藺旭光，李佳怡，牛天明，娜仁圖雅，劉 鍇，2

一株豬肺炎木糖氧化桿菌分離鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

藺旭光1，李佳怡1，牛天明1，娜仁圖雅1，劉 鍇1，2

目的鑒定豬群體性肺部感染的病原菌。方法采用生化鑒定、小白鼠致病性試驗(yàn)、16S rRNA PCR鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果根據(jù)生化鑒定、小白鼠致病性試驗(yàn)及16S rRNA PCR鑒定。結(jié)果表明該菌為一株具有一定毒力的木糖氧化無色桿菌，同源性分析該菌與KF879922.1相似性為99.9%，命名為TLSY-1。結(jié)論該菌的鑒定將為仔豬肺炎病原鑒定提供新的依據(jù)。

木糖氧化無色桿菌；病原菌；進(jìn)化樹分析；仔豬

木糖氧化無色菌(Achromobacterxylosoxidans)是Alcaligenaceae家族的無色桿菌屬的革蘭氏陰性能動(dòng)桿菌，該種屬還包括拉氏無色桿菌，皮氏無色桿菌，脫硝無色桿菌，少見無色桿菌和稀有無色桿菌廣泛存在于水生環(huán)境中，可引起機(jī)會(huì)性感染，特別容易引起免疫受損的動(dòng)物發(fā)病[1-2]。該菌也可與其他細(xì)菌混合感染使動(dòng)物發(fā)病，可引起動(dòng)物的肺炎、菌血癥及化膿性腦膜炎等疾病。該致病菌致死率不高，可因污染的水源、飼料以及患病動(dòng)物的排泄物感染動(dòng)物發(fā)病。然而木糖氧化無色桿菌在畜牧業(yè)的相關(guān)報(bào)道資料并不多，本研究主要通過微生物診斷該分離菌為木糖氧化無色桿菌。為今后的豬肺炎診斷鑒別提供新的參考。

1 材料與方法

1.1主要試劑 營養(yǎng)瓊脂、瓊脂粉、氯化鈉、葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉(北京澳博星有限責(zé)任公司)；質(zhì)粒提取試劑盒、Jm109感受態(tài)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒、Taq酶、MgCl2、dNTPs、RxnBuffer、18T-Vactor載體(TaKaRa有限責(zé)任公司)、TAE，EB染色液(納川)

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 低溫離心機(jī)(eppendorf有限責(zé)任公司)，生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、PCR儀、恒溫?fù)u床(Thermo有限責(zé)任公司)、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad有限責(zé)任公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重20～25 g健康小白鼠40只，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1病料采集及觀察 對通遼某豬場患病豬觀察發(fā)病癥狀并記錄，病亡后30 min內(nèi)采集心、肝、脾、肺、腎、十二指腸及淋巴結(jié)等臟器，記錄各臟器的病理變化。各臟器觸片革蘭氏染色后鏡檢并記錄。

1.4.2致病菌的分離與純化 取心、肝、脾、肺、腎、十二指腸及淋巴結(jié)在無菌操作下分別接種在10%血液瓊脂培養(yǎng)基上，于厭氧缸內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，置于恒溫?fù)u床上37 ℃ 24 h純培養(yǎng)。取培養(yǎng)物涂片染色鏡檢。

1.4.3生化試驗(yàn) 挑取血液瓊脂培養(yǎng)基上生長良好的單個(gè)菌落，接種于微量發(fā)酵管中，37 ℃培養(yǎng)16 h后觀察結(jié)果。

1.4.4動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn) 將已純化的菌種在LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，細(xì)菌計(jì)數(shù)，用LB培養(yǎng)基將菌液稀釋至1.0×109/mL。純化的菌液腹腔注射20只小鼠，每只小鼠注射0.5 mL。另選20只注射生理鹽水作對照組，24 h內(nèi)每5 h觀察一次結(jié)果。

1.4.516S rRNA的PCR鑒定 取菌液參考DNA提取試劑盒，提取菌液DNA，冷凍保存?zhèn)溆?，使用時(shí)取出，PCR引物根據(jù)參考文獻(xiàn)[3-6]由大連寶生物合成。

表1 PCR引物序列
Tab.1 Primer sequence

引物序列Primersequence5′—3′擴(kuò)增目的片段大小/bpTargetfragment27FAGAGTTTGATCCTG?GCTCAG13691429RGGTTACCTTGT?TACGACTT

