12的突變在子宮平滑肌肉瘤和結(jié)腸癌中是不良預(yù)后因素[14]。

MED27的研究尚處于起步階段，關(guān)于其和腫瘤的相關(guān)性更是少之又少。前期研究發(fā)現(xiàn)，抑制MED27的表達(dá)可以抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)MED27可以調(diào)控腫瘤相關(guān)因子iNOS的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8]。因此，MED27可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。

總之，實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明MED27在肺癌組織和細(xì)胞中均異常高表達(dá)，且MED27的表達(dá)水平和肺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，提示其可能影響肺癌的發(fā)生、發(fā)展。為此，通過細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默MED27的表達(dá)能夠明顯抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而復(fù)發(fā)和早期轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其預(yù)后不良的主要因素，暗示MED27在肺癌中可能作為一種新的促癌不良因子，參與肺癌的進(jìn)程。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果為深入進(jìn)行MED27的研究提供線索，發(fā)現(xiàn)了一種潛在的肺癌診斷和判斷預(yù)后的新標(biāo)志物，有助于深入認(rèn)識肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子改變，但是MED27在肺癌中的臨床意義有待于進(jìn)一步探索。

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ExpressionofMED27inlungcancertissuesandcellsanditssignificance

ZHU Xiao-jing1, XU Peng-fei2, CAO Yan2, XIE Kai-peng2, TANG Ran-ran2

(1DepartmentofPathology,JiangsuProvinceHospitalofIntegratedChineseandWesternMedicine,Nanjing210028,China;2MedicalResearchCenter,MaternityHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210004,China)

PurposeTo investigate the expression level of MED27 in lung cancer tissue samples and lung cancer cell lines and to further study the biological function of MED27 in lung cancer cells.MethodsImmunohistochemistry and Western blot were used to detect MED27 expression in 70 lung cancer tissues and 5 different lung cancer cell lines, and the correlation between MED27 expression and gender, age as well as PTNM was also analyzed. The silence sequence of MED27 was designed by the siRNA technique. Western blot was used to detect the silence efficiency of MED27. The proliferation, migration and invasion ability of cells were assessed by CCK-8 assay, Scratch assay and Transwell assay after the MED27 was knocked down. Western blot was used to detect the expression of protein involved in the cell proliferation, migration and invasion.ResultsThe results of immunohistochemistry and Western blot showed that MED27 expression was higher in lung cancer tissues and cells (P<0.05). The expression of MED27 was positively correlated with lymph node metastasis (χ2=9.438,P=0.002,P<0.05). However, it was not related with gender, age, tumor size and distant metastasis (P>0.05). The knockdown of MED27 by MED27 specific siRNA could inhibit the proliferation, migration and invasion of H460 cells (P<0.05). The expression of MMP-2 and MMP-9 involved in the cell migration that were significantly inhibited in H460 cells transfected by MED27 siRNA, and the expression of E-cadherin, related with cell invasion was also decreased, while E-cadherin negative regulatory protein Snail was increased.ConclusionMED27 is highly expressed in lung cancer tissues and cells and high expression of MED27 predicts poor prognosis in lung cancer patients. The knockdown of MED27 inhibits the proliferation, migration and invasion ability of lung cancer cells. All of the above results suggest that MED27 is expected to be a candidate target of lung cancer gene therapy.

lung neoplasms; MED27; migration; invasion

R 734.2

A

1001-7399(2017)10-1086-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.006

肺癌已經(jīng)成為男性發(fā)病率和病死率最高的腫瘤之一[1]，目前認(rèn)為吸煙是肺癌最重要的高危因素[2]，除此之外，各種化合物、電離輻射、既往肺部感染、遺傳等因素也是導(dǎo)致肺癌的主要原因[3-4]。

時(shí)間：2017-10-23 13:30 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.006.html

接受日期：2017-08-13

國家自然科學(xué)青年基金(81702831、81402139)

1江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科，南京 210028

2南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，南京 210004

朱曉靜，女，主治醫(yī)師。E-mail: zhuxiaojing0331@163.com

唐冉冉，男，碩士，助理研究員。E-mail: 13190186401@163.com