吳洪娟，李桂芝，周力，尤敏，高峰，趙巖松

（濰坊醫(yī)學(xué)院1形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2附屬醫(yī)院眼科，濰坊261053）

樹脂包埋半薄切片在視神經(jīng)組織學(xué)和免疫組織化學(xué)研究中的應(yīng)用

吳洪娟1，李桂芝1，周力1，尤敏1，高峰1，趙巖松2*

（濰坊醫(yī)學(xué)院1形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2附屬醫(yī)院眼科，濰坊261053）

目的探討半薄切片在視神經(jīng)組織學(xué)和免疫組織化學(xué)研究中的應(yīng)用，尋找一種視神經(jīng)形態(tài)學(xué)研究和疾病診斷的有效方法。方法健康Sprague-Dawley大鼠視神經(jīng)分別行樹脂包埋制成半薄切片與石蠟包埋制成石蠟切片，分別采用HE、甲苯胺藍(lán)染色及髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein, MBP）免疫組織化學(xué)方法染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并比較半薄切片與石蠟切片染色結(jié)果的差異。結(jié)果石蠟切片HE和甲苯胺藍(lán)染色均顯示視神經(jīng)髓鞘不著色，MBP免疫組織化學(xué)染色示MBP陽(yáng)性著色較重，著色較紊亂，髓鞘著色不清晰。半薄切片HE及甲苯胺藍(lán)染色均顯示髓鞘呈環(huán)形，著色清晰，顏色對(duì)比鮮明；MBP免疫組化染色結(jié)果可見髓鞘呈環(huán)形，非特異性染色不明顯，陽(yáng)性對(duì)比顯著，可清晰顯示髓鞘結(jié)構(gòu)。結(jié)論半薄切片在視神經(jīng)組織學(xué)和免疫組織化學(xué)研究中優(yōu)于石蠟切片，可用于視神經(jīng)疾病的診斷和研究。

視神經(jīng)；樹脂；半薄切片；組織學(xué)；免疫組織化學(xué)；

組織學(xué)和免疫組織化學(xué)研究通常都需要將組織制成薄的切片，而石蠟切片是最基本、應(yīng)用最廣泛的組織切片技術(shù)，是目前臨床病理診斷和科學(xué)研究的重要手段。視神經(jīng)疾病的診斷和研究也離不開切片和組織染色。由于視神經(jīng)組織較小，外面有神經(jīng)鞘膜包裹，制備石蠟切片時(shí)經(jīng)過(guò)脫水透明易產(chǎn)生收縮并變脆，切片容易裂或破碎。本研究采用SPI-Pon環(huán)氧樹脂包埋大鼠視神經(jīng)，并制成1μm半薄切片，進(jìn)行HE染色、甲苯胺藍(lán)染色和免疫組織化學(xué)染色，并與石蠟切片染色效果進(jìn)行觀察比較，以期為視神經(jīng)組織尋找最佳的包埋與切片方法。

材料與方法

1 主要設(shè)備與試劑

組織切片機(jī)（德國(guó)，Leica RM 2235型）；正置光學(xué)研究級(jí)顯微鏡（日本，OLYMPUS，BX 51）；超薄切片機(jī)（奧地利，Ultracut E型）。

HE染液、甲苯胺藍(lán)（Solarbio公司）；兔抗髓鞘堿性蛋白（MBP）一抗（武漢博士德生物試劑有限公司）；二抗試劑盒、DAB顯色劑（北京中杉金橋生物科技有限公司）。

甲苯胺藍(lán)染液的配制[1]：四硼酸鈉1g，用100 ml雙蒸水加熱溶解后，再加入甲苯胺藍(lán)1g，待全部溶解后過(guò)濾，室溫保存如配制時(shí)間較久，其表面會(huì)形成一層氧化膜，影響染色，可用前再過(guò)濾。

2 動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)分組

成年健康SD大鼠10只，購(gòu)自青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK（魯）20140001]，體重為200～230g，雌雄不拘，隨機(jī)分為兩組：半薄切片組與石蠟切片組，每組各5只。

