張崇輝，陳 莉

肝細(xì)胞癌中TLR3介導(dǎo)的間質(zhì)微環(huán)境細(xì)胞改變

張崇輝1,2，陳 莉2

目的探討肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中Toll樣受體3(Toll-like receptor 3, TLR3)的表達(dá)及其與臨床病理特征、間質(zhì)微環(huán)境的相關(guān)性。方法采用專利技術(shù)(CN101319971B)制備人體HCC組織芯片，應(yīng)用免疫組化SP法染色檢測(cè)HCC細(xì)胞中TLR3的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)間質(zhì)中各項(xiàng)指標(biāo)。采用多因素相關(guān)分析HCC中TLR3表達(dá)與其臨床病理特征及間質(zhì)微環(huán)境的關(guān)系。結(jié)果HCC中TLR3的陽性率為71.57%，與癌脈管侵犯(P=0.001)、肝硬化背景(P=0.007)、Edmondson分級(jí)(P=0.001)、TNM分期(P=0.000)呈負(fù)相關(guān)；與癌乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)陽性呈正相關(guān)(P=0.000)；與間質(zhì)浸潤(rùn)的T細(xì)胞(P=0.002)和自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞(P=0.000)呈正相關(guān)；與癌相關(guān)肌纖維母細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)(P=0.000)和微血管密度(microvessel density, MVD)(P=0.000)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論TLR3對(duì)HCC間質(zhì)微環(huán)境具有十分重要的影響。

肝腫瘤；肝細(xì)胞癌；TLR3；臨床病理特征；微環(huán)境；相關(guān)性

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率和病死率分別為第5位和第3位[1]，中國是HCC的高危地區(qū)，其發(fā)病率和病死率均占第3位[2]。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)是果蠅Toll蛋白的同源體，Toll樣受體3(Toll-like receptor 3, TLR3)為TLR家族的重要成員。目前，HCC中TLR3信號(hào)活化對(duì)癌間質(zhì)微環(huán)境中細(xì)胞的影響尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP法檢測(cè)102例HCC細(xì)胞中TLR3表達(dá)，以及CD3表達(dá)的T細(xì)胞與CD56表達(dá)的自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞、間質(zhì)中α-SMA表達(dá)的癌相關(guān)肌纖維母細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)和血管生成相關(guān)指標(biāo)CD34表達(dá)的微血管密度(microvessel density, MVD)，分析HCC中TLR3表達(dá)與HCC臨床病理特征、癌間質(zhì)微環(huán)境的相關(guān)性，為臨床治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料收集南通市腫瘤醫(yī)院、南通大學(xué)附屬醫(yī)院和南通市第三人民醫(yī)院2003年1月～2004年12月手術(shù)切除的102例HCC石蠟標(biāo)本。所有病例術(shù)前均未行放、化療處理。102例HCC患者年齡<50歲52例、≥50歲50例；男性84例、女性18例；乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)陰性71例、陽性31例；生存時(shí)間<5年65例、≥5年37例。

1.2組織芯片制作及免疫組化染色利用鄂群、陳莉、金國華等發(fā)明的專利技術(shù)(CN101319971B，2010年)制備人體HCC組織芯片，免疫組化采用SP法染色。

1.3判斷標(biāo)準(zhǔn)免疫組化SP法染色呈棕黃色顆粒者為陽性，陽性細(xì)胞需結(jié)構(gòu)清晰，著色明顯高于背景。TLR3、CD3、CD56和α-SMA免疫組化結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)，根據(jù)著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無陽性著色為0分、淡黃色1分、棕黃色2分、深棕色為3分；根據(jù)陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分：陽性細(xì)胞<5%為1分、5%～25%為2分、26%～50%為3分、>50%為4分。兩項(xiàng)得分相加作為最終判定標(biāo)準(zhǔn)：1分為陰性(-)、2分為弱陽性(+)、3分為中等陽性()、≥4分為強(qiáng)陽性()。血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34呈陽性，于100倍鏡下選取微血管最密集的3個(gè)視野計(jì)數(shù)微血管數(shù)目，即為MVD值。MVD分級(jí)為：<120為低、120～240為重、>240為高。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析HCC中各指標(biāo)免疫組化檢測(cè)結(jié)果，運(yùn)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析HCC中有關(guān)指標(biāo)間的相互關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TLR3表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系102例HCC中TLR3主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞膜或胞質(zhì)(圖1)，檢測(cè)的陽性率為71.57%(73/102)。TLR3表達(dá)在脈管侵犯陽性組與陰性組、伴與不伴肝硬化組、Edmondson不同分級(jí)組、TNM不同分期組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；在HBsAg陰性組和陽性組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈顯著正相關(guān)。HCC中TLR3表達(dá)在患者性別、年齡、腫瘤直徑、瘤結(jié)數(shù)目及血清甲胎蛋白(α-fetoprotein, AFP)值組中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1)。

