吳冬梅 陳小玲 陳永華 郭潤(rùn)民

1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，廣東湛江 524001；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，廣東湛江 524001；3. 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東湛江 524001

EDTA抗原修復(fù)液用于促藍(lán)液的應(yīng)用和體會(huì)

吳冬梅1陳小玲2陳永華1郭潤(rùn)民3▲

1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，廣東湛江 524001；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，廣東湛江 524001；3. 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東湛江 524001

目的 探討EDTA抗原修復(fù)液是否可用做HE染色和免疫組織化學(xué)染色的促藍(lán)液。 方法 分別采用HE染色法及免疫組織化學(xué)染色對(duì)脫鈣后骨組織（10例）﹑冰凍脂肪組織（10例）﹑平滑肌組織（10例）﹑甲狀腺組織（10例）及腸癌組織進(jìn)行染色（10例）。分別采用流水沖洗﹑43℃溫水﹑即用型PBS﹑pH=9.0 EDTA修復(fù)液作為促藍(lán)液進(jìn)行藍(lán)化。 結(jié)果 在HE染色組的5種藍(lán)化方式中，以EDTA抗原修復(fù)液藍(lán)化2min（實(shí)驗(yàn)時(shí)間為夏天）藍(lán)化最充分﹑效果最佳﹑不易脫片﹑層次分明﹑細(xì)胞核藍(lán)色鮮艷﹑核膜及染色質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)清楚﹑核漿對(duì)比度明顯；在免疫組織化學(xué)染色組，復(fù)染蘇木精后，經(jīng)EDTA抗原修復(fù)液藍(lán)化2min，各組組織細(xì)胞核結(jié)構(gòu)顯示清晰，能很好的襯托組化陽(yáng)性信號(hào)。 結(jié)論 HE染色和免疫組織化學(xué)染色均可以將EDTA抗原修復(fù)液用于促藍(lán)液，且在免疫組織化學(xué)染色中，EDTA抗原修復(fù)液的效果與流水沖洗效果相當(dāng)，而且節(jié)省了藍(lán)化的時(shí)間。

EDTA抗原修復(fù)液；促藍(lán)液；HE染色法；免疫組織化學(xué)染色

蘇木素-伊紅染色法（hematoxylin eosin staining，HE染色）中的顯藍(lán)，又稱返藍(lán)﹑促藍(lán)﹑藍(lán)化，蘇木素染色的組織切片經(jīng)分化液分化后，其顏色由藍(lán)色變?yōu)榧t色，再經(jīng)弱堿性水溶液處理，使其由淺藍(lán)色變?yōu)樗{(lán)色，蘇木素染色這一藍(lán)化過程是HE染色所必需的，藍(lán)化處理得當(dāng)，細(xì)胞核才能呈現(xiàn)鮮艷的藍(lán)色，細(xì)胞核膜及染色質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚，并且與伊紅的紅色形成鮮明的對(duì)比，紅藍(lán)相襯。HE染色切片的質(zhì)量好壞不但取決予蘇木素﹑伊紅染液的質(zhì)量﹑染色時(shí)間﹑染色溫度，而且在很大程度上還取決于染色過程中分化液﹑藍(lán)化液性質(zhì)和類型的選擇，以及分色與藍(lán)化的時(shí)間[1-3]。在臨床工作中，一些前期處理好的切片，當(dāng)以氨水藍(lán)化時(shí)會(huì)出現(xiàn)個(gè)別脫片情況，尤其是脫鈣后的骨組織﹑冷凍切片中的脂肪組織﹑平滑肌組織及甲狀腺等纖維或脂肪多的組織尤其顯著[4-5]。因此，本研究通過比較EDTA抗原修復(fù)液在HE染色和免疫組織化學(xué)染色促藍(lán)液應(yīng)用比較，試圖找到快速而且穩(wěn)定的藍(lán)化方法，從而提高HE染色和免疫組織化學(xué)染色的藍(lán)化速度。

表1 HE染色5種藍(lán)化所用時(shí)間（min）

1 材料與方法

1.1 材料

2016年1～6月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理中心的臨床標(biāo)本中隨機(jī)挑取脫鈣后骨組織﹑冰凍脂肪組織﹑平滑肌組織﹑甲狀腺組織及腸癌組織各10例。本研究經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，均獲得本研究所有患者的書面知情同意。

