魏 雪，何 燕，章如松，王 璇，余 波，陳 輝，周曉軍，馬恒輝

南京市30家醫(yī)療單位病理組織處理方法調(diào)查分析

魏 雪，何 燕，章如松，王 璇，余 波，陳 輝，周曉軍，馬恒輝

醫(yī)療單位；病理組織；處理方法；調(diào)查分析；固定；脫水；透明；浸蠟

近年隨著病理技術(shù)的快速發(fā)展，病理組織處理模式已由人工操作轉(zhuǎn)為全自動(dòng)密閉式組織脫水機(jī)的廣泛使用。病理組織的固定、脫水、透明以及浸透等處理已進(jìn)入恒溫、恒濕的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化操作，所有這些變化有效地提升病理組織制片的質(zhì)量。本文選取南京市30家醫(yī)療單位進(jìn)行調(diào)查分析，旨在調(diào)查各單位病理組織處理的現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)可能存在的問題，以期更好的為病理組織的處理提供良好的參考依據(jù)及改進(jìn)措施，共同提高病理組織處理水平。

1 材料與方法

1.1材料收集南京30家醫(yī)療單位參加調(diào)查(28家公立醫(yī)院、2家病理檢驗(yàn)中心)，調(diào)查信息包括各單位詳細(xì)的組織處理程序：如組織處理溶液、組織處理方法(時(shí)間、溫度)等。分析方法以各單位為獨(dú)立的觀察單位，采用百分比統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行。

1.2制備法本組所有參加調(diào)查的單位均在全自動(dòng)密閉式脫水機(jī)中進(jìn)行，使用自動(dòng)組織處理程序。參加調(diào)查的各單位在病理組織制片流程中的每一環(huán)節(jié)所涉及的試劑全部依據(jù)龔志錦等編著的《病理組織制片和染色技術(shù)》、王伯沄等編著的《病理學(xué)技術(shù)》、仲劍平主編的《醫(yī)療護(hù)理技術(shù)操作常規(guī)》以及中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著的《臨床技術(shù)操作規(guī)范·病理學(xué)分冊(cè)》等標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施[1-4]。

1.3溶液選用(1)固定液：①10%中性福爾馬林：40%甲醛10份，水90份。②中性福爾馬林：甲醛液100 mL，蒸餾水900 mL，加入適量碳酸鎂或碳酸鈣作為中和劑，中和后前者約為pH 7.6，后者為pH 6.3～6.5。③中性緩沖福爾馬林：甲醛液100 mL，蒸餾水900 mL，NaH2PO4.H2O 4.0 g，Na2HPO46.5 g；使pH值達(dá)6.8～7.0。④AF液：95%或無水乙醇(A)90 mL，40%(濃)甲醛(F)10 mL。此液兼有脫水作用，固定后可直接入95%乙醇繼續(xù)脫水。⑤AAF液：95%或無水乙醇(A)90 mL，冰醋酸(A)5 mL，40%(濃)甲醛(F)10 mL。此液兼有脫水作用，冰醋酸能把未分裂細(xì)胞核的染色質(zhì)沉淀成為可以染色的塊狀體，細(xì)胞核因此被顯示清楚。(2)脫水液：梯度乙醇為70%、75%、80%、85%、95%以及無水乙醇。(3)透明液：①二甲苯。②硬脂酸熔點(diǎn)56～69.6 ℃。(4)浸蠟液：石蠟熔點(diǎn)范圍為42 ℃、54 ℃、56～58 ℃以及58～60 ℃。所選定的試劑配方要綜合考慮實(shí)際使用中的標(biāo)本數(shù)量、溫度、濕度等多種因素，結(jié)合實(shí)際情況使用對(duì)照比較，選用最合適的配方。