2.2HCC中TLR3表達(dá)與癌間質(zhì)微環(huán)境的相關(guān)性

2.2.1HCC中TLR3表達(dá)與癌間質(zhì)免疫活性細(xì)胞反應(yīng)的相關(guān)性 HCC間質(zhì)中免疫活性細(xì)胞均定位于細(xì)胞胞質(zhì)(圖2)。在HCC中TLR3表達(dá)與CD3陽性的T細(xì)胞、CD56陽性的NK細(xì)胞呈正相關(guān)(表2)。

2.2.2HCC中TLR3表達(dá)與癌間質(zhì)中CAFs反應(yīng)的相關(guān)性 HCC間質(zhì)中CAFs顯示α-SMA陽性，定位于胞質(zhì)(圖3)。在HCC中TLR3表達(dá)與α-SMA陽性的CAFs呈負(fù)相關(guān)(表3)。

2.2.3HCC中TLR3表達(dá)與間質(zhì)MVD的相關(guān)性 HCC間質(zhì)CD34表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)或胞膜(圖4)。HCC中TLR3在不同MVD的癌中表達(dá)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且HCC中TLR3表達(dá)與MVD呈顯著負(fù)相關(guān)(表4)。

表1 TLR3表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系

表2 HCC中TLR3表達(dá)與癌間質(zhì)免疫活性細(xì)胞反應(yīng)的相關(guān)性

表3 HCC中TLR3表達(dá)與癌間質(zhì)CAFs反應(yīng)的相關(guān)性

表4 HCC中TLR3表達(dá)與間質(zhì)MVD的相關(guān)性

①②A②B③④圖1 HCC中TLR3表達(dá)定位于胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，SP法 圖2 HCC中免疫活性細(xì)胞的表達(dá)，SP法：A．CD3陽性的T細(xì)胞；B．CD56陽性的NK細(xì)胞 圖3 HCC中α?SMA表達(dá)的CAFs，SP法 圖4 HCC中CD34表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)或胞膜，計(jì)數(shù)MVD，SP法

3 討論

TLR家族能同時(shí)調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫[3]，已知TLR家族表達(dá)于各種免疫細(xì)胞，甚至還表達(dá)于非免疫細(xì)胞中[4]。TLR3是TLR家族的重要成員之一，最近的研究已證實(shí)TLR3在HCC癌細(xì)胞中有一定的表達(dá)，活化的TLR3信號(hào)導(dǎo)致NF-κB感應(yīng)，分泌炎癥細(xì)胞因子，影響癌微環(huán)境中多種細(xì)胞活力[5]。本組在102例HCC中檢測(cè)73例TLR3表達(dá)于癌細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)中，陽性率為71.57%，略高于Yuan等[5]報(bào)道的65%，可能與本組收集的HCC病例臨床Ⅰ～Ⅱ級(jí)比例較高有關(guān)，也可能與本地區(qū)HCC常伴有乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染，病毒雙鏈激活TLR3引起其表達(dá)增加等有關(guān)。

已知雙鏈RNA(double stranded RNA, dsRNA)是TLR3的配體，而dsRNA常是病毒基因組的成分，包括HBV在內(nèi)的多種病毒在其復(fù)制期間均會(huì)合成dsRNA。此外，癌細(xì)胞壞死或調(diào)亡后釋放出的信使RNA(messenger RNA, mRNA)或其他RNA可形成雙鏈結(jié)構(gòu)，都可成為TLR3的配體并與其結(jié)合[6]，如本組分析顯示TLR3表達(dá)與HBsAg呈正相關(guān)。雖然肝炎、肝硬化是HCC發(fā)生、發(fā)展的主要因素，但TLR3可能通過間質(zhì)微環(huán)境中免疫活性細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)和抑制CAFs減少基質(zhì)分泌，如膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白，抑制HCC間質(zhì)纖維化。因此，TLR3表達(dá)與HCC肝硬化背景呈負(fù)相關(guān)。由于TLR3表達(dá)抑制CAFs，使其基質(zhì)降解酶(如金屬蛋白酶[7]等)生成減少，而基質(zhì)降解酶的主要功能是破壞腫瘤細(xì)胞與周圍的組織學(xué)屏障，因此TLR3表達(dá)與HCC脈管侵犯、Edmondson分級(jí)和TNM分期呈負(fù)相關(guān)。由此證明TLR3在抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為方面發(fā)揮重要作用[4,8-10]。

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤在其逐漸發(fā)展過程中形成的自己獨(dú)特的組織內(nèi)環(huán)境。HCC細(xì)胞及其與微環(huán)境之間的動(dòng)態(tài)變化是細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、增殖、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)乃至HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移所必需的[11-12]。

