徐雅夢+姜曉冰+于濤+姜曉杰+張藝鴿

摘 要：為研究真空包裝低溫熟牛肉中腐敗菌的種類和特性，利用細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)方法，根據(jù)菌株的菌落形態(tài)、顏色等特征，挑選差別較明顯的12 株菌。通過擴增核糖體DNA限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）以及16S rDNA序列比對分析確定菌株的分類地位，并結(jié)合菌株形態(tài)和生理生化鑒定確定12 株菌所屬的種。結(jié)果表明：所選取的12 株菌中，3 株為綠色魏斯氏菌，2 株為枯草芽孢桿菌，2 株為巴黎鏈球菌，2 株為糞腸球菌，1 株為解淀粉芽孢桿菌，1 株為特基拉芽孢桿菌，1 株為嗜冷桿菌屬的Psychrobacter urativorans。其中綠色魏斯氏菌是導(dǎo)致樣品變綠的主要原因。

關(guān)鍵詞：低溫肉制品；腐敗菌；綠色魏斯氏菌；乳酸菌

Isolation and Identification of Spoilage Bacteria in Vacuum-Packed Low-Temperature Cooked Beef

XU Yameng1， JIANG Xiaobing1， YU Tao2，*， JIANG Xiaojie3， ZHANG Yige1

（1.College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， China；

2.College of Life Sciences and Technology， Xinxiang University， Xinxiang 453000， China；

3.Department of Food Hygiene and Environmental Health， University of Helsinki， Helsinki FI00014， Finland）

Abstract： In order to investigate the species and characteristics of spoilage bacteria in vacuum-packed low-temperature cooked beef， the conventional bacterial culture method was employed to select 12 morphologically distinct isolates from spoiled cooked beef samples according to colonial characteristics. The isolates were taxonomically classified by amplified ribosomal DNA restriction analysis （ARDRA） as well as 16S rDNA sequence alignment and then they were identified at species level by morphological analysis and biochemical tests. Our results showed 3 isolates of Weissella viridescens， 2 isolates of Bacillus subtilis， 2 isolates of Streptococcus lutetiensis ， 2 isolates of Enterococcus cecorum ，1 isolate of Bacillus amyloliquefaciens， 1 isolate of Bacillus tequilensis and 1 isolate of Psychrobacter urativorans among the 12 isolates. Weissella viridescens was responsible for the green color of spoiled meat samples.

Key words： low-temperature meat product； spoilage bacteria； Weissella viridescens； lactic acid bacteria

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708005

中圖分類號：TS251.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）08-0023-05

低溫肉制品是指在常壓下通過蒸、煮、熏、烤等熱加工過程使肉制品的中心溫度控制在68～72 ℃，并且需要在0～4 ℃的低溫環(huán)境下貯藏、運輸及銷售的一類肉制品[1]。與高溫肉制品（通常采用121 ℃、0.1 MPa的高溫高壓加熱方式）相比，低溫肉制品能夠最大限度地保留肉類原有的營養(yǎng)成分及風(fēng)味物質(zhì)，是世界肉類產(chǎn)品的發(fā)展趨勢[2]。低溫肉制品在蒸煮階段一般采用68～72 ℃的殺菌工藝，冷卻后在無菌車間進(jìn)行切分，真空包裝為此類肉制品的主要包裝形式，保質(zhì)期一般為2～4 周，保質(zhì)期的長短主要取決于初始菌量及貯藏溫度[3]。

肉制品富含蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，極易被微生物利用，產(chǎn)生腐敗變質(zhì)現(xiàn)象[4]。低溫肉制品腐敗后會產(chǎn)生發(fā)黏、變色、變味、脹袋等現(xiàn)象，導(dǎo)致感官品質(zhì)及營養(yǎng)價值的降低，這不僅會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，還可能引發(fā)食品安全事件[5]。因此，研究低溫肉制品中腐敗微生物的種類及特性對此類產(chǎn)品的質(zhì)量安全控制具有重要意義。本研究對真空包裝低溫熟牛肉中的腐敗菌進(jìn)行分離和鑒定，并對菌株的生理生化特性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步采取有效的防腐保鮮措施、延長產(chǎn)品的貨架期提供參考。

1 材料與方法endprint

1.1 材料與試劑

已變質(zhì)的真空包裝低溫熟牛肉。打開包裝后，可觀察到樣品表面有黏液，伴隨有異味產(chǎn)生；無菌操作切開樣品后，可觀察到切面上多處已呈現(xiàn)綠色。