1.4處理流程(1)固定：取材后立即固定，以抑制組織自溶，保持各種組織的原狀。(2)沖洗：常規(guī)固定液可用流水沖洗，水流不能急，緩慢沖洗。(3)脫水：是固定后組織處理的第一步，即從組織成分內(nèi)去除游離的水分和多余的固定液。(4)透明：作為脫水和浸透溶液之間的透明溶液，它既要能溶解于脫水液，又要能溶解于浸透液。(5)浸蠟：石蠟是組織實(shí)驗(yàn)室最常用的滲透和包埋劑，組織需包埋于石蠟等物質(zhì)中，使液態(tài)變固態(tài)，且有一定硬度，才能用切片機(jī)切成薄片。

2 結(jié)果

2.1固定劑參加調(diào)查的30家醫(yī)療單位選用固定劑種類繁多，詳見表1。(1)使用10%福爾馬林的9家單位，6家設(shè)置甲醛液1缸，3家2缸，總時(shí)間為1～4 h，只有1家過夜。(2)使用中性甲醛液的9家單位，7家設(shè)置中性甲醛液1缸，2家2缸，總時(shí)間為1～2 h。(3)使用中性緩沖福爾馬林的4家單位，2家設(shè)置中性緩沖福爾馬林1缸，2家2缸，總時(shí)間為1～2 h。(4)使用AF液的單位1家，AF液1缸，總時(shí)間為2 h。(5)使用AAF液的單位2家，設(shè)置AAF液2缸，總時(shí)間為3 h。(6)使用甲醛/AF液的1家單位，甲醛和AF液各1缸，總時(shí)間為2 h 50 min。(7)使用甲醛/AAF液的1家單位，甲醛和AF液各1缸，總時(shí)間為2 h。(8)使用中性甲醛/AF液的單位1家，中性甲醛液設(shè)置3缸，總時(shí)間為1 h 30 min，AF液1缸，時(shí)間1 h。(9)使用中性甲醛/AAF液的單位1家，設(shè)置中性甲醛液和AAF液各1缸，總時(shí)間為2 h 30 min。(10)使用中性緩沖甲醛/AAF液的單位1家，設(shè)置中性緩沖甲醛液2缸，總時(shí)間為5 h 30 min。(11)溫度設(shè)置：1家38 ℃，1家40 ℃，余28家均為常溫。

表1 固定液的選擇

2.2脫水劑參加調(diào)查的30家醫(yī)療單位均使用乙醇作為脫水劑。(1)使用的梯度乙醇分別為70%、75%、80%、85%、95%以及無水乙醇。(2)各家單位乙醇脫水液起始濃度的選擇詳見表2。1家設(shè)置乙醇4缸，2家5缸，14家6缸，7家7缸，5家8缸，1家9缸?？倳r(shí)間：2家3 h，2家4 h，3家5 h，6家6 h，7家7 h，3家8 h，3家9 h，1家10 h，2家11 h，1家12 h，1家過夜。(3)溫度設(shè)置：1家35 ℃，1家40 ℃，1家50 ℃，余27家均為常溫。

表2 乙醇脫水液起始濃度的選擇

2.3透明浸蠟劑參加調(diào)查的30家醫(yī)療單位在透明和浸蠟步驟有兩種方法。(1)9家單位選擇硬脂酸和石蠟混合液透明兼浸蠟和石蠟浸蠟。正常設(shè)置分別為兩缸混合液，硬脂酸和石蠟的比列第一缸和第二缸分別為3 ∶2和2 ∶3。其中，4家單位硬脂酸石蠟混合液設(shè)置2缸、石蠟設(shè)置1缸，2家單位硬脂酸石蠟混合液設(shè)置2缸、石蠟設(shè)置2缸，1家單位硬脂酸石蠟混合液設(shè)置1缸、石蠟設(shè)置2缸，1家單位硬脂酸和石蠟混合液(硬脂酸和石蠟比例2缸均為2 ∶3)設(shè)置2缸、石蠟設(shè)置1缸，還有1家單位硬脂酸和石蠟混合液(硬脂酸和石蠟比例為3 ∶2)僅設(shè)置1缸。溫度設(shè)置3家60 ℃，3家65 ℃，2家65～70 ℃，1家70～80 ℃。(2)21家單位選擇二甲苯透明，石蠟浸蠟，其中二甲苯和石蠟的使用情況詳見表3。二甲苯溫度設(shè)置1家單位35 ℃，1家單位40 ℃，1家單位60 ℃，余18家單位常溫。(3)30家單位石蠟熔點(diǎn)2家為42 ℃，1家為54 ℃，2家為58～60 ℃，余25家均為56～58 ℃。(4)石蠟設(shè)置和時(shí)間，6家為2缸，總時(shí)間為3～6 h。3家為3缸，總時(shí)間為3 h。12家為4缸，總時(shí)間為1 h 30 min～6 h。(5)石蠟溫度設(shè)置詳見表4。