3 樣品采集與制備

10%水合氯醛腹腔麻醉后，依次0.9%的生理鹽水、4%多聚甲醛心臟灌注后，立即摘除眼球，切下視神經(jīng)，半薄切片組迅速放入3%戊二醛固定液固定，行常規(guī)透射電鏡樣品制備，SPI-Pon環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)1mm切片，置于涂有APES的載玻片上，加熱展平烘干備用；石蠟切片組放入4%多聚甲醛固定液，行常規(guī)石蠟包埋，并制成 4mm切片，撈于涂有APES的載玻片上，60～70℃烤片2h備用。

4 HE染色

石蠟切片：切片脫蠟至水，蘇木素染色5min，自來(lái)水洗；1%鹽酸酒精分化5s，自來(lái)水洗；伊紅染色1min，水洗；酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

半薄切片：滴加2.5%過(guò)碘酸，60℃15min，水洗烤干；滴加蘇木素染液，60℃30min，水洗烤干；滴加1%伊紅染液，60℃5min，水洗烤干；二甲苯透明，中性樹膠封片。

5 甲苯胺藍(lán)染色

石蠟切片：切片脫蠟至水，甲苯胺藍(lán)液30min，稍水洗；冰醋酸液分化3s，蒸餾水中洗兩次，冷風(fēng)吹干；二甲苯透明，中性樹膠封片。

半薄切片：滴加甲苯胺藍(lán)染液，60℃30s，水洗，烤干，二甲苯透明，中性樹膠封片。

6 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片：脫蠟至水，PBS洗；0.3%H2O25min，0.01mol/L PBS洗；正常血清室溫10min；一抗室溫30min、4℃冰箱過(guò)夜、室溫復(fù)溫30min，0.01mol/L PBS洗；二抗37℃ 孵育60 min，0.01mol/L PBS洗；DAB鏡下顯色，至陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒終止顯色，去離子水充分沖洗；酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

半薄切片：2.5%過(guò)碘酸脫樹脂，60℃15min，水洗，PBS洗；余同石蠟切片免疫組織化學(xué)染色方法。

結(jié) 果

HE染色石蠟切片髓鞘不著色，分界不清，少突膠質(zhì)細(xì)胞胞漿紅色，核紫藍(lán)色，形狀不規(guī)則散在（圖1A）。半薄切片神經(jīng)髓鞘橫切面呈紫藍(lán)色大小不等的環(huán)狀，少突膠質(zhì)細(xì)胞核呈藍(lán)色，核仁深染清晰，間質(zhì)淡紫色，分界清楚（圖1B)。

圖1 視神經(jīng)石蠟切片與半薄切片HE染色比較。A，石蠟切片HE染色，髓鞘不著色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色；B，半薄切片HE染色，髓鞘呈紫紅色、大小不等的環(huán)形，間質(zhì)不著色，分界清楚；比例尺，10μmFig. 1 The comparison between paraffin and semi-thin section of optic nerve using HE staining. A, HE stained paraffin section. Myelin sheaths were not well stained. Nuclei were counter-stained blue-purple; B, HE stained semi-thin section. Myelin sheaths in variable sizes were stained purple. Stroma with clear boundary was not stained; scale bar, 10μm.

甲苯胺藍(lán)染色石蠟切片髓鞘不著色，只呈現(xiàn)淡藍(lán)色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與間質(zhì)分界不清；少突膠質(zhì)細(xì)胞散在，形態(tài)不規(guī)則，核深藍(lán)色（圖2A）。半薄切片神經(jīng)髓鞘橫切面呈深藍(lán)環(huán)狀，大小不等，厚薄不一，少突膠質(zhì)細(xì)胞核淡染，胞漿深藍(lán)色，間質(zhì)淡染，分界清楚（圖2B）。