1.2 試劑

HE染色常用試劑，蘇木精﹑伊紅﹑二甲苯﹑乙醇﹑1%鹽酸乙醇，可調(diào)溫度的攤片機(jī)﹑pH為7.4～7.6的PBS溶液﹑pH=9.0 EDTA修復(fù)液。

1.3 方法

1.3.1 HE染色 （1）石蠟切片4um脫蠟至水；（2）蘇木精染色5～8min；（3）1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，水洗；（4）按表一所列方法對(duì)石蠟切片進(jìn)行藍(lán)化處理，充分水洗；（5）0.5% 伊紅2～5min，水洗；（6）梯度乙醇脫水；（7）二甲苯透明；（8）中性樹膠封片.1.3.2 免疫組化染色 （1）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；（2）常規(guī)免疫組織化學(xué)染色到DAB顯色；（3）蘇木素復(fù)染，水洗干凈；（4）用pH 9.0抗原修復(fù)液藍(lán)化 2min；（5）梯度乙醇脫水；（6）二甲苯透明；（7）中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判定

顯微鏡下觀察，HE染色細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色染色對(duì)比是否清晰，顏色是否鮮艷。顯微鏡下觀察，免疫組化染色顯色后，細(xì)胞核染色是否深淺恰當(dāng)，是否能清晰地顯示組織結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色采用5種藍(lán)化方式所用的時(shí)間

HE染色中分別采用流水沖洗﹑43℃溫水﹑即用型PBS﹑pH=9.0 EDTA修復(fù)液作為促藍(lán)液進(jìn)行藍(lán)化，對(duì)應(yīng)所耗時(shí)間具體結(jié)果見表1。可見EDTA抗原修復(fù)液不僅僅所用時(shí)間少，而且同一試劑可以多種用途。這樣，EDTA作為修復(fù)液使用后，可以繼續(xù)作為促藍(lán)液使用，在基層單位可以既節(jié)約成本又節(jié)省時(shí)間。

2.2 HE染色后藍(lán)化結(jié)果

HE染色采用5種藍(lán)化方式，以pH 9.0 EDTA溶液藍(lán)化2min（實(shí)驗(yàn)時(shí)間為夏天）藍(lán)化最充分，效果最佳，不易脫片，層次分明，細(xì)胞核藍(lán)色鮮艷，核膜及染色質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)清楚，核漿對(duì)比度明顯，其他4種藍(lán)化方法相對(duì)于EDTA溶液藍(lán)化效果稍差。在實(shí)驗(yàn)過程中各種組織經(jīng)過5種藍(lán)化方法藍(lán)化后并未發(fā)現(xiàn)組織脫片。見圖1。

圖1 EDTA抗原修復(fù)液藍(lán)化HE染色甲狀腺組織

2.3 免疫組織化學(xué)染色藍(lán)化結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色復(fù)染蘇木精后，經(jīng)pH 9.0 EDTA溶液藍(lán)化2min后，各組組織細(xì)胞核結(jié)構(gòu)顯示清晰，能很好的襯托組化陽(yáng)性信號(hào)。本次實(shí)驗(yàn)中，固定良好的組織在實(shí)驗(yàn)過程中并未發(fā)現(xiàn)藍(lán)化后脫片。

