林蓁，劉德純，楊文圣

(廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院病理科，廈門 361003）

免疫組織化學(xué)雙標(biāo)在腫瘤侵犯判斷中的應(yīng)用

林蓁，劉德純*，楊文圣

(廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院病理科，廈門 361003）

目的探討免疫組織化學(xué)雙標(biāo)法在判斷腫瘤侵犯中的應(yīng)用。方法應(yīng)用以DAB和快紅(fast red, FR)作為呈色劑的EnVision法免疫組織化學(xué)雙標(biāo)技術(shù)標(biāo)記腫瘤組織33例，觀察腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞、血管淋巴管與神經(jīng)及其相互關(guān)系。結(jié)果腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞被標(biāo)記成棕色（DAB顯色），血管淋巴管內(nèi)皮與神經(jīng)纖維被標(biāo)記成玫瑰紅色（FR顯色）；可疑腫瘤侵犯血管淋巴管的30例中，有28例可見標(biāo)記成棕色的腫瘤細(xì)胞侵入標(biāo)記成瑰紅色的血管、淋巴管中（腫瘤侵犯血管淋巴管陽性），陽性率為93.3%；可疑神經(jīng)侵犯的12例中，有10例可見標(biāo)記成棕色的腫瘤細(xì)胞侵入標(biāo)記成瑰紅色的神經(jīng)纖維中（腫瘤侵犯神經(jīng)纖維陽性），陽性率為83.3%。結(jié)論以DAB和快紅作為呈色劑的免疫組織化學(xué)雙標(biāo)法觀察腫瘤是否侵犯血管淋巴管與神經(jīng)組織，結(jié)果清晰可靠，可作為判斷腫瘤有無侵襲性生長的重要依據(jù)。

免疫組織化學(xué)；雙標(biāo)法；腫瘤侵犯

免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色是指用免疫組織化學(xué)染色方法在同一張組織切片上同一部位同時顯示兩種抗原。這種方法可以直接觀察到不同細(xì)胞之間的相互關(guān)系、相同部位不同細(xì)胞的分布情況，或同一細(xì)胞內(nèi)不同抗原定位與相互關(guān)系。腫瘤侵襲性生長，如突破基底膜、基底細(xì)胞或肌上皮細(xì)胞，浸潤到間質(zhì)組織中，侵犯神經(jīng)和血管淋巴管等，都是判斷惡性腫瘤的重要依據(jù)。在HE染色下不易判斷時，免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記可起到有效的輔助診斷作用。目前對于如何運(yùn)用免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記技術(shù)判斷癌細(xì)胞侵犯血管淋巴管與神經(jīng)，尚未見專門報道。我科探索應(yīng)用以DAB和快紅（fast red, FR）作為呈色劑的免疫組織化學(xué)雙標(biāo)技術(shù)，顯示腫瘤細(xì)胞與神經(jīng)纖維、腫瘤細(xì)胞與血管淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的相互關(guān)系，以判斷腫瘤有無侵襲性生長。

材料和方法

1 材料

收集廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院病理科2015年1月至2016年6月間，經(jīng)病理醫(yī)生以HE染色觀察懷疑有腫瘤血管淋巴管或神經(jīng)侵犯的標(biāo)本33例。其中男性12例，女性21例，平均年齡56歲；病種包括結(jié)直腸癌11例，胃癌7例，宮頸癌4例，食管癌3例，肺癌2例，甲狀腺癌2例，乳腺癌2例，腎癌1例，涎腺癌1例。

2 主要儀器

羅氏BenchMark全自動免疫組織化學(xué)染色儀。

3 主要試劑

鼠抗人即用型單克隆抗體CKpan（AE1/AE3）（標(biāo)記上皮性腫瘤細(xì)胞）、鼠抗人即用型單克隆抗體CD34（QBEnd/10）（標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞）、鼠抗人即用型單克隆抗體D2-40（D2-40）（標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞）、鼠抗人即用型單克隆抗體S-100（4C4.9）（標(biāo)記神經(jīng)纖維細(xì)胞），抗體均購自福州邁新公司；Ultra View Universal DAB Detection Kit（DAB染色液），主要試劑包含：3%過氧化氫液，通用 HRP 多聚體（包含有HRP標(biāo)記的抗體混合物：山羊抗小鼠IgG，山羊抗小鼠IgM和山羊抗兔IgM，＜50μg/ml），DAB呈色劑，5g/L硫酸銅液；Ultra View Universal AP Red Detection Kit （AP染色液），主要試劑包含：通用 AP 聚合體（包含有AP標(biāo)記的抗體混合物：山羊抗小鼠IgG，山羊抗小鼠IgM和山羊抗兔IgM，＜50μg/ml），2g/L快紅(fast red, FR)A、2g/L快紅B呈色劑，11%氯化鎂液；抗原修復(fù)液Tris（pH 8.5）；緩沖液Tris（pH值7.2～7.4）；染色液、修復(fù)液、緩沖液均購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）公司。