反應(yīng)體系試劑MgCl22 μL,Rxn Buffer2 μL,上引物1 μL下引物1 μLTaq酶1 μL模板2 μ,dd H2O補(bǔ)齊至25 μL,反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s 退火55 ℃ 30 s 延伸72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)后將取PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠下電泳90V、30 min，EB染色觀察結(jié)果。將目的片段使用DNA純化試劑盒純化回收，用18T-Vactor T載體16 ℃反應(yīng)過夜，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)JM109中，均勻涂布于X-Gal選擇培養(yǎng)基(含Amp、IPTG及X-Gal)37 ℃培養(yǎng)16 h。挑取陽性菌落接種于含有Amp的LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)過夜用質(zhì)粒提取試劑盒提質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確后送至長春某測序公司測序。

1.4.6同源性及進(jìn)化樹分析 將測序結(jié)果在GeneBank進(jìn)行Blast。選取同源性相近的幾條序列，用DANMAN V6軟件對選取的序列進(jìn)行編輯，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1病料及致病菌形態(tài)學(xué)觀察 患病豬外觀可見皮毛發(fā)暗，病豬精神沉郁，食欲減退，不喜運(yùn)動(dòng)，躺臥。鼻口有淡綠色黏液樣物質(zhì)流出，呼吸困難，伴有輕微咳嗽，流涎，聽診肺部有濕羅音。體溫升高，眼結(jié)膜潮紅。剖檢可見胸腔有膿性積液，肺部有肉樣病變，觸之有捻發(fā)音。會(huì)厭軟骨有潰瘍點(diǎn)，氣管有出血點(diǎn)并有白色泡沫樣液體，心包積液較為嚴(yán)重，心臟內(nèi)壁有針尖狀出血點(diǎn)，脾臟邊緣有梗死及出血點(diǎn)。十二指腸黏膜有出血，腸壁較厚。腹股溝淋巴結(jié)、下頜淋巴結(jié)以及大網(wǎng)膜淋巴結(jié)有腫大。

在內(nèi)臟觸片染色鏡檢可見有革蘭氏陰性短桿菌，散落存在，偶見成對出現(xiàn)。在血液瓊脂培養(yǎng)基上生長成灰白色菌落，表面濕潤光滑且邊緣整齊。

2.2生化試驗(yàn)結(jié)果 氧化酶(+)觸酶(+)枸櫞酸鹽(+)乙酰胺酶(+)麥芽糖(-)甘露醇(-)DNA酶(-)蔗糖(-)尿素酶(-)

2.3動(dòng)物致病性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組20只小鼠在24 h內(nèi)死亡12只，而對照組正常.死亡小鼠心和肝臟觸片革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陰性短桿菌，與患病豬內(nèi)臟觸片的觀察結(jié)果相似。

2.416S rRNA PCR鑒定結(jié)果 PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，將凝膠在凝膠分析系統(tǒng)下觀察結(jié)果，在1 000～2 000 bp處有一條清晰帶，與預(yù)期的大小相一致。經(jīng)測序后PCR產(chǎn)物大小為1 389 bp。

測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行同源性比對，結(jié)果與木糖氧化無色桿菌同源性達(dá)99%(序列號gb|KF879922.1)，該結(jié)果充分證明病死豬的致病菌為木糖氧化無色桿菌。

圖1 會(huì)厭軟骨潰瘍點(diǎn) 圖2 豬肺臟病變 圖3 分離細(xì)菌鏡檢照片(400×)Fig.1 Epiglottis ulcer point Fig.2 Porcine lung disease Fig.3 Isolate bacterial microscopic photographs

1：目的帶；2：DNA Marker DL 2 0001: Purpose band; 2: DNA Marker DL 2000圖4 木糖氧化無色桿菌16S rRNA PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.4 16S rRNA PCR result of Achromobacter xylosoxidans

圖5 木糖氧化無色桿菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of Achromobacter xylosoxidans

2.5木糖氧化無色桿菌系統(tǒng)進(jìn)化樹同源性分析 經(jīng)16S rRNA鑒定的菌株在NCBI同源性比對后，與木糖氧化無色桿菌的同源性達(dá)99%。選取序列相近的序列經(jīng)過系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析，測序序列與線蟲體內(nèi)分離的木糖氧化無色桿菌的同源性達(dá)99.9%，與牛體內(nèi)分離的菌種同源性達(dá)99.8%。并且與自然界中泥沙、水源、植物等有很高的同源性，均能達(dá)到99%以上。且所有選取構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的序列綜合一致性達(dá)91.76%。