3 討論

蘇木素伊紅染色（簡(jiǎn)稱HE染色）和免疫組織化學(xué)染色是目前應(yīng)用最廣泛的組織化學(xué)染色方法。在HE染色中，蘇木素染色后藍(lán)化得當(dāng)是否也非常重要，如果藍(lán)化不足，染色偏弱，若藍(lán)化時(shí)間太長(zhǎng)，又會(huì)加長(zhǎng)染色時(shí)間。采用弱堿性水溶液盡管會(huì)很快使組織藍(lán)化，但是堿性水溶液會(huì)使細(xì)胞的PH發(fā)生改變，導(dǎo)致伊紅不容易上色。經(jīng)過堿性水溶液藍(lán)化的切片，伊紅染色時(shí)間往往需要30～60s，甚至需要幾分鐘；而流水藍(lán)化的切片，伊紅染色時(shí)間只需要2～10s。長(zhǎng)時(shí)間的伊紅染色會(huì)使伊紅吸附在細(xì)胞核上，形成核漿共染現(xiàn)象，使細(xì)胞核呈紫紅色，導(dǎo)致核漿染色對(duì)比不明顯，這在自動(dòng)染色時(shí)特別明顯。自來水的pH為6～7，相對(duì)于鹽酸和蘇木精來說，都成弱堿性，組織在染色過程中，這種藍(lán)-紅-藍(lán)變色的現(xiàn)象，是蘇木紅和鋁離子所形成的藍(lán)色色淀的結(jié)合﹑解離和再結(jié)合的過程[6]。一般來說，藍(lán)色色淀在酸性環(huán)境中處于離子狀態(tài)，呈紅色，這種現(xiàn)象稱為色淀解離；相反，紅色離子狀態(tài)的色淀，在中性或堿性環(huán)境中處于結(jié)合狀態(tài)，呈藍(lán)色，這時(shí)就稱為色淀形成。有研究表明[7]，染蘇木精后在43℃溫水中既能達(dá)到快速藍(lán)化的目的，又不引起脫片。也有用PBS作為促藍(lán)液有很好效果[8]。當(dāng)然更常用的是用流水沖洗藍(lán)化[9-10]。本實(shí)驗(yàn)采用了幾種平常HE染色過程中較容易脫片的組織，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)組織固定良好的情況下，pH 9.0的EDTA藍(lán)化并未出現(xiàn)脫片現(xiàn)象。并且無論HE染色或者免疫組化染色，用pH 9.0 EDTA（修復(fù)前或修復(fù)后）作為促藍(lán)液能達(dá)到很好的效果。能較好的和快速的使細(xì)胞核藍(lán)化，且在組織固定良好的情況下，未發(fā)現(xiàn)脫片現(xiàn)象；要注意的是，HE染色過程中，在用堿性促藍(lán)液進(jìn)行藍(lán)化后必須用自來水充分沖洗，待完全沖去玻片中的促藍(lán)液后再繼續(xù)后續(xù)的伊紅染色。我們發(fā)現(xiàn)：EDTA抗原修復(fù)液可應(yīng)用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色的促藍(lán)液，且在免疫組織化學(xué)染色中，EDTA抗原修復(fù)液能快速達(dá)到藍(lán)化效果，這可能與其PH值﹑脫鈣等有關(guān)[11-16]。

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Application of EDTA antigen retrieval solution in blue solution of HE staining

WU Dongmei1CHEN Xiaoling2CHEN Yonghua1GUO Runmin3
1.Department of Pathology,Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,China;2.Department of Pharmacy,Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,China;3.Department of Cardiology,3.The Affiliated Hospital,Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001，China

Objective To investigate whether EDTA antigen retrieval solution can be used for blue solution of HE staining and immunohistochemical staining. Methods Using HE staining and immunohistochemical staining of decalcified bone (10 cases),frozen adipose tissue (10 cases),muscle tissue (10 cases) and thyroid tissues (10 cases)and colorectal carcinoma tissues were stained (10 cases).Rinse with tap water,43 degree warm water and instant PBS respectively,pH=9.0 EDTA retrieval solution were used as blue solution. Results In HE staining groups,after blue staining using EDTA antigen retrieval solution for 2 min (experiments performed in summer),which effects were best,as evidenced by blue staining thoroughly，stripping off difficultly，more bright blue nuclei,more clear nuclear structure,significantly contrast between cytoplasm and nucleus.In immunohistochemical staining groups,after hematoxylin staining and blue staining using EDTA antigen retrieval solution for 2 min,the EDTA antigen retrieval solution made nucleus structure more clear,and immunohistochemical staining positive signals better. Conclusion EDTA antigen retrieval liquid can be used for blue solution of HE staining and immunohistochemical staining,EDTA antigen retrieval liquid have similar effects and expends less time compared with flush with streams.

EDTA antigen retrieval solution;Blue solution;HE staining;Immunohistochemical staining

R783.3

A < class="emphasis_bold"> [文章編號(hào)]]

] 2095-0616（2017）21-28-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81670348；81703762）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015A030310359；2016A030313678；2016A030310359）。

▲通訊作者

2017-09-15）