4 組織蠟塊分組

在上述33例中，每例選出需要做免疫組織化學(xué)檢測的蠟塊1塊。可疑腫瘤血管淋巴管侵犯的30例為第一組，可疑神經(jīng)侵犯的12例為第二組（部分病例疑同時有血管淋巴管和神經(jīng)侵犯）。第一、第二組中隨機(jī)選10例做為對照組。將蠟塊3μm切片，裱在防脫載玻片上，65℃烤片30min待用。組織切片二甲苯脫蠟，經(jīng)梯度乙醇至水化。打印條形碼，將需檢測組織切片分組貼好條形碼，開始上機(jī)掃描操作。

5 組織免疫組織化學(xué)染色

5.1 免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記染色

使用羅氏BenchMark全自動免疫組織化學(xué)染色儀，用EnVision法進(jìn)行雙標(biāo)記。儀器染色程序：pH 8.5修復(fù)液Tris 98℃抗原修復(fù)60min；第一次標(biāo)記，一抗37℃孵育；二抗(通用 HRP 多聚體，即用型)37℃孵育8min；以DAB呈色8min；94℃抗體變性滅活4min；第二次標(biāo)記一抗37 ℃孵育；二抗(通用 AP 聚合體，即用型)37℃孵育8min；以FR呈色8min。其中第一組切片，第一次標(biāo)記一抗CKpan（37℃孵育40min），第二次標(biāo)記一抗CD34（37℃孵育32min）或標(biāo)記一抗D2-40（37℃孵育48min）。第二組切片，第一次標(biāo)記一抗CKpan（37℃孵育40min），第二次標(biāo)記一抗S-100（37℃孵育52min）。染色程序結(jié)束后，少許稀釋洗潔精去除油膜，清水將切片清洗干凈。蘇木素復(fù)染，電吹風(fēng)微風(fēng)吹干，二甲苯透明，中性樹膠封固。

5.2 免疫組織化學(xué)單標(biāo)記

使用羅氏BenchMark全自動免疫組織化學(xué)染色儀，用EnVision法進(jìn)行單標(biāo)記。儀器染色程序：pH 8.5修復(fù)液Tris 98℃抗原修復(fù)60min；一抗37℃孵育；二抗(通用 HRP 多聚體，即用型)37℃孵育8min；以DAB呈色8min。將對照組20例切片，分別進(jìn)行CKpan、CD34、D2-40、S-100單標(biāo)記，其中一抗CKpan（37℃孵育40min）、一抗CD34（37℃孵育32min）、一抗D2-40（37℃孵育48min）、一抗S-100（37℃孵育52min）。染色程序結(jié)束后，少許稀釋洗潔精去除油膜，清水將切片清洗干凈。蘇木素復(fù)染，無水乙醇脫水，電吹風(fēng)微風(fēng)吹干，二甲苯透明，中性樹膠封固。

6 統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)均采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗，計數(shù)資料采用頻數(shù)分布計算。

結(jié) 果

免疫組織化學(xué)雙標(biāo)標(biāo)記結(jié)果顯示，CKpan陽性顆粒定位在上皮細(xì)胞（在此為上皮性腫瘤細(xì)胞，即癌細(xì)胞）的胞質(zhì)，DAB呈色陽性顆粒為棕褐色，CD34（D2-40）陽性顆粒定位在血管（淋巴管）內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜/胞質(zhì)，F(xiàn)R呈色陽性顆粒為玫瑰紅色（圖1、圖2）；S-100陽性顆粒定位在神經(jīng)纖維細(xì)胞的胞核/胞質(zhì)，F(xiàn)R顯色陽性顆粒為玫瑰紅色（圖3）。腫瘤侵犯血管淋巴管染色結(jié)果顯示，被侵犯的標(biāo)記成瑰紅色的血管、淋巴管中，可見標(biāo)記成棕色的腫瘤細(xì)胞。腫瘤侵犯神經(jīng)纖維染色結(jié)果顯示，被侵犯的標(biāo)記成瑰紅色的神經(jīng)纖維中，可見標(biāo)記成棕色的腫瘤細(xì)胞。單標(biāo)記免疫組織化學(xué)染色顯示，CKpan陽性顆粒定位在上皮細(xì)胞的胞質(zhì)（圖4），CD34陽性顆粒定位在血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜/胞質(zhì)(圖5)，D2-40陽性顆粒定位在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜/胞質(zhì)（圖6），S-100陽性顆粒定位在神經(jīng)纖維細(xì)胞的胞核/胞質(zhì)，DAB呈色陽性顆粒為棕褐色（圖7）。