蛋白胨、腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基 北京陸橋生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增的試劑、限制性內(nèi)切酶（15 U/μL） 寶生物工程（大連）有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒 德國Qiagen公司；擴增引物 上海英駿生物技術(shù)有限公司；過氧化氫酶、甲基紅、葡萄糖、木糖、麥芽糖、鼠李糖、甘露醇、七葉苷、

D-核糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、半乳糖（質(zhì)量濃度均為0.5 g/mL） 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XO-6D拍擊式均質(zhì)器 江蘇南京先歐儀器制造有限公司；DH360電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司；THZ-82氣浴恒溫振蕩器 金壇市天竟實驗儀器廠；ETC811基因擴增儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠；TGL-16B離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；UNIVERSAL HOOD Ⅱ凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)、分離與純化

以無菌操作從樣品中心和表面取樣（各12.5 g），混合后放入裝有225 mL 0.1 g/mL蛋白胨水的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1～2 min；吸取均質(zhì)液0.5 mL，用0.1 g/mL的蛋白胨水按10 倍遞增進(jìn)行梯度稀釋，選取3 個適宜濃度（保證平板上的菌落數(shù)為30～300 個），分別采用涂布法[6]和傾注法[7]進(jìn)行菌株培養(yǎng)。涂布法：取100 ?L稀釋液均勻涂布在BHI培養(yǎng)基上，30 ℃有氧培養(yǎng)2 d；傾注法：取1 mL稀釋液于無菌平皿內(nèi)，將15 mL冷卻至46 ℃的BHI培養(yǎng)基傾注至平皿，轉(zhuǎn)動平皿使稀釋液與培養(yǎng)基混合均勻，待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，30 ℃厭氧培養(yǎng)3 d。待平板上長出菌落后，挑取外觀形態(tài)不同的單菌落，劃線于BHI培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。將純化后的菌株轉(zhuǎn)移至BHI培養(yǎng)基，4 ℃保存。

1.3.2 菌株的PCR擴增

DNA模板的制備：用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離所得菌株的DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以提取出的菌株基因組DNA（16S rDNA）為模板，選用細(xì)菌通用引物（正向引物27F：5-AGAGTTTGATCCTGG-3；反向引物1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化后的產(chǎn)物送北京博邁德生物技術(shù)有限公司測序。

1.3.3 擴增核糖體DNA限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）

本研究選取的限制性內(nèi)切酶為EcoRⅠ、SpeⅠ和TaqⅠ，選擇20 ?L酶切反應(yīng)體系。

EcoRⅠ和SpeⅠ雙酶切反應(yīng)體系：1 ?L EcoRⅠ、1 ?L SpeⅠ、2 ?L 10×H Buffer、7 ?L DNA模板和9 ?L無菌水。反應(yīng)條件：37 ℃恒溫酶切4 h，65 ℃恒溫5 min終止反應(yīng)[8]。TaqⅠ單酶切反應(yīng)體系：1 ?L TaqⅠ、2 ?L 10×TaqⅠ Buffer、2 ?L 0.1 g/mL的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、7 ?L DNA模板和8 ?L無菌水。反應(yīng)條件：65 ℃反應(yīng)4 h，加入2 ?L 10×Loading buffer終止反應(yīng)。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。

1.3.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

測序得到菌株的16S rDNA序列，使用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序?qū)y序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核酸序列進(jìn)行比對，從中選取相似性較高的序列，使用DNAstar和MEGA 4軟件進(jìn)行多重序列比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.5 菌株的生理生化鑒定

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[9]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]對純化后的菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的菌落特征

本研究分別采用涂布法和傾注法對菌株進(jìn)行培養(yǎng)，涂布法中的平板在有氧條件下放置，主要用于好氧菌和兼性厭氧菌的分離；傾注法中的平板在厭氧條件下放置，主要用于厭氧菌和兼性厭氧菌的分離。根據(jù)樣品稀釋液在BHI培養(yǎng)基上所生長細(xì)菌菌落的表型差異，共篩選出12 株腐敗菌，編號為n01～n12，12 株菌的基本形態(tài)特征如表1所示。菌株的分離和篩選主要依據(jù)其形態(tài)、顏色等特征，不排除篩選出同一種屬、甚至同一菌株的可能性。

2.2 菌株的PCR擴增結(jié)果

所有菌株經(jīng)過PCR擴增（16S rDNA）后均出現(xiàn)了清晰可辯的特異性條帶，條帶大小為1 500 bp左右。其中菌株n01、n04、n05、n09、n10的PCR擴增結(jié)果如

