黃焱，鄭衛(wèi)東，尤加慧，徐國興

（1福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)技學(xué)院眼視光學(xué)系；2福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，福州 350004 ）

抑制miR-34a減少高糖代謝記憶所致視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞SIRT1下調(diào)和凋亡

黃焱1，鄭衛(wèi)東2*，尤加慧2，徐國興2

（1福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)技學(xué)院眼視光學(xué)系；2福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，福州 350004 ）

目的探討miR-34a在視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）細(xì)胞高糖“代謝記憶”中的作用及其機(jī)制，為糖尿病視網(wǎng)膜病的防治提供新的策略。方法RPE細(xì)胞用高糖培養(yǎng)4d后換用正常糖濃度培養(yǎng)4d，模擬糖尿病高糖代謝記憶模型，用miR-34a mimic和miR-34a inhibitor改變高糖代謝記憶RPE細(xì)胞內(nèi)miR-34a表達(dá)，實時定量PCR檢測miR-34a表達(dá)水平，免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測組蛋白去乙?；窼irtuin 1（SIRT1）水平，annexin V-PI法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果實時定量PCR檢測顯示，高糖培養(yǎng)和代謝記憶可顯著升高RPE細(xì)胞內(nèi)miR-34a表達(dá)水平，miR-34a mimic可進(jìn)一步顯著上調(diào)代謝記憶RPE細(xì)胞內(nèi)miR-34a表達(dá)水平，miR-34a inhibitor可顯著下調(diào)代謝記憶RPE細(xì)胞內(nèi)miR-34a水平；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，高糖培養(yǎng)和代謝記憶可使RPE細(xì)胞內(nèi)STRT1免疫反應(yīng)性顯著降低，過表達(dá)miR-34a進(jìn)一步下調(diào)代謝記憶RPE細(xì)胞內(nèi)STRT1免疫反應(yīng)性，而miR-34a inhibitor則可抑制代謝記憶對RPE細(xì)胞內(nèi)STRT1免疫反應(yīng)性的下調(diào)作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)和代謝記憶使RPE細(xì)胞凋亡明顯增加，過表達(dá)miR-34a進(jìn)一步增加代謝記憶RPE細(xì)胞凋亡，而miR-34a inhibitor則顯著抑制代謝記憶RPE細(xì)胞凋亡的增加。結(jié)論miR-34a抑制劑能通過抑制高糖代謝記憶對RPE細(xì)胞SIRT1水平的下調(diào)和細(xì)胞凋亡的增加，部分逆轉(zhuǎn)高糖代謝記憶效應(yīng)，防治糖尿病視網(wǎng)膜病變。

高糖；代謝記憶；視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；miR-34a；Sirtuin 1

近年來，幾項大規(guī)模臨床試驗研究如美國糖尿病控制和并發(fā)癥研究(Diabetes Control and Complications Trial，DCCT）[1]、糖尿病干預(yù)與并發(fā)癥流行病學(xué)研究(Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications，EDIC）[2]以及英國糖尿病前瞻性研究（United Kingdom Prospective Diabetes Study，UKPDS）[3]提出了糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的“代謝記憶”現(xiàn)象，即糖尿病患者早期暴露于高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致疾病進(jìn)展和晚期并發(fā)癥的發(fā)生，盡管后期高血糖水平得到改善，但這種改變持續(xù)存在，該現(xiàn)象被稱為“代謝記憶”[4]。“代謝記憶”現(xiàn)象的提出標(biāo)志著對糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識有了一個突破性的進(jìn)展，同時也對其防治提出了新的挑戰(zhàn)。近期研究提示“代謝記憶”原因之一可能是靶細(xì)胞的表觀遺傳改變。表觀遺傳是指在核苷酸序列不發(fā)生變化的情況下，基因的表達(dá)活性發(fā)生了可遺傳的改變。這種改變是可逆的，并受到環(huán)境、飲食、藥物等因素的調(diào)節(jié)。表觀遺傳的可逆性為研究早期干預(yù)，糾正不良“代謝記憶”提供了科學(xué)依據(jù)[5]。