在對照組中，CKpan、CD34（或D2-40）、S-100免疫組織化學(xué)單標(biāo)記不能顯示癌細(xì)胞與血管淋巴管及神經(jīng)之間的相互關(guān)系，必須將標(biāo)記腫瘤組織細(xì)胞的切片與標(biāo)記血管淋巴管或神經(jīng)的切片在顯微鏡下反復(fù)觀察比對，在無法確定腫瘤組織是否存在血管淋巴管或神經(jīng)纖維中，就無法確定腫瘤是否侵犯。

對雙標(biāo)標(biāo)本統(tǒng)計分析顯示，在可疑腫瘤血管淋巴管侵犯的30例中，腫瘤血管淋巴管侵犯陽性28例，陽性率為93.3%；可疑神經(jīng)侵犯的12例中，腫瘤侵犯神經(jīng)纖維陽性10例，陽性率為83.3%。

圖1 CKpan和CD34免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色，顯示腎盂尿路上皮癌細(xì)胞侵犯血管。棕色為癌細(xì)胞（箭頭）CKpan陽性，玫瑰紅色為血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34陽性；標(biāo)尺，100μmFig. 1 CKpan and CD34 double-stain immunohistochemistry of renal pelvis cancer. Urothelial carcinoma cells which were positive for CKpan and stained brown (arrowhead) were visible in surrounding blood vessel where vascular endothelial cells were positive for CD34 and stained as rose red; scale bar, 100μm

圖2 CKpan和D2-40免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色，顯示胃癌細(xì)胞侵犯淋巴管。棕色為癌細(xì)胞（箭頭）CKpan陽性，玫瑰紅色為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞D2-40陽性；標(biāo)尺，100μmFig. 2 CKpan and D2-40 double-stain immunohistochemistry of gastric cancer. Gastric cancer cells that were positive for CKpan and stained brown (arrowhead) were evident in surrounding lymphatic vessel where lymphatic endothelial cells were positive for D2-40 and stained rose red;scale bar, 100μm

圖3 CKpan和 S-100免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色，顯示胃癌細(xì)胞侵犯神經(jīng)。棕色為癌細(xì)胞CKpan陽性，玫瑰紅色為神經(jīng)纖維（箭頭）S-100陽性；標(biāo)尺，50μmFig. 3 CKpan and S-100 double-stain immunohistochemistry of gastric cancer. Gastric adenocarcinoma cells that were positive for CKpan and stained brown were found in neighboring nerve fiber (arrowhead) which were positive for S-100 and stained rose red; scale bar, 50μm

圖4 CKpan免疫組化單標(biāo)記染色，顯示胃癌可疑侵犯毛細(xì)血管。棕色為癌細(xì)胞（箭頭）CKpan陽性；標(biāo)尺，100μmFig. 4 CKpan single-stain immunohistochemistry of gastric cancer. Gastric cancer cells suspected to invade capillary were positive for CKpan and stained as brown (arrowhead); scale bar, 100μm

圖5 CD34免疫組化單標(biāo)記染色，顯示可疑胃癌侵犯血管。棕色為血管內(nèi)皮細(xì)胞（箭頭）CD34陽性；標(biāo)尺，50μmFig. 5 CD34 single-stain immunohistochemistry of blood vessel. Gastric cancer cells were suspected to invade blood vessel where vascular endothelial cells were positive for CD34 and stained brown; scale bar, 50μm

圖6 D2-40免疫組化單標(biāo)記染色，顯示胃癌細(xì)胞可疑侵犯淋巴管。棕色為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（箭頭）D2-40陽性；標(biāo)尺，50μmFig. 6 D2-40 single-stain immunohistochemistry of lymphatic vessel.Gastric cancer cells were suspected to invade lymphatic vessel where lymphatic endothelial cells were positive for D2-40 and stained brown(arrowhead); scale bar, 50μm