圖1所示。

N. 陰性對照；M. DL 2000 Marker。下同。

2.3 ARDRA結(jié)果

ARDRA是限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）在核糖體DNA序列上的應(yīng)用[11]。最初的RFLP技術(shù)的依據(jù)是不同生物個體之間DNA片段的酶切位點有所差異，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后能夠產(chǎn)生長短、種類、數(shù)目不同的限制性片段，基于對限制性片段的分析，從DNA水平比較不同個體之間的差異[12]。ARDRA則是根據(jù)16S rDNA基因序列的限制性片段區(qū)分菌株種的差異[13]。由圖2～3可知，12 株菌的16S rDNA分別經(jīng)EcoRⅠ和SpeⅠ雙酶切、TaqⅠ單酶切后，均可獲得便于區(qū)分的酶切圖譜。根據(jù)條帶的相似性可以將12 株菌分為5 組，第1組包括n01、n02、n03和n08，第2組包括n05、n06和n07，第3組包括n09和n11，第4組包括n10和n12，第5組僅包括n04。同一組內(nèi)菌株的酶切圖譜具有較高的相似性，表明這些菌株之間存在一定的親緣關(guān)系。endprint

2.4 菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將12 株菌的16S rDNA序列通過BLAST與GenBank中已發(fā)表的16S rDNA序列進(jìn)行比對，選取相似性在99%以上的菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖4可知，n01和n08與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、n02與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、n03與特基拉桿菌（Bacillus tequilensis）親緣關(guān)系最近，它們均屬于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）；n04與嗜冷桿菌屬（Psychrobacter sp.）

親緣關(guān)系最近；n05、n06和n07與魏斯氏菌屬（Weissella sp.）

親緣關(guān)系最近；n09和n11與鏈球菌屬（Streptococcus sp.）

親緣關(guān)系最近；n10和n12與腸球菌屬（Enterococcus sp.）親緣關(guān)系最近。

2.5 菌株的生理生化鑒定結(jié)果

參照GenBank比對結(jié)果，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[9]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]對菌株進(jìn)行相應(yīng)的生理生化鑒定。由表2可知，n01和n08為枯草芽孢桿菌，n02為解淀粉芽孢桿菌，n03為特基拉芽孢桿菌，n04為嗜冷桿菌屬的Psychrobacter urativorans（暫無中文命名），n05、n06和n07為魏斯氏菌屬中的綠色魏斯氏菌，n09和n11為巴黎鏈球菌，n10和n12為糞腸球菌。

芽孢桿菌屬為革蘭氏陽性、好氧或兼性厭氧桿菌，能形成芽孢，抵抗不良生存環(huán)境。芽孢桿菌屬在自然界中分布廣泛，是污染肉類、乳類和谷類食品的重要細(xì)菌，芽孢桿菌屬中與食品密切相關(guān)的菌株是其模式菌——枯草芽孢桿菌，該菌常污染肉制品，并使肉制品表面出現(xiàn)黏絲狀或黏液狀現(xiàn)象[14]。芽孢桿菌能夠耐高溫，即使經(jīng)過高溫殺菌，肉制品中的芽孢桿菌也有可能存活下來，進(jìn)而導(dǎo)致肉制品變質(zhì)。陳曉等[15]從腐敗的火腿腸樣品中分離出枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。嗜冷桿菌屬是一類不運動、不產(chǎn)色素、氧化酶反應(yīng)呈陽性、耐低溫的革蘭氏陰性桿菌，其通常能在低至5 ℃的環(huán)境中生長，20 ℃時生長情況最好[16]。嗜冷桿菌屬的耐冷特性主要是由于其細(xì)胞膜內(nèi)含有大量的不飽和脂肪酸，并且隨著溫度的降低不飽和脂肪酸的含量會增加，以保證細(xì)胞膜在低溫條件下的流動性，使細(xì)胞能夠在低溫條件下不斷從外界環(huán)境中吸收營養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞的正常生命活動[17]。嗜冷桿菌屬是導(dǎo)致低溫保藏食品腐敗的主要腐敗菌。到目前為止，已經(jīng)從冷凍肉和乳制品中分離得到嗜冷桿菌屬[18-19]。本研究從真空包裝低溫熟牛肉中分離得到一株P(guān)sychrobacter urativorans，據(jù)報道這種菌曾在低溫保藏的豬肉香腸中檢出過[20]。