圖2 視神經(jīng)石蠟切片與半薄切片甲苯胺藍(lán)染色比較。A，石蠟切片甲苯胺藍(lán)染色, 髓鞘不著色，細(xì)胞核深藍(lán)色；B，半薄切片甲苯胺藍(lán)染色，髓鞘呈深藍(lán)色、大小不等的環(huán)形，間質(zhì)淡染，分界清楚；比例尺，10μmFig. 2 The comparison between paraffin and semi-thin section of optic nerve using toluidine blue staining. A, toluidine blue stained paraffin section.Myelin sheaths were poorly stained and Nuclei were counter-stained dark blue; B, toluidine blue stained semi-thin section. Myelin sheaths in variable sizes were stained dark blue. Stroma with clear boundary was not stained; scale bar, 10μm.

MBP免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片呈棕黃色，陽(yáng)性著色多，顯示著色較紊亂，髓鞘著色不清晰（圖3A）。半薄切片可見髓鞘呈環(huán)形，棕黃或棕褐色，非特異性染色不明顯，間質(zhì)不著色，分界清楚（圖3B）。

圖3 視神經(jīng)石蠟切片與半薄切片MBP免疫組化染色比較。A，石蠟切片MBP免疫組化染色，MBP陽(yáng)性呈棕黃色，髓鞘著色不清晰；B，半薄切片MBP免疫組化染色，髓鞘呈環(huán)形，棕黃或棕褐色，非特異性染色不明顯，間質(zhì)不著色；比例尺，10μmFig. 3 The comparison between paraffin and semi-thin sections of optic nerve using MBP staining. A, MBP stained paraffin section. Myelin sheaths were stained brown however lacked clarity; B, MBP stained semi-thin section. Myelin sheaths were stained brown in clear and circular structure. The non-specific staining was insignificant; scale bar, 10μm

討 論

環(huán)氧樹脂包埋半薄切片是電鏡樣品制備過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，切片厚度為0.5～2μm，主要用于電鏡超薄切片的準(zhǔn)確定位，避免超薄切片的盲目性，提高電鏡觀察的準(zhǔn)確性。環(huán)氧樹脂包埋塊具有較高的硬度和較好的韌性，切片用的玻璃刀或鉆石刀也更加鋒利，可以制作0.5～1μm的切片，由于切片薄，樣品結(jié)構(gòu)保存好，圖像的清晰度、分辨率遠(yuǎn)優(yōu)于石蠟切片，有利于獲得高質(zhì)量的光鏡圖像，被廣泛應(yīng)用于組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)的教學(xué)、科研和病理診斷[2]。

石蠟切片是形態(tài)學(xué)研究和病理學(xué)診斷的基本技術(shù)，應(yīng)用廣泛。由于包埋劑石蠟硬度的局限性，切片厚度一般只能切3～4μm以上。視神經(jīng)組織較小，有神經(jīng)鞘膜包裹，石蠟不容易浸透，且經(jīng)過(guò)脫水、透明易收縮和變脆，造成切片時(shí)從鞘膜處脫離、破碎或不易切片。

我們將視神經(jīng)用環(huán)氧樹脂包埋進(jìn)行半薄切片，切片完整，結(jié)構(gòu)清晰、保存完好，與石蠟包埋切片同時(shí)進(jìn)行了HE、甲苯胺藍(lán)髓鞘染色和MBP免疫組化染色，結(jié)果顯示，石蠟切片HE染色和甲苯胺藍(lán)染色，都能清晰顯示神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，但髓鞘都不著色，這主要是由于視神經(jīng)的主要成分是類脂，在常規(guī)包埋處理的標(biāo)本上，因髓鞘中的類脂被溶解，故染色時(shí)髓鞘不著色[3]。而半薄切片由于標(biāo)本處理時(shí)使用了鋨酸固定，對(duì)髓鞘的類脂成分有很好的固定作用，且經(jīng)鋨酸固定后的類脂質(zhì)組織不會(huì)被脂溶性溶劑溶解[4]，所以半薄切片HE染色和甲苯胺藍(lán)染色都能較好地顯示神經(jīng)髓鞘。視神經(jīng)半薄切片進(jìn)行免疫組化染色也得到較好的結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)物清晰，非特異性著色少，對(duì)所檢測(cè)成份存在位點(diǎn)更明確，背景著色較石蠟切片明顯減少，對(duì)比度明顯提高，特異性好，這可能與半薄切片切片薄、組織重疊少、抗原位點(diǎn)暴露更充分有關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，視神經(jīng)用樹脂包埋半薄切片，組織學(xué)染色著色鮮明，結(jié)構(gòu)清晰，能顯示石蠟切片不能顯示的微細(xì)結(jié)構(gòu)；HE染色和甲苯胺藍(lán)染色各具特點(diǎn)：甲苯胺藍(lán)染色方法簡(jiǎn)便，易于操作，不需要脫樹脂，染色幾十秒即可清晰地顯示髓鞘和神經(jīng)細(xì)胞。蘇木素染色步驟較多，染色時(shí)間較長(zhǎng)，結(jié)果清晰，對(duì)比度好，不易退色。兩種方法均可用于視神經(jīng)髓鞘的研究、病理診斷及教學(xué)切片的制備。

