陳浩浩，李旭升，郭方明，丁明星，胡 野，樓宏強(qiáng)

空腸彎曲菌AhpC蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)及抗原性分析

陳浩浩1,2，李旭升1，郭方明1，丁明星1，胡 野2，樓宏強(qiáng)2

目的利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析空腸彎曲菌AhpC的跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽及B細(xì)胞抗原表位，并分析空腸彎曲菌AhpC優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位的抗原性，為后續(xù)疫苗研究提供依據(jù)。方法使用TMHMM Server V2.0、SignalP 4.1、IEDB等生物信息學(xué)分析軟件對(duì)空腸彎曲菌AhpC進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、信號(hào)肽及線性B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。分別以原核表達(dá)的空腸彎曲菌AhpC蛋白和化學(xué)合成的表位肽為抗原，空腸彎曲菌AhpC抗體為一抗，通過(guò)ELISA及Dot blot對(duì)優(yōu)勢(shì)線性B細(xì)胞抗原表位的抗原性進(jìn)行分析及篩選。結(jié)果生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明AhpC定位于空腸彎曲菌外膜，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，無(wú)信號(hào)肽，同時(shí)該蛋白中存在7個(gè)的B細(xì)胞線性表位。經(jīng)Dot blot和ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中AhpC4-16表位具有較強(qiáng)的抗原性，為優(yōu)勢(shì)表位。結(jié)論空腸彎曲菌AhpC保守存在于細(xì)菌表面，存在1個(gè)優(yōu)勢(shì)的B細(xì)胞線性抗原表位(AhpC4-16)，可用于后續(xù)的疫苗開(kāi)發(fā)研究。

空腸彎曲菌；表位；抗原；烷基過(guò)氧化氫還原酶

空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni,C.jejuni)是革蘭陰性、微需氧的人獸共患病病原菌，主要通過(guò)食物感染引起人類急性腸炎[1]。研究發(fā)現(xiàn)，空腸彎曲菌在肉豬和奶牛帶菌率為10%～30%，肉雞帶菌率高達(dá)60%以上[2]。帶菌動(dòng)物的糞便污染水源和食物后感染人類，?？稍斐杀┌l(fā)流行[3]?？漳c彎曲菌感染性腹瀉發(fā)病率在一些國(guó)家和地區(qū)居細(xì)菌性腹瀉的首位，部分國(guó)家也僅次于志賀菌或沙門菌[4-5]。表位疫苗是以抗原表位為基礎(chǔ)制備的疫苗，是感染性疾病、惡性腫瘤以及自身免疫性疾病等疫苗研制的新方向。烷基過(guò)氧化氫還原酶(Alkyl hydroperoxide reductase, AhpC)屬于空腸彎曲菌抗氧化酶家族，分子質(zhì)量為22 kD，在空腸彎曲菌內(nèi)普遍存在[6]，具有高度保守性、穩(wěn)定性和特異性[7]，是理想的空腸彎曲菌疫苗候選抗原和單克隆抗體的篩選抗原。我們擬采用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行空腸彎曲菌AhpC蛋白保守性分析及B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)，利用Dot blot及ELISA，篩選空腸彎曲菌AhpC特異性B細(xì)胞抗原表位，為空腸彎曲菌疫苗的研制提供候選表位。

1 材料與方法

1.1材料 本研究表位多肽由蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司合成，采用固相多肽合成技術(shù)，以N-α-Fmoc保護(hù)的氨基酸為原料，F(xiàn)moc-AA-Wang樹(shù)脂為載體，HBTU方法偶聯(lián)，經(jīng)HPLC鑒定純度在95%以上。大腸桿菌DH5α、表達(dá)載體pGEX-4T-1為本室保存，限制性核酸內(nèi)切酶、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)均購(gòu)自TaKaRa，膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Marker購(gòu)自AXYGEN公司，硝酸纖維素膜、ECL試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司，小鼠抗GST mAb、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋，GST親和層析預(yù)裝柱及其他分析純購(gòu)自上海生工，引物合成、質(zhì)粒測(cè)序由上海生工完成。清潔級(jí)成年雄性新西蘭大白兔由浙江省金華市食品藥品檢測(cè)研究院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(浙)2010-0046。