圖7 S-100免疫組化單標(biāo)記染色，顯示直腸癌細(xì)胞可疑侵犯神經(jīng)纖維。棕色為神經(jīng)纖維（箭頭）S-100陽性；標(biāo)尺，50μmFig. 7 S-100 single-stain immunohistochemistry of nerve fibers. Rectal cancer cells were suspected to invade nerve fibers which were positive for S-100 and stained brown (arrowhead); scale bar, 50μm

討 論

免疫組織化學(xué)雙標(biāo)法較早應(yīng)用于前列腺上皮與基底細(xì)胞的雙重染色，對于鑒定基底細(xì)胞是否存在，有無浸潤性生長，確定病變性質(zhì)，具有重要意義[2-3]。后來推而廣之，應(yīng)用于消化道腫瘤、乳腺腫瘤中[4-7]，對確定細(xì)胞類型、確定腫瘤性質(zhì)及微轉(zhuǎn)移灶等有很大幫助。腫瘤組織是否突破基底膜、基底細(xì)胞或肌上皮細(xì)胞、侵犯神經(jīng)和血管淋巴管等，是判斷惡性腫瘤的重要依據(jù)。在HE染色下不易判斷時，可運(yùn)用免疫組織化學(xué)雙標(biāo)法確定腫瘤有無侵襲性生長；如組織空隙中見異型細(xì)胞，是人工假象還是血管淋巴管內(nèi)癌栓，通過雙標(biāo)法可以明確判斷癌細(xì)胞有無侵犯血管淋巴管或神經(jīng)等。與傳統(tǒng)免疫組織化學(xué)單標(biāo)法比較，陽性定位清晰，標(biāo)記顏色對比鮮明，一目了然，對病理診斷很有幫助。

關(guān)于癌細(xì)胞侵犯血管淋巴管與神經(jīng)的免疫組織化學(xué)雙標(biāo)法，目前尚未見專門報道，亦無統(tǒng)一操作規(guī)范和流程。我們?yōu)榇诉M(jìn)行了探索。根據(jù)既往經(jīng)驗，除了單標(biāo)法中需要注意的質(zhì)控細(xì)節(jié)，更要關(guān)注到免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色獨(dú)特的方面，特別是要避免兩種顯色方法的互相干擾。本文免疫組織化學(xué)雙標(biāo)法的目的是觀察同一區(qū)域中不同細(xì)胞類型的不同染色反應(yīng)以及它們之間的相互關(guān)系，不同顏色顯示抗原定位表達(dá)非常直觀。抗體組合選擇盡量避免使用同源抗體結(jié)合（如鼠與鼠或兔與兔同源抗體），而選擇不同源抗體結(jié)合（鼠源性抗體與兔源性抗體結(jié)合等），以減少同源抗體間的交叉反應(yīng)。同時要考慮抗體組合在標(biāo)記中過程中的相互作用，包括滅活、抗原修復(fù)條件及抗體標(biāo)記的先后搭配等程序，防止相互干擾影響染色效果。多重標(biāo)記用特定酶的集中色原，每一種都產(chǎn)生一種不同的有色反應(yīng)終產(chǎn)物，多種技術(shù)可用于相同切片的定位。如果一抗體來自相同種屬并有相同的亞類，就必須清除其間的交叉反應(yīng)。使用不同種屬或不同亞類的一抗的方法要簡單很多[1]。

必須考慮雙標(biāo)法組合中兩抗原修復(fù)條件、表達(dá)強(qiáng)弱、顯色先后等染色過程中可能相互影響的因素，如盡量選擇兩種抗原修復(fù)程度相對一致的抗體組合。不同抗體表達(dá)的強(qiáng)弱有異，選擇抗體標(biāo)記的先后也十分關(guān)鍵，兩種顯色方法，顏色或許會發(fā)生重疊，因此需要將不容易顯色、顯色較弱的標(biāo)記先顯色，而比較容易顯色的標(biāo)記在后面。顯色的順序一般以著色穩(wěn)定、不易褪色的底物先染，避免后續(xù)染色對前面的染色造成影響，常規(guī)建議先染DAB[8]。FR顯色后需水洗，接觸乙醇可使標(biāo)記的紅色褪去，令實驗失敗。

為保證質(zhì)量，我們對每組預(yù)定抗體組合進(jìn)行反復(fù)預(yù)試驗，以探索最佳的染色方案，優(yōu)化雙標(biāo)程序。經(jīng)過一定數(shù)量的組織檢測，對結(jié)果進(jìn)行重復(fù)性的對比，及陰、陽性對照。待達(dá)到滿意結(jié)果后，才將優(yōu)化程序相對固定下來，在診斷實踐中推廣應(yīng)用，并將在以后的染色中觀察變化，不斷完善。