3 討論

病理組織切片質(zhì)量的好壞直接影響病理診斷的準(zhǔn)確性，沒有質(zhì)量過關(guān)的病理組織切片就沒有準(zhǔn)確的病理診斷。在病理組織切片制備過程中，雖然組織處理是最基本的操作之一，但卻是保證組織切片質(zhì)量最重要的基礎(chǔ)。如果前期組織處理不佳，即使后期操作規(guī)范，仍然無法制備出高質(zhì)量的病理組織切片。因此，做好組織處理是病理技術(shù)質(zhì)量控制環(huán)節(jié)中最基本且最重要的環(huán)節(jié)。

表3 二甲苯和石蠟設(shè)置

表4 石蠟溫度設(shè)置

本次調(diào)查結(jié)果顯示，目前南京市30家醫(yī)療衛(wèi)生單位已全部使用組織處理機(jī)進(jìn)行組織處理，雖然有效地降低組織處理各環(huán)節(jié)中人工操作帶來的質(zhì)量不穩(wěn)定性，但依然有些單位在組織處理個(gè)別環(huán)節(jié)甚或大部分環(huán)節(jié)，存在錯(cuò)誤或不規(guī)范的做法。為了規(guī)范組織處理的流程，有效地提高組織處理的技術(shù)水平，我們建議在病理組織處理環(huán)節(jié)著重注意以下幾點(diǎn)。(1)固定環(huán)節(jié)：能有效地保存細(xì)胞和組織成分，減少組織的損傷，是組織處理前最重要的步驟之一[1-2]。在正式開始組織處理前必須保證組織充分固定，如果組織固定不適當(dāng)、不完整，制出的切片組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，此時(shí)做HE染色，組織結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞核質(zhì)不分明。組織中抗原物質(zhì)丟失嚴(yán)重。固定液的質(zhì)量非常重要，至少每周更換一次，使組織標(biāo)本能夠徹底固定。固定液陳舊、改變其pH值呈中性或弱堿性的性質(zhì)，發(fā)生酸化對(duì)組織中酶的活性有影響[3]。4%甲醛液存放一段時(shí)間后極易氧化產(chǎn)生甲醛，呈酸性，不宜固定標(biāo)本，而采用中性福爾馬林具有良好的固定作用，穿透速度快，組織硬化程度小[4]，其細(xì)胞形態(tài)保存良好，層次分明，基本無萎縮。(2)脫水環(huán)節(jié)：乙醇脫水能力強(qiáng)，在脫水過程中繼續(xù)硬化組織，是一種優(yōu)良脫水劑。但高濃度乙醇對(duì)組織有強(qiáng)烈收縮、硬化作用，因此在脫水過程中一般從低濃度開始，逐步遞進(jìn)其濃度。有文獻(xiàn)報(bào)道[5]將此類組織塊用二甲苯多次脫蠟后，入梯度乙醇直至水化，再重新脫水有一定效果。故宜及時(shí)固定組織，更換試劑，掌握好脫水時(shí)間，延長(zhǎng)組織在95%乙醇中的脫水時(shí)間，做到徹底脫水。含蠟組織塊脫水不足是指處理病理標(biāo)本時(shí)組織塊脫水不盡而被浸蠟甚至包埋，以致石蠟不能完全浸透組織，失去應(yīng)有的支持作用，表現(xiàn)為含蠟組織塊發(fā)軟，制成蠟塊后組織塊與周邊石蠟容易發(fā)生脫離，此種蠟塊往往難以切出組織薄片，即使強(qiáng)行切出也會(huì)出現(xiàn)組織擠壓、破碎，影響病理診斷。在組織脫水環(huán)節(jié)，所有單位均采用乙醇作為脫水劑，乙醇與水呈完全互溶性質(zhì)，乙醇較為經(jīng)濟(jì)，適合優(yōu)選為常規(guī)組織脫水劑[6]。