1.2表位預(yù)測(cè)、合成及KLH交聯(lián) 空腸彎曲菌NCTC11168株ahpC基因序列(NC_002163.1)及蛋白質(zhì)序列(CAL34485.1)均在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心獲取。B細(xì)胞線性表位預(yù)測(cè)采用IEDB(http://tools.iedb.org/bcell/)在線預(yù)測(cè)軟件，對(duì)線性B細(xì)胞表位進(jìn)行計(jì)算和預(yù)測(cè)。蛋白分子信號(hào)肽序列采用CBS網(wǎng)站中SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。跨膜區(qū)預(yù)測(cè)采用CBS網(wǎng)站中TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。

1.3AphC原核表達(dá)、純化和鑒定 將全基因的合成的aphc片段克隆至pGEX-4T-1載體，構(gòu)建pGEX-4T-1/ahpc重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌，利用氨芐抗性篩選陽(yáng)性克隆，PCR驗(yàn)證，提取陽(yáng)性克隆菌株DNA后經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。質(zhì)粒的提取、酶切、酶連、轉(zhuǎn)化等按照分子克隆技術(shù)常規(guī)方法進(jìn)行。經(jīng)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件后，冰水浴超聲破碎菌體，收集上清液。按照國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心谷胱甘肽親和介質(zhì)純化程序，純化目的蛋白，利用SDS-PAGE 電泳及GST 標(biāo)簽抗體進(jìn)行western blot分析。

1.4抗血清的制備及純化 選取3只清潔級(jí)成年雄性新西蘭大白兔，免疫前7 d耳靜脈采血1～2 mL獲取免疫前血清。取200 μg蛋白-KLH偶聯(lián)物與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后，背部皮下多點(diǎn)注射，其后每2周免疫1次(以不完全弗氏佐劑取代完全弗氏佐劑，其余同上)。免疫接種4次，末次免疫10 d后心臟采血，分離血清。之后采用飽和硫酸銨沉淀及DEAE-52柱層析法分離抗血清中的IgG，分別命名為純化抗體1、2、3。

1.5Dot blot檢測(cè) 將相同濃度待測(cè)表位滴加于硝酸纖維素膜上，干燥后，置于封閉液室溫封閉1 h，加純化后的抗體，室溫震蕩1 h，TBST洗膜3次，加二抗(HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶4000)，室溫震蕩1 h，TBST洗膜3次，ECL顯色，拍照。

1.6ELISA檢測(cè)優(yōu)勢(shì)表位 將各待測(cè)表位稀釋至1 μg/mL，每個(gè)反應(yīng)孔中加50 μL，4 ℃過(guò)夜，次日，棄去孔內(nèi)溶液，TBST洗1次，1%BSA封閉，37 ℃孵育1 h，加純化后的抗體(濃度為1∶200、1∶1000、1∶5000、1∶10000、1∶20000、1∶60000、1∶240000)，室溫震蕩1 h，TBST洗3次，加二抗(HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶10000)，置37 ℃孵育45 min，TBST洗3次，加底物液顯色，終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀板。

2 結(jié) 果

2.1表位預(yù)測(cè)分析及合成 經(jīng)SignalP 4.1軟件預(yù)測(cè)分析空腸彎曲菌AhpC信號(hào)肽序列，AhpC為無(wú)信號(hào)肽的蛋白。經(jīng)TMHMM 2.0分析AhpC跨膜序列顯示AhpC無(wú)跨膜區(qū)，均為胞外序列。經(jīng)IEDB預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)AhpC中存在7個(gè)主要的線性B細(xì)胞抗原表位(圖1)，相關(guān)序列見(jiàn)表1。