免疫組織化學(xué)雙色標(biāo)記的判讀，在光學(xué)顯微鏡下觀察，先確定陰性、陽性對照表達(dá)清晰易辨，定位正確，才可對檢測標(biāo)本進(jìn)行判讀。免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記與單標(biāo)記陽性判讀有所不同，需先了解標(biāo)記組合的中每種抗體陽性定位，同時確定每種抗體的顯色反應(yīng)，對每種單項抗體標(biāo)記進(jìn)行判讀。同時關(guān)注組合抗體之間表達(dá)的相互關(guān)系，客觀對表達(dá)結(jié)果的正確性進(jìn)行分析。對定位或顯色不正確的應(yīng)重新進(jìn)行標(biāo)記。

免疫組織化學(xué)雙標(biāo)法使用要有目的性，盲目運(yùn)用可導(dǎo)致結(jié)果無說服力而失去意義。近年來，我們在工作實踐中不斷探索和嘗試，規(guī)范操作控制質(zhì)量，逐漸形成了一些相對固定的免疫組織化學(xué)雙標(biāo)法程序，即前述操作程序，為病理確診提供很大幫助，但還需進(jìn)一步改進(jìn)與完善。

[1] 班克羅夫特，著.組織學(xué)技術(shù)的理論與實踐. 周小鴿，劉勇，主譯. 第6版.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2010：375-378.

[2] 王翠芝，周小鴿，黃受方，等. 混合型p504s/34βE12/p63抗體在前列腺癌診斷中的應(yīng)用價值.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2006，22（3）：325-328.

[3] Srinivasan M, Parwani AV. Diagnostic utility of p63/P501S double sequential immunohistochemical staining in differentiating urothelial carcinoma from prostate carcinoma.Diagnostic Pathology, 2011, 6∶ 67-73.

[4] 郭群，衛(wèi)愛軍，王艷煜，等.多種標(biāo)記免疫組織化學(xué)技術(shù)在消化道腫瘤研究中的應(yīng)用.南通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2007，27（4）：247- 251.

[5] 蘭競麗，胡兆鵬，胡湘萍，等. 免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記法P63/SMA在乳腺腫瘤中的表達(dá)及意義.江西醫(yī)學(xué)檢驗，2006，24（1）：51- 52.

[6] 徐薇苓，朱雄增，涂小予，等. 乳腺疾病的SMA/CK免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記法.診斷病理學(xué)雜志，2000，7（3）：189- 190.

[7] 高福平，劉筱韻，魏謹(jǐn)，等. 細(xì)胞角蛋白及CD68在胃腸道淋巴結(jié)微小轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)及意義.實用醫(yī)技雜志，2014，21（11）：1154- 1155.

[8] 林婷，陳惠玲，李萍，等. 免疫組織化學(xué)雙重染色的應(yīng)用及體會. 診斷病理學(xué)雜志，2013，20（6）：383.

Application of immunohistochemical double staining in detection of tumor invasion

Lin Zhen, Liu Dechun*, Yang Wensheng
(Department of pathology, Affiliated Chenggong Hospital of Xiamen University, Xiamen 361003, China)

Object To explore the application of immunohistochemical double staining in detection of tumor invasion. Method 33 cases of tumor tissue specimens were double stained using EnVision method in which DAB and Fast Red were the substrates and chromogens. The method was evaluated based on its ability to distinguish tumor cells from surrounding vascular or lymphatic vessels and nerve fibers. Result In tissue sections, tumor cells were stained brown (DAB), while vascular endothelium and nerve fibers were stained rose red (FR). Among 30 cases that likely had tumor invasion into vascular and lymphatic vessels, 28 cases were found to have brown tumor cells visible in rose red regions of vascular and lymphatic vessels, resulting a positive rate of 93.3%. Among 12 cases that were suspected to have nerve fiber invasion, 10 were found to have tumor cells staining brown presence in nerve fibers staining rose red, giving a positive rate of 83.3%.ConclusionImmunohistochemical double staining with DAB and Fast Red as chromogens could be used to evaluate tumor invasion of nerve tissues, vascular and lymphatic vessels as well as provide measurement for its invasive growth.

Immunohistochemistry; double staining; tumor invasion

R322.74

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 016

2017-04-21

2017-10-10

林蓁，女（1971年），漢族，副主任技師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：ahbbldc@sina.com