3 討 論

本試驗(yàn)從病死豬肺臟內(nèi)分離出疑似仔豬感染發(fā)病致病菌，通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)菌的分離培養(yǎng)及純化、生化試驗(yàn)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)、16S rRNA的分子生物學(xué)試驗(yàn)以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析等一系列鑒定方法，證明從患病死豬體內(nèi)分離出的致病菌為木糖氧化無色桿菌。

木糖氧化無色桿菌，原名產(chǎn)堿桿菌木糖氧化無色桿菌，是一種有氧，非發(fā)酵，革蘭陰性桿菌具有低毒力[7]。它最早于1971年被 Yabuuchi 和Ohyama在一位慢性炎癥中耳炎患者的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[8]。木糖氧化無色桿菌屬于機(jī)會(huì)致病菌，并可存在于多種臨床標(biāo)本，如耳分泌物、血液、尿液等，可引起菌血癥，敗血癥，呼吸系統(tǒng)感染等[9]。木糖氧化無色桿菌引起動(dòng)物患病的病例并不多，畜牧業(yè)的相關(guān)資料甚少，但在畜牧業(yè)的日常預(yù)防中也不能忽視，需要相關(guān)工作人員引起重視。當(dāng)動(dòng)物感染該菌發(fā)病時(shí)主要以肺炎癥狀為特異性臨床表現(xiàn)，有呼吸困難、流涎、體溫升高等癥狀。剖檢可見肺部病理變化明顯，有間質(zhì)性肺炎、敗菌癥。發(fā)病時(shí)可分離致病菌后做藥敏來選擇有針對性治療的抗生素。木糖氧化無色桿菌的耐藥性較強(qiáng)，能對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性[10]。木糖氧化無色桿菌有β酰胺酶的耐藥基因以及金屬酶能對β酰胺酶類藥物產(chǎn)生耐藥性[11]。

分離鑒定的木糖氧化無色桿菌菌株在進(jìn)化樹的分析下，可見該菌株與線蟲體內(nèi)的木糖氧化無色桿菌相似度最高，其次與氣孔材料以及環(huán)境中的泥土、豆科植物根瘤有較高的相似度?？赏茢嘭i場的患病豬與被線蟲感染有關(guān)，線蟲是豬群較為常見的有危害的寄生蟲之一。線蟲嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物的健康，尤其當(dāng)人體免疫水平下降時(shí)，線蟲大量繁殖，向全身各器官擴(kuò)散，引起人的重度感染，甚至造成人的死亡[12]。因感染豬發(fā)病的致病菌與線蟲中的木糖氧化無色桿菌有很高的相似度，感染豬發(fā)病的致病菌是否是由線蟲體內(nèi)感染的木糖氧化無色桿菌感染，還需要進(jìn)一步去驗(yàn)證。也可能豬舍的環(huán)境中的地面或建材被木糖氧化無色桿菌污染后，感染健康豬群發(fā)病。在平時(shí)預(yù)防時(shí)，需要保持圈舍的通風(fēng)性良好，時(shí)常對圈舍打掃衛(wèi)生以及做好消毒以及驅(qū)蟲工作，可每周一次用新吉爾滅或1%高錳酸鉀對豬舍進(jìn)行消毒并定期給豬驅(qū)蟲。如發(fā)現(xiàn)有發(fā)病豬需要及時(shí)的隔離以及進(jìn)行治療，并對患病豬用過的飲水器食槽等進(jìn)行嚴(yán)格的消毒防治病原菌擴(kuò)散傳播。因目前市場上并沒有相應(yīng)的特異性疫苗，所以也可注射木糖氧化無色桿菌的滅活苗來進(jìn)行免疫，在生產(chǎn)中能有良好的免疫保護(hù)效果。

[1] Chen ZH, Fang HH,Wang L, et al. IMP-1 encoded by a novel Tn402-like class 1 integron in clinicalAchromobacterxylosoxidans, China[J]. Scintific Reports, 2014, 27(4): 7212. DOI: 10.1038/srep07212

[2] Liu C, Zhang DC, Fang XQ. Clinical analysis of elderly patients with hospital-acquired pneumonia caused byAchromobacterxylosoxidans[J]. Clin J Health Care Med, 2011, 16(2): 98-100. (in Chinese)

劉超, 張杜超, 方向群. 木糖氧化無色桿菌所致患者醫(yī)院獲得性肺炎28例[J]. 中華保健醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 16(2)：98-100.