高糖“代謝記憶”導(dǎo)致糖尿病慢性并發(fā)癥的機(jī)制未明確，目前，與代謝記憶相關(guān)的表觀遺傳機(jī)制研究主要涉及DNA甲基化、組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾、非編碼miRNA調(diào)節(jié)和染色體重塑等。miR-34a受染色體、p53及其啟動子區(qū)域CpG島甲基化等因素的調(diào)節(jié)，并通過調(diào)控多種靶基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡。miR-34基因家族（miR-34a/b/c）在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)增加，其可調(diào)控p53轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)p53介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡和衰老，從而誘導(dǎo)視網(wǎng)膜視神經(jīng)和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[6]。在高糖作用于視網(wǎng)膜后改變miR-34a，如何進(jìn)一步通過改變表觀遺傳修飾，逆轉(zhuǎn)視網(wǎng)膜的“代謝記憶”效應(yīng)，達(dá)到治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的目的，目前未見相關(guān)研究報道。本課題旨在研究miR-34a是否能通過調(diào)節(jié)SIRT1表達(dá)對產(chǎn)生“代謝記憶”的視網(wǎng)膜起保護(hù)作用。

材料和方法

1 主要試劑

5mmol/L和25mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，miR-34a mimic和miR-34a inhibitor化學(xué)合成試劑購自銳博生物科技有限公司，SG Fast qPCR Master Mix（High Rox）（B639273）購自BBI公司，免疫細(xì)胞化學(xué)超敏SP（鼠/兔）（KIT-9706）試劑盒購自福州邁新公司，Tris（T0826）、SDS（S0227）、甲醇 （MT6806）、甘氨酸（G0167）、Tween-20（T0777）、BCA試劑盒（SK3021）、兔抗β-actin抗體(AB10001)、HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG （AB10058）及ECL發(fā)光試劑盒（SK6668）等Western blot檢測相關(guān)試劑購自生工生物工程有限公司，SIRT-1抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（KGA107）購自凱基生物公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

購自美國University of South Carolina的RPED407細(xì)胞復(fù)蘇、傳代并接種至25cm2的培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按6孔板每孔3×105個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，補(bǔ)充培養(yǎng)液至3ml。將24孔板專用細(xì)胞爬片圓形蓋玻片潤濕并貼于細(xì)胞培養(yǎng)板底部板壁，按每孔2×104個細(xì)胞的密度接種于24孔板中，補(bǔ)充培養(yǎng)液至500μl。種板12h后，轉(zhuǎn)染miR-34a mimic/inhibitor。miR-34a mimic轉(zhuǎn)染濃度為100nmol/L，miR-34a inhibitor轉(zhuǎn)染濃度為200nmol/L。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h。

3 實驗分組

細(xì)胞共分為6組，正常組：5mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)8d（4d為1代）；高糖組：25mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)8d天；代謝記憶組：25mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)4d后，5mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)4d[7]；代謝記憶干預(yù)對照組：25mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)4d后，轉(zhuǎn)染不含miR-34a mimic/inhibitor的轉(zhuǎn)染試劑繼續(xù)5mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)4d；代謝記憶miR-34a 過表達(dá)組：25mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)4d后，轉(zhuǎn)染miR-34a mimic繼續(xù)5mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)4d；代謝記憶miR-34a抑制組：25mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)4d后，轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor繼續(xù)5mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)4d。

4 實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR

采用柱式microRNA抽提試劑盒抽提RNA，管家基因引物序列U6(F)5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；U6 (R)5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；目的基因引物序列hsa-miR-34a (F)5’-ACACTCCAGCTGGGTGGCAGTGTCTTAG-3’；hsa-miR-34a (R)5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’； 抽 提 后 進(jìn)行RNA濃度和純度分析及完整性測試。用第一鏈cDNA合成試劑盒（AMV First Strand cDNA Synthesis Kit） (SK2445)逆轉(zhuǎn)錄，特異性引物序列如下：miR-34a-5p RT：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAACCAG-3’。把加好樣品的96孔板放在ABI StepOne Plus型熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。分別測定每個目的基因及內(nèi)參U6基因擴(kuò)增的Ct值，每個樣本均做3個平行復(fù)孔，運(yùn)用2-ΔΔCT方法計算該目的基因的相對定量。

