龍冬玲,韋潔宏,吳勁松,郝紅雨,蔣淑萍,黎劍華,卓 菲

深圳地區(qū)四家醫(yī)院感染性腹瀉來源沙門菌耐藥性及分子分型研究

龍冬玲1,韋潔宏2,吳勁松3,郝紅雨4,蔣淑萍5,黎劍華1,卓 菲1

目的分析2012-2016年深圳地區(qū)感染性腹瀉沙門菌耐藥狀況及分子型別特征,為沙門菌感染防控提供科學依據(jù)。方法收集深圳地區(qū)四家醫(yī)院的137株沙門菌，傳統(tǒng)血清學方法鑒定沙門菌血清型，微量肉湯稀釋法測定菌株藥物敏感性，脈沖場凝膠電泳(PFGE)對鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌作分子同源性分析。結果137株沙門菌可分為30種菌型，鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌是本地優(yōu)勢菌型。菌株對鏈霉素、氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸鉀耐藥最為嚴重，對青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類、大環(huán)內酯類抗生素的耐藥呈逐年增高的趨勢。49株鼠傷寒沙門菌經脈沖場凝膠電泳可獲得38種帶型，相似度65.5%～100%，TY18為優(yōu)勢帶型；27株腸炎沙門菌經脈沖場凝膠電泳可獲得9種帶型，相似度61.8%～100%，EN7為優(yōu)勢帶型。結論感染性腹瀉來源沙門菌耐藥狀況比較嚴重，菌株PFGE帶型多樣化，呈高度散發(fā)，部分帶型與其耐藥譜之間具有一定的聚集與關聯(lián)性。

沙門菌；耐藥特征；脈沖場凝膠電泳

沙門菌是一種在公共衛(wèi)生學上具有重要意義的人獸共患病病原菌，是引起人類感染性腹瀉和食物中毒最為常見的腸道致病菌之一，至今已有2 523種血清型被發(fā)現(xiàn)[1]。據(jù)統(tǒng)計，在全球范圍內每年約有1 600萬人受沙門菌感染，其中60萬人死亡[2]。近年來，因抗生素在農業(yè)、畜牧業(yè)和臨床治療中的廣泛使用導致病原菌的耐藥性逐步增強，沙門菌的多重耐藥率從20世紀90年代的20%增加到本世紀的70%[3]。雖然沙門菌腸道感染多是自限性疾病，但鑒于沙門菌在感染性腹瀉中的重要性及在多重耐藥方面的嚴峻性，本研究對分離自深圳地區(qū)四家醫(yī)院腹瀉人群的沙門菌進行藥敏實驗，并結合PFGE對菌株進行分子同源性分析，為指導沙門菌病的防控和食物中毒暴發(fā)溯源提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株 標本分離自深圳市四家腸道門診醫(yī)院，分別為深圳市人民醫(yī)院、深圳市第五人民醫(yī)院、遠東婦幼保健院、深圳羅湖區(qū)婦幼保健院。其中深圳市人民醫(yī)院和深圳市第五人民醫(yī)院是市級腸道哨點監(jiān)測醫(yī)院，其余為轄區(qū)醫(yī)院。其中2012年分離23株、2013年29株、2014年29株、2015年33株、2016年23株。

1.2試劑和儀器 TTB、SC增菌液、三糖鐵、XLD培養(yǎng)基，Swarm Agar瓊脂(北京陸橋生物制品有限公司)、沙門菌顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉)、沙門菌診斷血清(丹麥SSI公司)，MicroScan WalkAway-40全自動細菌鑒定分析儀及配套試劑(美國貝克曼公司)，微量肉湯稀釋法藥敏檢測板(上海星佰生物技術公司)，Seakem Gold 瓊脂糖(美國Rockland)，蛋白酶K(德國Merck)，限制性內切酶XbalI(美國NEB)，脈沖場凝膠電泳儀(美國BIO-RAD CHEF Mapper)；凝膠成像系統(tǒng)(美國SYNGENE，G.BOX)；DENSIMAT濁度計(法國BioMerirux)；BioNumercs圖像分析軟件(比利時)。所有試劑均驗收合格并在有效期內使用。

1.3菌株鑒定 參照國家標準GB 4789.4-2010《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》[4]及WS271—2007《感染性腹瀉診斷標準》[5]執(zhí)行，醫(yī)院上送的可疑菌株經SC、TTB增菌，采用沙門顯色平板、XLD平板分離，挑選可疑菌落轉種TSI，全自動生化鑒定系統(tǒng)鑒定為沙門菌屬后采用沙門診斷血清作O抗原凝集，采用Swarm agar瓊脂作H抗原誘導和血清凝集試驗，生理鹽水作鹽水對照。菌型判定根據(jù)Kauffman-White血清分型表確定。