國內(nèi)外的研究表明，乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是真空包裝低溫熟肉制品中的主要腐敗菌[21]。從廣義上來講，本研究中分離得到的鏈球菌、腸球菌和魏斯氏菌均屬于乳酸菌，這些細(xì)菌的存活能力較強，能夠適應(yīng)低pH值、高溫等不良環(huán)境。在真空包裝低溫熟肉制品的貯藏初期，此類細(xì)菌數(shù)量較少，所占比例較低；但在貯藏過程中，此類細(xì)菌的生長明顯優(yōu)于其他細(xì)菌，并且具有較強的腐敗活性[22]。鏈球菌為革蘭氏陽性菌，兼性厭氧，能夠利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸，屬于單一發(fā)酵型菌株[23]。該屬中的嗜熱鏈球菌和乳酸鏈球菌與食品工業(yè)密切相關(guān)，嗜熱鏈球菌常用于發(fā)酵乳的生產(chǎn)，乳酸鏈球菌中的某些菌株能夠產(chǎn)生乳酸鏈球菌素，該物質(zhì)作為一種天然防腐劑能夠有效抑制食品中細(xì)菌的生長[24]。在早期的報道中，巴黎鏈球菌被認(rèn)為是嬰兒鏈球菌的一個亞種（結(jié)腸亞種）[25]；2002年以后，該菌被劃分為鏈球菌屬的一個新種，命名為巴黎鏈球菌。巴黎鏈球菌能夠在BHI和MRS培養(yǎng)基中生長。在血平板上，該菌能夠形成表面光滑、無色素的圓形菌落。巴黎鏈球菌能夠從發(fā)酵乳制品和發(fā)酵谷物制品中分離得到[26]。劉曉紅等[27]的研究表明巴黎鏈球菌是鹵鴨脖中的優(yōu)勢腐敗菌，腸球菌是人類和動物腸道中的主要常駐菌，動物屠宰時，腸道中的腸球菌可能會對原料肉造成污染，例如糞腸球菌是牛肉、豬肉切口上的優(yōu)勢菌。和大多數(shù)乳酸菌一樣，腸球菌對高溫具有耐受性，經(jīng)加熱處理后，肉中的腸球菌仍能存活，最終導(dǎo)致肉制品的腐敗。

綠色魏斯氏菌屬于異型發(fā)酵乳酸菌，能夠?qū)е率称罚ㄌ貏e是肉制品）的腐敗變質(zhì)。賀旺林等[14]認(rèn)為魏斯氏菌是真空包裝低溫熟肉制品中的特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）。Du?ková等[28]的研究表明，綠色魏斯氏菌是導(dǎo)致肉制品產(chǎn)生黏液并且發(fā)綠的主要原因，起初黏液僅在單個菌落周圍出現(xiàn)，之后逐漸形成一整片綠色的黏液，并從肉制品的表面向內(nèi)部滲透。綠色魏斯氏菌在生長過程中會產(chǎn)生過氧化氫和硫化氫，過氧化氫能直接氧化肉中肌紅蛋白的卟啉環(huán)，生成綠色的羥基卟啉膽綠蛋白；另一方面，當(dāng)硫化氫、過氧化氫和氧氣同時存在時，硫原子會加在血紅素卟啉環(huán)的α-亞甲基上，使血紅素轉(zhuǎn)變?yōu)閹€基卟啉血素、肌紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)閹€卟啉肌綠蛋白及巰卟啉血綠蛋白，最終導(dǎo)致肉制品變綠[29]。本研究所檢測的肉制品內(nèi)部已出現(xiàn)整片的綠色黏液，從該樣品中分離得到綠色魏斯氏菌，推測該菌是導(dǎo)致樣品變綠的主要原因。真空包裝低溫熟牛肉樣品受到綠色魏斯氏菌的污染可能由2 種原因造成[28-30]：1）在加工環(huán)節(jié)，包括冷卻、切片和真空包裝等工序中受到污染；2）綠色魏斯氏菌能夠耐受高溫，肉制品加工過程中對原料肉的蒸煮并不能有效殺滅該菌，且在包裝好的成品中該菌會迅速成為優(yōu)勢菌，從而導(dǎo)致肉制品的腐敗變質(zhì)。

3 結(jié) 論

本研究對真空包裝低溫熟牛肉中的腐敗菌進(jìn)行分離，并結(jié)合表型分析、ARDRA、系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建對菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，分離得到的12 株菌中，4 株為芽孢桿菌屬，3 株為綠色魏斯氏菌，2 株為巴黎鏈球菌，2 株為糞腸球菌，1 株為嗜冷桿菌。其中，綠色魏斯氏菌是導(dǎo)致樣品變綠的主要原因，總體來說，乳酸菌是真空包裝低溫熟肉制品中的主要腐敗菌。本研究為進(jìn)一步采取有效的防腐保鮮措施、延長低溫肉制品的貨架期提供了理論依據(jù)。endprint

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