[3] Benítez-Páez A, Portune KJ, Sanz Y. Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinIONTMportable nanopore sequencer[J]. GigaScience, 2016, 5(1): 4. DOI: 10.1186/s13742-016-0111-z

[4] Li LQ, Zhang YY, Liu HC, et al. Evaluation of 16S rDNA sequence method in identification ofNocardiaspecies[J]. Chin J Zoonoses, 2015, 31(11): 1017-1022. DOI:10.3969/j.issn.1002.2694.2011.00(in Chinese)

李璐茜, 張媛媛, 劉海燦, 等. 16S DNA序列在諾卡菌菌種鑒定中的價(jià)值研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2015, 31(11): 1017-1022.

[5] Clarridge JE. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacieria on clinical microbiology and infectious diseases[J]. Clin Microbiol Rev, 2004, 17(4): 840-862. DOI: 10.1128/CMR.17.4.840-862.2004

[6] Dinka M, Benjamín G, Jonathan M, et al. Genomic-based restriction enzyme selection for specific detection ofPiscirickettsiasalmonisby 16S rDNA PCR-RFLP [J]. Front in Mircobiol, 2016, 7(e19135):643.

[7] Lee JH, Lee SY, Park IY, et al. A case of septic shock caused byAchromobacterxylosoxidansin an immunocompetent female patient after extracorporeal shock wave lithotripsy for a ureteral stone[J]. Infect Chemother, 2016, 48(1): 47-50. DOI: 10.3947/ic.2016.48.1.47

[8] Yabuuchi E, Oyama A.Achromobacterxylosoxidansn. sp. from human ear discharge[J]. Jpn J Microbiol，1971, 15: 47781.

[9] Li JZ. The Research advancement ofAchromobacterxylosoxidans[J]. Chin J Clin Lab Sci, 2009, 27(1): 72-73. (in Chinese)

李金鐘. 木糖氧化無色桿菌的研究進(jìn)展[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2009, 27(1): 72-73.

[10] Ghevariya CM, Bhatt JK, Dave BP. Enhanced chrysene degradation by halotolerantAchromobacterxylosoxidansusing response surface methodology[J]. Biorosour Technol, 2011, 102(20): 9688-9676.DOI: 10.1016/j.biortech.2011.07.069

[11] Hu YF, Zhu YY, Ma Y, et al. Genomic insights into intrinsic and acquired drug resistance mechanisms inAchromobacterxylosoxidans[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 2(59): 1152-1159. DOI: 10.1128/AAC.04260-14

[12] Lin H, Yang GY. Strongyloidiasia of human and animals[J]. Chin J Zoonoses, 2016, (05): 477-484,505. DOI:10.3969/j.issn.1002.2694.2016.05.012(in Chinese)

林海, 楊光友. 人和動(dòng)物的類圓線蟲病[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2016, (05): 477-484,505.

IdentificationandphylogeneticanalysisforAchromobacterxyloseOxidasinporcinepneumonia

LIN Xu-guang1, LI Jia-yi1, NIU Tian-ming1,NA Ren-tu-ya1, LIU Kai1,2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,InnerMongoliaUniversityforNationalities,Tongliao028000,China;2.InnerMongoliaBeef&CattleDiseaseControlCenter,Tongliao028000,China)

To identify the pathogen of an outbreak of pneumouia in pig-farm, we used biochemical identification, pathogenicity test in mice, PCR identification by 16S rRNA, and phylogenetic tree analysis for the identification. Results showed that the pathogen was anAchromobacterxylosoxidanswith certain virulence and named TLSY-1. This TLSY-1 was the most similar to KF879922.1, and affinity rate were 99.9% by homology analysis. This result identified that TLSY-1 is a new pneumonia pathogens in piglets.

Achromobacterxylosoxidans; pathogen; phylogenetic analysis; piglets

Liu Kai，Email: liukai721023@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.10.011

內(nèi)蒙古科技廳項(xiàng)目(No.2016MS0310)資助

劉 鍇，Email：liukai721023@163.com

1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，通遼 028000；

2.內(nèi)蒙古自治區(qū)肉牛疾病預(yù)防控制中心，通遼 028000

R378

A

1002-2694(2017)10-0908-04

Supported by the Inner Mongolia Science and Technology Department Program(No.2016MS0310)

2016-12-09編輯張智芳