5 STRT1的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測

將各組細(xì)胞爬片用95%乙醇固定后，按照超敏SP試劑盒說明書進(jìn)行SIRT1表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測。光鏡下觀察各組RPE細(xì)胞中SIRT1表達(dá)的部位以及強(qiáng)弱，每張切片取5個視野進(jìn)行攝片，應(yīng)用美國顯微鏡圖像分析軟件（Image Pro Plus，IPP）對圖片分析，計數(shù)每個高倍鏡視野下SIRT1陽性細(xì)胞百分率和測定陽性細(xì)胞光密度（IOD）。

6 SIRT1的Western blot檢測

將收集的細(xì)胞沉淀，按6孔板中的兩孔作為一組樣本加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，低溫離心（4℃，12000r/min，10min），小心吸取上清至新的EP管，重復(fù)離心一次，小心吸取上清，取得總蛋白，BCA法測蛋白濃度。以β-actin作為內(nèi)參。在10%SDS-PAGE凝膠中電泳，電壓為120V，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉lh，用TBST將SIRT1和β-actin一抗稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛龋谷胧⒂心さ呐囵B(yǎng)皿中，溫育1.5h或4℃孵育過夜。TBST液清洗3次，二抗用TBST按濃度1∶3000稀釋，倒入盛有膜的培養(yǎng)皿中，置于脫色搖床上室溫孵育1.5h。用TBST在脫色搖床上清洗4次，每次5min，取出PVDF膜，以發(fā)光試劑ECL孵育后，使用Image J圖像分析軟件，測定各條帶的平均光密度，以目的蛋白條帶的平均光密度值與內(nèi)參蛋白條帶的平均光密度值的比值作為目的蛋白相對水平。

7 細(xì)胞凋亡的annexin V-PI法流式細(xì)胞術(shù)檢測

收集各組細(xì)胞，在1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析：用流式細(xì)胞儀（BD Accuri C6）檢測，激發(fā)波長Ex-=488nm，發(fā)射波長Em=530nm；annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測，PI紅色熒光通過FL3通道檢測；使用經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞作為對照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)，去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。

8 圖像分析及統(tǒng)計學(xué)處理

采用IPP6.0和Image J進(jìn)行圖像分析，SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-34a inhibitor抑制代謝記憶對RPE細(xì)胞內(nèi)miR-34a水平的上調(diào)

對各組RPE細(xì)胞的miR-34a水平實時定量PCR檢測顯示，高糖組顯著高于正常組，代謝記憶組高于正常組，但較高糖組降低，而與代謝記憶干預(yù)對照組無顯著差異；代謝記憶miR-34a 過表達(dá)組大幅度升高，而代謝記憶miR-34a 抑制組顯著低于代謝記憶組和代謝記憶干預(yù)對照組（圖1），表明RPE細(xì)胞生長于高糖環(huán)境，導(dǎo)致miR-34a表達(dá)增加，增加后細(xì)胞離開高糖環(huán)境正常糖培養(yǎng)，細(xì)胞仍然持續(xù)高表達(dá)miR-34a，可以通過miR-34a 抑制劑來降低其表達(dá)水平。

圖1 miR-34a抑制劑對代謝記憶RPE細(xì)胞miR-34a表達(dá)的影響。a：與正常組比較，P＜0.01；b：與高糖組比較，P＜0.01；c：與代謝記憶組和代謝記憶干預(yù)對照組比較，P＜0.01；n=3Fig. 1 effect of miR-34a inhibitor on miR-34a expression in RPE cells.a∶ P＜0.01vs normal control group; b∶ P＜0.01vs high glucose group; c∶P＜0.01 vs metabolic memory group and metabolic memory intervention control group; n=3