2.2重組質(zhì)粒構(gòu)建 經(jīng)過(guò)測(cè)序，峰型正常，目的基因合成正確，表明載體構(gòu)建成功，重組蛋白表達(dá)純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳及GST標(biāo)簽抗體western blot檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)48 kD處有明顯單一的條帶，表明蛋白純化正確且純度較高(圖2)。

表1 預(yù)測(cè)空腸彎曲菌AhpC線性B細(xì)胞抗原表位序列
Tab.1 Prediction of Campylobacter jejuni AhpC linear B-cell epitope sequence

NameSequenceLengthAhpC34?57KGAVVFFYPKDFTFVCPSEIIAFD24AhpC94?108IGQVKFPLVADLTKQ15AhpC112?132NFDVLYAEAVALRGSFLLDAD21AhpC134?143TVRHAVVNDL10AhpC4?16TKKALDFTAPAVL13AhpC166?172GEVCPAG7AhpC68?73EVIGIS6

圖1 IEDB預(yù)測(cè)AhpC線性B細(xì)胞抗原表位圖Fig.1 Prediction of AhpC linear B cell antigen epitopes using IEDB

A：SDS-PAGE電泳圖B：GST標(biāo)簽抗體western blot結(jié)果圖A: SDS-PAGE; B: western blot by GST-tagged antibody圖2 GST-AphC重組蛋白SDS-PAGE電泳及western blot圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis and western blot of GST-AphC protein

2.3Dot blot檢測(cè)結(jié)果 運(yùn)用dot blot方法使抗體分別與7條表位肽及AhpC蛋白雜交，結(jié)果如圖3所示，純化抗體1與AhpC4-16有陽(yáng)性反應(yīng)，純化抗體2與AhpC4-16及AhpC112-132有明顯陽(yáng)性反應(yīng)，純化抗體3與AhpC4-16、AhpC112-132及AhpC166-172有陽(yáng)性反應(yīng)，其中以AhpC4-16最明顯，綜合上述結(jié)果判斷，AhpC4-16為優(yōu)勢(shì)表位。

1為AhpC；2為AhpC34-57；3為AhpC94-108；4為AhpC112-132；5為AhpC134-143；6為AhpC4-16；7為AhpC166-172；8為AhpC68-73。1: AhpC; 2: AhpC34-57; 3: AhpC94-108; 4: AhpC112-132; 5: AhpC134-143; 6: AhpC4-16; 7: AhpC166-172; 8: AhpC68-73. 圖3 各純化抗體與AhpC蛋白及表位肽Dot Blot檢測(cè)結(jié)果圖Fig.3 Dot blot results of the purified antibody and AhpC protein, polypeptide

2.4ELISA檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示(圖4)，純化抗體1稀釋200及1 000倍后與AhpC4-16及AhpC34-57有明顯陽(yáng)性反應(yīng)，抗體稀釋5 000倍后，除AhpC蛋白外僅AhpC4-16有明顯信號(hào)。純化抗體2與抗體1類似，除AhpC蛋白外AhpC4-16的在不同的稀釋比中吸光度最大。純化抗體3稀釋200及1 000倍后與AhpC4-16、AhpC34-57及AhpC112-132等肽段有明顯陽(yáng)性反應(yīng)，抗體稀釋5 000倍后與AhpC4-16反應(yīng)后有最大吸光值(AhpC蛋白除外)。綜合上述結(jié)果判斷，AhpC4-16為優(yōu)勢(shì)表位。

圖4 ELISA檢測(cè)各純化抗體與表位肽及AhpC蛋白的反應(yīng)Fig.4 Reaction of each purified antibody with the peptides and AhpC protein detected by ELISA

3 討 論

空腸彎曲菌引起的食源性感染已成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，隨著耐藥菌株的不斷增加[9-10]，尋求一種新的、安全、有效的亞單位疫苗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