由于半薄切片的包埋介質(zhì)是樹脂，其封閉了組織細(xì)胞的著色性，同時(shí)鋨酸固定后的黑色也影響染色效果，因此半薄切片染色前需要腐蝕掉樹脂和鋨酸。用2.5%過(guò)碘酸能較好地脫掉樹脂和鋨酸，增強(qiáng)著色性又不損傷組織結(jié)構(gòu)，是半薄切片染色前較好的脫樹脂方法[5]。為增加染液的穿透能力和著色性，半薄切片染色時(shí)需要加熱，所以染色要在濕盒中進(jìn)行，以防止加熱時(shí)染液被烤干。

[1] 劉冬娟，祝素文，李艷杰. 硼砂甲苯胺藍(lán)染液在半薄切片染色上的應(yīng)用. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，33（1）：33.

[2] 孫淑清，曲寶清，孫異臨，等. 樹脂薄切片在周圍神經(jīng)病變?cè)\斷中的應(yīng)用. 中華病理學(xué)雜志，2002，31（1）：75-76.

[3] 高英茂. 組織學(xué)與胚胎學(xué). 北京：科學(xué)出版社，2007，90.

[4] 顧兵，金建波，李華南，等。神經(jīng)組織染色方法的研究概況. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（10）：1472-1475.

[5] 吳洪娟，周力，李桂芝，等. 肥大細(xì)胞電鏡半薄切片染色. 電子顯微學(xué)報(bào)，2012，31（5）：452-454.

Application of resin-embedded semi-thin section in histological and immunohistochemical study of optic nerve

Wu Hongjuan1, Li Guizhi1, Zhou Li1, You Min1, Gao Feng1, Zhao Yansong2*
(1Morphological Laboratory,2Department of Ophthalmology, Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

ObjectiveTo explore the application of resin-embedded semi-thin section in histological and immunohistochemical study of optic nerve morphology and disease diagnosis.MethodsSprague-Dawley rat optic nerve specimens were prepared using either resin embedded semi-thin section or paraffin embedded section. The effects of two methods on HE, toluidine blue and myelin basic protein (MBP) immunohistochemical staining were evaluated and compared using light microscope.ResultsIn paraffin sections, optic nerve myelin sheaths were poorly stained with HE or toluidine blue, while MBP over-stained tissues and made the tissue structures especially myelin sheaths hard to distinguish. In semi-thin sections, both toluidine blue and HE stained circular myelin sheaths with clarity and strong contrast. MBP also stained circular myelin sheath clearly with reduced non-specific binding.ConclusionSemi-thin section is superior to paraffin section in the histological and immunohistochemical staining of optic nerve, therefore may be used in the diagnosis and research of optic nerve diseases.

Optic nerve; resin; semithin sections; histology; immunohistochemistry

R331

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 017

2017-06-23

2017-10-11

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2013HL067）；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2013WS0295）

吳洪娟，女（1965年），漢族，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：zhaoyansong74@163.com