2 miR-34a inhibitor抑制代謝記憶導(dǎo)致的RPE細(xì)胞內(nèi)SIRT1免疫反應(yīng)性的降低

免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，SIRT1主要表達(dá)在胞核內(nèi)（圖2A）。高糖培養(yǎng)和代謝記憶的RPE細(xì)胞中，SIRT1免疫反應(yīng)陽性者明顯減少（圖2B，圖2C）；轉(zhuǎn)染表達(dá)miR-34a mimic的代謝記憶RPE細(xì)胞中，SIRT1陽性細(xì)胞進(jìn)一步減少（圖3E），而轉(zhuǎn)染表達(dá)miR-34a inhibitor的代謝記憶RPE細(xì)胞中，SIRT1陽性細(xì)胞顯著多于單純代謝記憶RPE細(xì)胞（圖2F）。采用IPP6.0和Image J進(jìn)行圖像分析顯示，各組RPE細(xì)胞中SIRT1免疫反應(yīng)強(qiáng)度的變化趨勢與陽性細(xì)胞數(shù)的變化趨勢基本一致（圖2G，圖2H）。由此表明，miR-34a inhibitor對代謝記憶降低RPE細(xì)胞內(nèi)SIRT1免疫反應(yīng)性的作用具有抑制作用。

圖2 miR-34a抑制劑對代謝記憶RPE細(xì)胞內(nèi)SIRT1免疫反應(yīng)性的影響。A，正常組；B，高糖組；C，代謝記憶組；D，代謝記憶干預(yù)對照組；E，代謝記憶miR-34a 過表達(dá)組；F，代謝記憶miR-34a 抑制組；比例尺，10μm；G，SIRT1陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計學(xué)分析；H，SIRT1免疫反應(yīng)性統(tǒng)計學(xué)分析； a：與正常組比較，P＜0.01；b：與高糖組比較，P＜0.01；c：與代謝記憶組及代謝記憶干預(yù)對照組比較，P＜0.01； n=5Fig. 2 effect of miR-34a inhibitor on the immunoreactivity of SIRT1 in metabolic memory RPE cells. A, control group; B, high glucose group; C,metabolic memory group; D, metabolic memory intervention control group; E, metabolic memory miR-34a overexpression group; F, metabolic memory miR-34a inhibition group, scale bar, 10μm; G, statistical analysis on number of SIRT1 positive cells; H, statistical analysis on immunoreactivity of SIRT1; a∶ P＜0.01vs the normal group; b∶ P＜0.01 vs high glucose group; c∶ P＜0.01 vs metabolic memory group and metabolic memory intervention control group; n=5

3 miR-34a inhibitor抑制代謝記憶對RPE細(xì)胞內(nèi)SIRT1蛋白的降低

Western blot檢測表明，正常組RPE細(xì)胞中有一定量的SIRT1蛋白，高糖組和代謝記憶組SIRT1相對水平比正常組顯著降低，尤以高糖組降低明顯；miR-34a 過表達(dá)組SIRT1相對水平與代謝記憶組相比降低；miR-34a抑制組RPE細(xì)胞SIRT1與代謝記憶組和代謝記憶干預(yù)對照組相比顯著升高（圖3）。由此表明，miR-34a抑制劑有降低高糖代謝記憶反應(yīng)的RPE細(xì)胞內(nèi)SIRT1蛋白量的作用。

圖3 miR-34a抑制劑對代謝記憶RPE細(xì)胞內(nèi)SIRT1水平的影響。A，SIRT1水平的代表性Western blot檢測；B，SIRT1水平的統(tǒng)計學(xué)分析；a：與正常組比較，0.01＜P＜0.05；b：與高糖組比較，0.01＜P＜0.05；c：與代謝記憶組合代謝記憶干預(yù)對照組比較，0.01＜P＜0.05；n=5Fig. 3 Effects of miR-34a inhibitor on SIRT1 levels in metabolic memory RPE cells. A, level of SIRT1 determined by Western blot; B, statistical analysis on SIRT1 level; a∶ 0.01＜P＜0.05 vs normal group; b∶ 0.01＜P＜0.05 vs high glucose group; c∶ 0.01＜P＜0.05 vs metabolic memory group and metabolic memory intervention control group; n=5

4 miR-34a inhibitor抑制代謝記憶對RPE細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測表明，正常RPE細(xì)胞的凋亡率極低，高糖培養(yǎng)和高糖代謝記憶可顯著增加RPE細(xì)胞的凋亡率，過表達(dá)miR-34a進(jìn)一步增加RPE細(xì)胞的凋亡率，轉(zhuǎn)染表達(dá)miR-34a inhibitor則可顯著降低代謝記憶細(xì)胞的凋亡率（圖4）。