在腫瘤局部免疫中以殺傷性T細(xì)胞和NK細(xì)胞為代表的免疫殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。T細(xì)胞常處于機(jī)體免疫系統(tǒng)與腫瘤相互作用的最前沿，其組成和功能在一定程度上反映了機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)的性質(zhì)、強(qiáng)度和總體水平。Faraji等[13]的研究顯示CD8+T細(xì)胞的功能正向影響cadml對(duì)腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的抑制作用。Bidwell等[14]的研究顯示乳腺癌患者去除CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞能恢復(fù)骨轉(zhuǎn)移，同時(shí)能顯著惡化無轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后。Giuliani等[15]在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤藥物來那度胺發(fā)揮抗腫瘤活性的重要途徑是通過激活NK細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中TLR3表達(dá)與T細(xì)胞及NK細(xì)胞均呈正相關(guān)，提示TLR3與T細(xì)胞及NK細(xì)胞對(duì)HCC的生物學(xué)影響具有協(xié)同作用。

CAFs是腫瘤微環(huán)境的中心成分。HCC微環(huán)境中表達(dá)α-SMA的CAFs，同時(shí)具有分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)與促進(jìn)基質(zhì)沉積形成HCC硬化背景的能力[16]。本文中TLR3表達(dá)與CAFs呈負(fù)相關(guān)，系TLR3可能通過間質(zhì)微環(huán)境中免疫活性細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)和抑制CAFs以減少基質(zhì)分泌來抑制HCC間質(zhì)纖維化。

血管再生是HCC浸潤(rùn)、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。異常的腫瘤血管形成，一方面直接給腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面為腫瘤細(xì)胞血道轉(zhuǎn)移提供阻力最小的通道，使腫瘤細(xì)胞更易進(jìn)入血循環(huán)形成轉(zhuǎn)移。Guo等[17]的研究表明HCC細(xì)胞中發(fā)揮抗血管生成作用正是通過激活TLR3的機(jī)制。本組HCC中TLR3表達(dá)與MVD呈負(fù)相關(guān)，提示癌細(xì)胞TLR3表達(dá)能抑制血管生成。

綜上所述，TLR3作為一種還有待進(jìn)一步深入分析的新型抗體，可輔助用于對(duì)HCC患者臨床病理特征及間質(zhì)微環(huán)境的評(píng)估；同時(shí)表明TLR3是HCC靶向性治療中較好的靶點(diǎn)，如能與HCC微環(huán)境的特點(diǎn)相結(jié)合，有利于獲得更多的治療效果好、毒副作用低的精準(zhǔn)靶向性抗HCC藥物，開拓出新的HCC治療思路，對(duì)提高HCC治療的效果并最終徹底掌控HCC具有重要的戰(zhàn)略意義。

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CorrelationofTLR3withthealterationofstromalcellsintumormicroenvironmentofhepatocellularcarcinoma

ZHANG Chong-hui1,2, CHEN Li2

(1DepartmentofPathology,ChangzhouChildren’sHospital,Changzhou213003,China;2DepartmentofPathologicalAnatomy,MedicalSchoolofNantongUniversity,Nantong226001,China)

PurposeTo analyse the correlation between the Toll-like receptor 3 (TLR3) expression and clinic pathologic factors, stromal microenvironment in hepatocellular carcinoma (HCC).MethodsThe tissue microarrays of human HCC were prepared with self-owned patent technology. The expression of TLR3 in HCC cells as well as various indexes in HCC stroma was examined with immunohistochemistry of SP. The correlation between TLR3 expression with the clinic pathologic factors of HCC, and the correlation between TLR3 expression with the reaction of stromal cells in HCC microenvironment were analyzed by multi-factor correlation analysis. Results The positive expression rate of TLR3 in HCC was 71.57%. The expression of TLR3 in HCC had negative correlation with vascular invasion (P=0.001), cirrhosis (P=0.007), Edmondson′s grades (P=0.001) and staging of TNM (P=0.000). It had positive correlation with hepatitis B surface antigen (HBsAg) (P=0.000). It had positive correlation with T cells (P=0.002) and natural killer (NK) cells (P=0.000). It had negative correlation with carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) (P=0.000) and microvessel density (MVD) (P=0.000).ConclusionTLR3 has an important influence on the interstitial microenvironment of HCC.

hepatocellular neoplasm； hepatocellular carcinoma； Toll-like receptor 3； clinicopathologic factors； microenvironment； correlation

時(shí)間：2017-9-18 6:23 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170918.0623.010.html

R 735.7

A

1001-7399(2017)09-0987-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.010

接受日期：2017-06-27

1常州市兒童醫(yī)院病理科，常州 213003

2南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理解剖學(xué)系，南通 226001

張崇輝，男，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail: zch101@163.com

陳 莉，女，博士，教授，通訊作者。Tel:(0513)85051729，E-mail: bl1@ntu.edu.cn