1.4藥敏實驗 依據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)推薦的抗菌藥物敏感性實驗執(zhí)行標準M100-S20，采用微量肉湯稀釋法對環(huán)丙沙星(CIP)、鏈霉素(STR)、氨芐西林(AMP)、氯霉素(CHL)、磺胺異噁唑(SUL)、復方新諾明(SXT)、奈啶酸(NAL)、阿莫西林/克拉維酸鉀(AMC)、頭孢曲松(CRO)、慶大霉素(GEN)、四環(huán)素(TCY)、頭孢西丁(FOX)、頭孢吡肟(FEP)、強力霉素(DOX)、阿奇霉素(AZI)、亞胺培南(IMP)16種不同類別的抗生素進行試驗。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.5PFGE分型 參照美國CDC Pulse Net實驗室使用的沙門菌標準分型方法，對137株沙門菌進行分子分型，電泳條件：電壓6.0V/cm，脈沖參數(shù)2.2-63.8 s，電泳18.5 h。用BioNumerics 6.0軟件對電泳圖譜作數(shù)據(jù)分析，繪制聚類分析樹狀圖，聚類算法為非加權配對平均法(UPGMA)，電泳條帶位置優(yōu)化度設為1.5%，相似度為100%認定為同一PFGE帶型。PFGE分子標準布倫登盧普沙門菌H9812由深圳市疾病預防控制中心饋贈。

2 結 果

2.1流行特征 收集到的137株沙門菌中，男女比例為1.3∶1(78/59)，男性患者比例稍高于女性患者；其中0～5歲兒童共分離84株，占總體的61.3%(84/137)，在季節(jié)分布上以每年的5-10月為主，其中2-4月份共分離得24株，5-7月份44株，8-10月份48株，剩下月份21株，具有較典型的夏秋季特征。

2.2菌型分布 137株沙門菌共可分為30種菌型。鼠傷寒沙門菌單相變種(抗原式O4+；O5+；O12+；Hi+；H2-)在統(tǒng)計分析時統(tǒng)稱為鼠傷寒沙門菌，有7株菌無法分型。血清型分布排名前三名的分別為鼠傷寒沙門菌(49株)、腸炎沙門菌(27株)、斯坦利沙門菌(9株)。鼠傷寒沙門菌腸炎沙門菌是本地區(qū)的優(yōu)勢血清型，共分離得76株，占總體的55.5%(76/137)。

2.3藥敏試驗 137株沙門菌中，除2株菌對16種測試藥物完全敏感，其他菌株均對1種以上測試藥物耐藥，其中耐3種以上測試藥物的菌株有78株(60%)，耐10種以上測試藥物的菌株有29株(22.3%)。菌株對鏈霉素、氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸鉀的耐藥最為嚴重，耐藥率依次為86.1%、62.8%、62.8%。目前臨床治療嚴重腸道感染沙門菌以喹諾酮類抗生素和頭孢類抗生素為主。本次試驗中，菌株對一代喹諾酮類藥物奈啶酸和三代氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星的耐藥率分別為43.8%和13.9%，對三代頭孢類抗生素頭孢曲松、頭孢吡肟的耐藥率依次為22.6%和13.1%。2012-2016年間，沙門菌對氨芐西林、氯霉素、阿莫西林/克拉維酸鉀、慶大霉素、阿奇霉素及頭孢吡肟的耐藥率呈逐年增高的趨勢，見圖1。

圖1 2012-2016年137株沙門菌對測試藥物的耐藥變化Fig.1 Antibiotic resistance changes of 137 Salmonella strains to antibiotics from 2012 to 2016

注：藥敏結果中黑色框代表耐藥，灰色框代表中介，白色框代表敏感。Emteritidis為腸炎沙門菌。圖3 27株腸炎沙門菌聚類分析及耐藥譜Fig.3 PFGE clustering analysis and drug resistance spectrum of 27 S. enteritidis strains