圖4 miR-34a inhibitor抑制代謝記憶對RPE細(xì)胞凋亡的影響。a：與正常組比較，P＜0.01；b：與高糖組比較，P＜0.01；c：與代謝記憶組與代謝記憶干預(yù)對照組比較，P＜0.01；n=5Fig. 4 Effects of miR-34a inhibitor on the apoptosis rate of RPE cells with metabolic memory. a∶ P＜0.01 vs normal group; b∶ P＜0.01 vs high glucose group; c∶ P＜0.01 vs metabolic memory group and metabolic memory intervention control group; n=5

討 論

miRNA是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，它們參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長發(fā)育、分化、增殖和凋亡等，和機(jī)體多種生理和病理過程相關(guān)。miRNA有組織特異性、保守性和時序性等特點。近年來，一些研究表明很多特異性的miRNA在眼球組織包括角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜中均有特定性的表達(dá)，并具有一定特點。miR-34a作為腫瘤抑制因子，可以通過作用于靶蛋白SIRT1導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯或者細(xì)胞凋亡[8]。miR-34a在高糖培養(yǎng)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)顯著增加，miR-34a抑制劑通過增加SIRT1的表達(dá)，減弱下游信號傳導(dǎo)并減少高糖誘導(dǎo)的微血管細(xì)胞的微血管生成。

血-視網(wǎng)膜屏障由內(nèi)、外屏障組成，保持視網(wǎng)膜干燥透明，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜的微環(huán)境，對維持視網(wǎng)膜正常功能有重要作用。視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞參與構(gòu)成視網(wǎng)膜內(nèi)屏障，視網(wǎng)膜的色素上皮（RPE）細(xì)胞參與構(gòu)成視網(wǎng)膜的外屏障，具有屏障、濾過、吞噬和分泌等作用，在維持視網(wǎng)膜正常的生理功能方面發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明，RPE細(xì)胞生長于高糖環(huán)境，導(dǎo)致miR-34a表達(dá)增加，增加后細(xì)胞離開高糖環(huán)境用正常糖培養(yǎng)，細(xì)胞仍然持續(xù)高表達(dá)miR-34a，說明RPE細(xì)胞存在高糖代謝記憶，這種改變可以通過miR-34a 抑制劑來降低其表達(dá)水平。本研究根據(jù)Tewari[9]等報道，選擇在細(xì)胞實驗中采用高糖干預(yù)4天后換用正常糖濃度培養(yǎng)4天，來模擬糖尿病高糖“代謝記憶”模型。

“代謝記憶”影響糖網(wǎng)病的機(jī)制包括氧化應(yīng)激與線粒體功能障礙、非酶促糖基化作用、炎癥與凋亡因素、表觀遺傳學(xué)機(jī)制[10]。表觀遺傳是指在核苷酸序列不發(fā)生變化的情況下，基因的表達(dá)活性發(fā)生了可遺傳的改變。Reddy認(rèn)為，即使后期得到良好的血糖控制，短暫性高血糖可能介導(dǎo)與代謝記憶有關(guān)的持續(xù)性基因表達(dá)活性的激活[11]。

SIRT1是一類多功能蛋白，能通過使一系列的底物包括組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和共調(diào)節(jié)因子去乙酰化，正面或是負(fù)面調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而參與調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞代謝和衰老[12]。SIRT1在衰老性疾病和代謝性疾病的組織保護(hù)中起重要作用，主要表現(xiàn)在抗炎抗凋亡和減少血管新生方面。大多數(shù)蛋白的生物功能依賴于可逆的翻譯后修飾，SIRT1可以使與細(xì)胞能量和氧化相關(guān)的代謝分子去乙?；?，因此，SIRT1可能在代謝記憶現(xiàn)象的發(fā)生中也發(fā)揮重要的作用[13]。Tabuchi等[14]指出在內(nèi)皮祖細(xì)胞中miR-34a可能調(diào)節(jié)SIRT1的表達(dá)，研究證實阿托伐他汀通過抑制miRNA-34a上調(diào)SIRT1的表達(dá)，對冠心病中血管內(nèi)皮細(xì)胞功能有保護(hù)作用。為進(jìn)一步明確miR-34a與SIRT1之間的關(guān)系，本研究通過miR-34a mimic和miR-34a inhibitor干預(yù)代謝記憶組的RPE細(xì)胞，分別上調(diào)和下調(diào)miR-34a表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)用miR-34a mimic上調(diào)miR-34a后可明顯降低代謝記憶RPE細(xì)胞的SIRT1水平，而以miR-34a inhibitor下調(diào)miR-34a后可抑制代謝記憶對RPE細(xì)胞SIRT1水平的降低，由此從功能學(xué)上證明了miR-34a對SIRT1的靶向調(diào)控作用。