組織脫水時(shí)間在低濃度乙醇中可以長(zhǎng)些，盡量避免在高濃度的乙醇如無水乙醇中停留的時(shí)間過長(zhǎng)，否則會(huì)造成組織過硬、扭曲，影響切片[5,7]，影響病理醫(yī)師閱片。(3)透明環(huán)節(jié)：9家(30%)單位選擇硬脂酸和石蠟混合液透明，21家(70%)單位選擇二甲苯透明石蠟浸蠟透明。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)選用硬脂酸和石蠟混合液作為透明浸蠟劑，硬脂酸的含量不易控制，特別對(duì)于含脂肪較多的組織，使用硬脂酸取代二甲苯易發(fā)生脫片[8]，不能保證制片質(zhì)量的穩(wěn)定性。處理的組織倘若硬脂酸置換不徹底，在展片中會(huì)出現(xiàn)組織在水中離散及免疫組化染色掉片的問題。經(jīng)二甲苯處理的組織容易發(fā)脆、發(fā)硬，特別是子宮肌瘤、子宮頸、甲狀腺的血凝塊、淋巴結(jié)等組織，切片易出現(xiàn)“搓衣板樣”或“百葉窗樣”，經(jīng)硬脂酸石蠟混合液處理則不存在該現(xiàn)象。組織未及時(shí)固定引起組織腐敗、干燥；組織塊過厚或所取組織太多；脫水液濃度不能達(dá)標(biāo)或容量過少；用于透明的二甲苯內(nèi)混有少量雜質(zhì)(如酒精、水等)；用于浸蠟的液狀石蠟內(nèi)混有大量雜質(zhì)等以上情況均會(huì)造成組織塊浸蠟不徹底。及時(shí)檢查所收標(biāo)本的狀況，包括固定液的種類、濃度及量；及時(shí)更換脫水所用的酒精、透明用的二甲苯及用于浸蠟的液體石蠟；必要時(shí)重新取材或重新浸蠟及時(shí)補(bǔ)救。(4)浸蠟環(huán)節(jié)：選擇石蠟需要質(zhì)純，無氣泡和雜質(zhì)，有適度的黏韌性。石蠟分為軟蠟(熔點(diǎn)50～54℃)和硬蠟(熔點(diǎn)56～60 ℃)。軟蠟多用于組織浸透，硬蠟多用于組織包埋。夏季室溫高時(shí)可選用熔點(diǎn)較高的硬蠟，在冬季室溫低時(shí)可選用熔點(diǎn)較低的軟蠟。一般情況下，太硬切片時(shí)容易破碎，不易切成蠟帶；反之，如采用的石蠟太軟時(shí)，切片常皺縮，難以成蠟帶，貼片時(shí)也難把切片攤平。組織浸蠟時(shí)，最好采用熔點(diǎn)為54 ℃的軟蠟。一般組織浸蠟時(shí)間為2～4 h。

本次調(diào)查針對(duì)組織處理的附加方法如攪拌、加壓和試劑質(zhì)控等數(shù)據(jù)，因文章篇幅有限未及涵蓋。

(本文獲得南京市30家醫(yī)療單位病理技術(shù)同行的大力支持和幫助，特此致謝！)

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時(shí)間：2017-9-18 6:23 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170918.0623.029.html

R-33

B

1001-7399(2017)09-1049-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.029

接受日期：2017-06-26

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院病理科，南京 210002

魏 雪，女，技師。E-mail: 554685825@qq.com

馬恒輝，男，副主任技師，通訊作者。E-mail: mafanbushao@163.com