2.4PFGE分型：對優(yōu)勢菌型鼠傷寒沙門菌及腸炎沙門菌進行脈沖場凝膠電泳分型分析。49株鼠傷寒沙門菌經XbalI酶切可分為38種PFGE帶型，每種帶型包含菌株數(shù)1～6株不等，相似度63.5%～100%，其中帶型TY18包含6株菌，為此血清型的優(yōu)勢帶型。27株腸炎沙門菌經XalI酶切可獲得9種PFGE帶型，每種帶型包含菌株數(shù)1～16株不等，相似度61.8%～100%，其中EN7帶型有16株菌，為腸炎沙門菌的優(yōu)勢帶型，PFGE聚類分析見圖2、圖3。此外，PFGE帶型與其耐藥譜之間關系復雜，具有一致性，也有特殊性。帶型相同的菌株中往往存在相同的耐藥譜，如鼠傷寒沙門菌TY18帶型中的SAL142、148、156、189 耐藥譜相同；腸炎沙門菌優(yōu)勢帶型EN7帶型中有7株菌(SAL172、174、212、258、259、260、261)耐藥譜相同。從型間分析，不同帶型之間也存在耐藥譜相同的情況，如鼠傷寒沙門菌中的SAL228、129、111、142和腸炎沙門菌中的SAL284、292、230。單株帶型的菌株也可出現(xiàn)相同的耐藥譜。

注：藥敏結果中黑色框代表耐藥，灰色框代表中介，白色框代表敏感。Typhimurium為鼠傷寒沙門菌。圖2 49株鼠傷寒沙門菌聚類分析及抗生素耐藥譜Fig.2 PFGE clustering analysis and drug resistance spectrum of 49 S. typhimurium strains

3 討 論

經2012-2016年對深圳地區(qū)四家腸道門診醫(yī)院感染性腹瀉來源沙門菌的流行特征分析發(fā)現(xiàn)，沙門菌的分離具有典型的夏秋季特征，深圳地區(qū)屬于亞熱帶氣候，5-10月氣溫均處于較高水平，天氣炎熱，有利于腸道致病菌的增殖，故夏秋季分離率明顯高于其他季節(jié)。從菌株來源的人群分布可知，嬰幼兒感染沙門菌的比例最高，一方面與嬰幼兒自身免疫系統(tǒng)未發(fā)育完善，病情重，家長不會擅自給孩子服用抗生素，而是快速尋醫(yī)有關，另一方面源于本次研究涉及的四家醫(yī)院有兩家為婦幼保健院，嬰幼兒患者的例數(shù)較多有關。鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌是沙門菌腸道感染的優(yōu)勢菌型，此監(jiān)測結果與中國其他地區(qū)[6]、亞洲[7]、歐洲[8]的研究結果相一致。除去優(yōu)勢菌型，深圳地區(qū)分離的其他沙門菌血清型分布廣泛，種類繁多，有研究報道德比沙門菌、阿貢納沙門菌、山夫登堡沙門菌在河南[9]、武漢[10]、上海[11]等地有明顯的流行趨勢，這些血清型在深圳地區(qū)均不常見，提示沙門菌型別的分布具有很強的地域特征，人群感染沙門菌的菌型分布具有廣泛性，但在具體區(qū)域具有特殊性。

目前臨床治療沙門菌腸道感染首選喹諾酮類和三代頭孢菌素類抗生素。本次研究中，菌株對頭孢曲松的耐藥率高達23.3%，對頭孢吡肟的耐藥率為13.1%，此結果均高于國內以往的研究結果[12-13]。此外，菌株對喹諾酮抗生素奈啶酸及環(huán)丙沙星的敏感率已降至56.2%和45.9%，這與喹諾酮類藥物在國內畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)不合理使用，過度濫用等因素密切相關。由本次藥敏試驗結果可看出，深圳地區(qū)沙門菌的耐藥問題十分嚴峻，菌株對8類16種抗生素存在不同程度的耐藥，比較嚴重的有青霉素類、四環(huán)素類和磺胺類藥物。結合抗生素耐藥趨勢結果發(fā)現(xiàn)，菌株對青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類、大環(huán)內酯類抗生素的耐藥呈逐年增高的趨勢，耐藥數(shù)據(jù)結果表明深圳地區(qū)沙門菌的耐藥形勢非常嚴峻，臨床上喹諾酮類和頭孢類耐藥菌株的出現(xiàn)，不僅為病人治療、疾病預防控制帶來困難，甚至易導致耐藥菌株引起的食源性疾病的暴發(fā)。因此，持續(xù)性開展沙門菌血清型分布及耐藥監(jiān)測，及時分析分享數(shù)據(jù)，有益于指導農業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)療部門合理使用抗生素，減緩耐藥菌株出現(xiàn)的速度，減輕社會和患者的經濟負擔。