綜合本研究結(jié)果表明，持續(xù)處于高糖環(huán)境中的RPE細(xì)胞miR-34a增多，SIRT1減少，細(xì)胞凋亡增多；高糖培養(yǎng)一段時間后調(diào)整血糖水平至正常，這些指標(biāo)仍不能恢復(fù)至正常水平，RPE細(xì)胞存在高糖“代謝記憶”現(xiàn)象；過表達(dá)miR-34a進(jìn)一步下調(diào)SIRT1，并通過miR-34a/SIRT1通路，加重細(xì)胞凋亡；miR-34a inhibitor雖然不能使各項指標(biāo)恢復(fù)至正常水平，但是可以部分降低miR-34a表達(dá)，抑制SIRT1水平的下降，并通過miR-34a/SIRT1通路減少細(xì)胞凋亡。由此提示，通過下調(diào)miR-34a，改變表觀遺傳，從而部分逆轉(zhuǎn)高糖“代謝記憶”，可能是從分子水平上治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的新策略。

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Inhibition of miR-34a allviates downregulation of SIRT1 and apoptosis by high glucose metabolic memory in retinal pigment epithelial cells

Huang Yan1, Zheng Weidong2*, You Jiahui2, Xu Guoxing2
（
1Department of Ophthalmology and Optometry, Fujian Medical University;2Department of Ophthalmology, the Affiliated First Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou350004，China）

ObjectiveTo investigate the role of miR-34a in retinal pigment epithelium (RPE) cells with high glucose metabolic memory and explore new strategy for the prevention and treatment of diabetic retinopathy.MethodsRPE cells were cultured under various conditions. The high glucose metabolic memory model of diabetes mellitus was simulated through culturing cells in high glucose for 4 days followed by 4 days in normal glucose medium. The expression of miR-34a was measured by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). The level of histone deacetylase Sirtuin 1 (SIRT1) was evaluated using immunocytochemistry and Western blot.Apoptotic cells were detected by flow cytometry using Annexin V/Propidium iodide double staining.ResultsqRT-PCR showed that miR-34a expression in RPE cells was significantly increased in high glucose and metabolic memory groups. Its expression in RPE cells with metabolic memory could be further modulated, e.g. up-regulated by MiR-34a mimic or down-regulated by inhibitor. Immunocytochemistry staining showed that STRT1 expression in RPE cells was significantly decreased in high glucose culture and metabolic memory groups. Overexpressing miR-34a further down-regulated STRT1 in metabolic memory RPE cells, while miR-34a inhibitor partially abolished the inhibitory effects mediated by metabolic memory. Flow cytometry showed that apoptotic RPE cells significantly increased in high-glucose culture and metabolic memory groups, which could be further increased by miR-34a overexpression but reduced by miR-34a inhibitor in RPE cells with metabolic memory.ConclusionMiR-34a inhibitor can partially reverse high glucose metabolic memory effect in RPE cells and prevent diabetic retinopathy likely through reducing SIRT1 expression and apoptosis.

High glucose; metabolic memory; retinal pigment epithelium cell; miR-34a; sirtuin 1

R774.1

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 006

2017-05-04

2017-10-07

福建省自然科學(xué)基金（2016J01155），福建醫(yī)科大學(xué)教授基金（JS14013）

黃焱，女（1971年），漢族，教授

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：WDzheng1996@163.com