眾所周知，抗原通過(guò)抗原表位與相應(yīng)的淋巴細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，從而激活淋巴細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答，抗原也借表位與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合而發(fā)揮免疫效應(yīng)。因此，制備表位疫苗的關(guān)鍵是確定可被免疫細(xì)胞識(shí)別的特異性多肽。有研究人員利用畢赤酵母菌重組過(guò)表達(dá)生成幽門螺桿菌AhpC蛋白，預(yù)防性免疫接種小鼠后，55%～77.3%的小鼠不受幽門螺桿菌的感染[11]。國(guó)內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)[12]，空腸彎曲菌AhpC蛋白具有抗原性，可以作為空腸彎曲菌感染后血清抗體檢測(cè)的特異抗原。在本研究中，預(yù)測(cè)并篩選空腸彎曲菌AhpC特異性B細(xì)胞抗原表位，并發(fā)現(xiàn)AhpC4-16為優(yōu)勢(shì)表位，為表位疫苗的制備提供了候選表位。

然而，在細(xì)菌感染過(guò)程中，由于宿主與致病菌之間的復(fù)雜作用機(jī)制，單一抗原組分的疫苗難以產(chǎn)生完全而有效的保護(hù)作用。因此在單一保護(hù)性抗原疫苗研究基礎(chǔ)上,構(gòu)建的多亞單位或包括多個(gè)抗原組分的疫苗,將能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生比單一亞單位成分更強(qiáng)的免疫反應(yīng),并可減少機(jī)體變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生幾率。由多種抗原表位組成的多抗原肽(multipleantigenic peptide, MAP)研究策略，為增強(qiáng)誘導(dǎo)免疫保護(hù)作用提供了一種新的方式和思維。在我們以前的研究中[13-14]，已篩選了空腸彎曲菌OMP18的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位，所以在后續(xù)的研究中，我們將構(gòu)建了多個(gè)串聯(lián)多肽表位，通過(guò)動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其免疫效果。

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CampylobacterjejuniAhpCproteinBcellantigenepitopepredictionandantigenicanalysis

CHEN Hao-hao1,2, LI Xu-sheng1, GUO Fang-ming1,DING Ming-xing1, HU Ye2, LOU Hong-qiang1,2

(1.MedicalMolecularBiologyLaboratory,SchoolofMedicine,JinhuaPolytechnic,Jinhua321007,China；2.InstituteofZoonosis,JinhuaPolytechic,Jinhua321007,China)

To provide evidence forCampylobacterjejuni(C.jejuni) vaccine research, the B cell epitope of AhpC protein were predicted, and the antigenicity was analyzed. AhpC was found locating in outer membrane ofC.jejuniwithout transmembrane structure and no signal peptide by bioinformatics software TMHMM Server V2.0, SignalP 4.1. There were seven B-cell linear epitopes in AhpC predicted by IEDB. Then, the AhpC protein and chemically synthesized antigenic epitopes ofC.jejuniwere used as antigens, and the AhpC antibody ofC.jejuniwas used as the primary antibody, the antigens of predominant linear B cell epitopes were detected by ELISA and dot blot. Results showed that one epitope of B cell epitopes (AhpC4-16) was able to recognize the antibodies ofC.jejuniAhpC and had strong antigenicity, indicating that could be used in the follow-up vaccine research.

Campylobacterjejuni; epitope; antigen; alkyl hydroperoxide reductase

Lou Hong-qiang,Email:yxyjwk@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.10.003

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2016C33229)，浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2016C37093)和金華市科技研究計(jì)劃項(xiàng)目(No.2016-3-002)聯(lián)合資助

樓宏強(qiáng)，Email:yxyjwk@163.com

1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，金華 321007；2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院人畜共患病研究所，金華 321007

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A

1002-2694(2017)10-0868-04

Supported by grants from the Science and Technology Planning Project of Zhejiang Province (Nos.2016C33229, 2016C37093), the Science and Technology Planning Project of Jinhua City (No.2016-3-002).

2017-07-11編輯李友松