脈沖場凝膠電泳(PFGE)是近年來快速發(fā)展起來的一種病原菌分子分型技術，依托此項技術可快速鑒別細菌間的同源性，對于細菌性傳染病監(jiān)測、傳染源追蹤、傳播途徑調查及在暴發(fā)事件調查中有著非常重要的意義。本研究利用該技術對優(yōu)勢菌型鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌進行分子同源性分析，積累了本地區(qū)沙門菌分子流行病學的基線數(shù)據(jù)，成功建立起沙門菌PFGE指紋圖譜，為往后與其他地區(qū)開展分子流行病學比對調查和暴發(fā)溯源提供科學依據(jù)。采用XbaI酶切，49株鼠傷寒沙門菌分成38種帶型，表現(xiàn)出菌株的遺傳多態(tài)性；分析優(yōu)勢帶型TY18的菌株，菌株的分離時間分散，沒有聚集性病例的出現(xiàn)，提示鼠傷寒沙門菌的感染高度散發(fā)。通過對PFGE圖譜和耐藥譜之間的比對，相同耐藥表型的菌株存在相同的PFGE帶型，兩者呈現(xiàn)聚類一致性，提示基于共同暴露源的菌株可能具有相同的基因和耐藥表型特征[14]；然而也存在不同耐藥表型的菌株卻有相同的PFGE帶型，說明分子帶型與耐藥譜之間的聯(lián)系也存在差異性與不確定性，兩者之間的流行病學關系、基因遺傳關系尚待進一步的研究。

(致謝：感謝深圳市感染性腹瀉哨點監(jiān)測項目及深圳市疾病預防控制中心扈慶華、李迎慧、石曉路老師的支持與幫助。)

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CharacteristicsofdrugresistanceandmoleculartypingforSalmonellaindiarrheapatientsfromfourhospitalsinShenzhen

LONG Dong-ling1, WEI Jie-hong2, WU Jing-song3, HAO Hao-yu4, JIANG Shu-ping5, LI Jian-hua1, ZHUO Fei1

(1.LuohuDistrictCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenzhen518020,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,theFifthPeople’sHospitalofShenzhen,Shenzhen518020,China;3.DepartmentofLaboratoryMedicine,ShenzhenPeople’sHospital,Shenzhen518020,China;4.DepartmentofLaboratoryMedicine,ShenzhenYuandongMaternityandChildHealthcareHospital,Shenzhen518020,China;5.DepartmentofLaboratoryMedicine,ShenzhenLuohuMaternityandChildHealthcareHospital,Shenzhen518020,China)

We analyzed the antimicrobial resistance and pulsed field gel electrophoresis(PFGE) patterns ofSalmonellastrains of infectious diarrhea isolated four hospitals in Shenzhen during 2012-2016. A total of 137Salmonellastrains collected in 4 hospitals in Shenzhen were identified by serotyping, micro-dilution method was used to detect the antimicrobial susceptibility of the isolates. Pulsed field gel-electrophoresis(PFGE) was used for molecular typing and cluster analysis ofS.typhimuriumandS.entericastrains. Results showed that 137 strains ofSalmonellawere divided into 30 kinds of serotype.S.typhimuriumwas the predominant serotype. The drug susceptibility test indicated that the antibiotic resistance of the strains to chloromycetin, ampicillin and amoxicillin were more serious than other drugs, the resistance to penicillins, cephalosporins, aminolycosides and macrolides showed increase trends year by year. Of 49 strains ofS.typhimuriumwere divided 38 molecular patterns by PFGE, with similarity ranged from 65.5%-100%, TY18 was the main PFGE pattern. The 27 strains ofS.entericawere divided into 7 molecular patterns by PFGE, with similarity ranged from 61.8%-100%, EN7 was the main PFGE pattern. The status of drug resistance of infectious diarrhea isolates was rather severe, PFGE patterns showed diversity, suggesting the diarrhea cases were distributed sporadically. Partial PFGE patterns and its corresponding antidrug spectrum have certain aggregation relationship.

Salmonella; antimicrobial resistance character; pulsed field gel-electrophoresis

Zhuo Fei, Email: diedrelong@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.10.009

深圳羅湖區(qū)軟科學研究計劃項目(No.2015035)資助

卓菲，Email:diedrelong@126.com

1.深圳市羅湖區(qū)疾病預防控制中心，深圳 518020；

2.深圳市第五人民醫(yī)院檢驗科，深圳 518020；

3.深圳市人民醫(yī)院檢驗科，深圳 518020；

4.深圳市遠東婦幼保健院檢驗科，深圳 518020；

5.深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院檢驗科，深圳 518020

378

A

1002-2694(2017)10-0897-06

Supported by the Shenzhen Luohu District Research Project of Soft Science (No. 2015035)

2017-06-26編輯李友松