梁少華，于振海，紀(jì)丕友

（濱州醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，煙臺(tái) 264003）

聯(lián)合應(yīng)用PI-103和AG1478抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡

梁少華，于振海，紀(jì)丕友*

（濱州醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，煙臺(tái) 264003）

目的觀察聯(lián)合應(yīng)用PI-103和AG1478對神經(jīng)母細(xì)胞瘤 SH-SY5Y 細(xì)胞的作用。方法以mTOR拮抗劑PI-103、EGFR拮抗劑AG1478分別單獨(dú)和聯(lián)合處理SH-SY5Y 細(xì)胞后，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法測定不同濃度梯度的PI-103和AG1478對SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響并計(jì)算相應(yīng)的半數(shù)抑制濃度(IC50)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，Hoechst-33528染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變，Western blot檢測PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的水平變化。結(jié)果PI-103和AG1478均能抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖且半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為3.2μmol/L，215.5μmol/L。IC50濃度作用24h后，Hoechst-33528 染色和流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，聯(lián)合用藥的細(xì)胞凋亡率遠(yuǎn)高于單一用藥。Western blot檢測單獨(dú)用藥后磷酸化蛋白激酶B (p-Akt)和磷酸化核糖體蛋白S6激酶（p-p70s6k）表達(dá)水平降低，且聯(lián)合用藥后p-Akt和p-p70s6k的水平降低更明顯。結(jié)論P(yáng)I-103和AG1478聯(lián)合用藥能提高腫瘤細(xì)胞死亡率，其抗腫瘤效果有協(xié)同效應(yīng)。

神經(jīng)母細(xì)胞瘤；PI-103；AG1478；聯(lián)合用藥

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma, NB）是威脅兒童生命的常見腫瘤，其因發(fā)病率高、惡性程度高、耐藥性高、預(yù)后極差等特點(diǎn)而備受關(guān)注[1,2]。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)[3,4]，在NB侵襲轉(zhuǎn)移過程起著核心調(diào)控作用[5]。mTOR是PI3K/Akt信號(hào)通路重要的下游分子，在腫瘤的生長、腫瘤細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要的作用，被認(rèn)為是腫瘤治療的關(guān)鍵性靶點(diǎn)。有研究表明，單一給予mTOR抑制劑的抗腫瘤效果欠佳且耐藥出現(xiàn)的機(jī)率增高，因此聯(lián)合應(yīng)用其他藥物治療已成為目前腫瘤治療的新思路。EGFR激活后亦可作用于PI3K/Akt信號(hào)通路參與大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[6]，亦被作為腫瘤靶向治療的理想靶點(diǎn)。我們推測多重干預(yù)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可能帶來更明顯的抗腫瘤作用。因此，本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用mTOR拮抗劑PI-103和EGFR拮抗劑AG1478觀察對SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的療效，為尋求更有效的治療方法提供依據(jù)。

材料和方法

1 材料

SH-SY5Y細(xì)胞株；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Sigma公司）；PI-103 （Selleck公司）；DMEM/F12高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司）；AG1478 （Selleck公司）；胎牛血清（FBI）； AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒（碧云天）；Hoechst 33528染色液（武漢百浩天生物科技有限公司）；全蛋白與磷酸化蛋白提取試劑Ripa（碧云天）及BCA 蛋白濃度測定試劑盒 (Thermo公司)；第一抗體為抗蛋白激酶B (Akt)、 磷酸化蛋白激酶B (p-Akt)、核糖體蛋白S6激酶（p70s6k）及磷酸化核糖體蛋白S6激酶（p-p70s6k）兔抗人抗體(美國 CST 公司)；第二抗體為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG (Jakson公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Millipore公司），其余試劑和儀器耗材由本教研室實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

NB細(xì)胞株SH-SY5Y細(xì)胞在含10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。待SH-SY5Y細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，用0.25% Trypsin+0.1% EDTA消化、傳代。

3 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)共分PI-103組、AG1478組及PI-103+AG1478聯(lián)合用藥組，并設(shè)空白對照組。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)計(jì)算的PI-103 和AG1478 的IC50濃度，PI-103組和AG1478組分別給予IC50 劑量，PI-103+AG1478聯(lián)合用藥組中的PI-103 和AG1478濃度為各自IC50的1/2。

4 MTT實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞生長曲線

待SH-SY5Y細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期后，用0.25%Trypsin+0.1% EDTA消化，加DMEM/F12高糖培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）終止消化，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/ml，再按照200μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24h后，吸掉舊的培養(yǎng)液，再加入200μl含不同濃度PI-103（10、5、2.5、1.25、0.625μmol/L） 和 AG1478（600、300、150、75、37.5μmol/L），并設(shè)全培養(yǎng)基空白對照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔加入20μl MTT，培養(yǎng)4h，然后吸棄上清液，每孔加入150μl DMSO，恒溫氣浴振蕩器震蕩10min，再用酶標(biāo)儀于490nm波長處測吸光度（OD）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以PI-103和AG1478的不同濃度梯度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線觀察細(xì)胞生長的抑制情況，進(jìn)而計(jì)算相應(yīng)的半數(shù)抑制濃度(IC50)。PI-103和AG1478的各濃度梯度增殖抑制率（%）=（1-單一或聯(lián)合給藥組OD值/空白對照組OD值）×100%。

5 Hoechst-33528染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)

待SH-SY5Y細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，按細(xì)胞數(shù)6×105個(gè)/孔，接種于6孔板中培養(yǎng)。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果，選取PI-103和AG1478 的IC50作為檢測劑量。按分組要求加入含不同濃度藥物的新培養(yǎng)液2ml，藥物處理24h。加入固定液固定10min，PBS洗3次，加入500μl Hoechst-33528染色10min，在熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

待SH-SY5Y細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，細(xì)胞懸液按細(xì)胞數(shù)6×105個(gè)/孔，接種于6孔板中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度生達(dá)80%左右時(shí)，分別給予含有相應(yīng)劑量的PI-103、AG1478以及PI-103 + AG1478的混合液的新培養(yǎng)基2ml，處理24h。然后收集細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

AnnexinV-FITC雙標(biāo)記法操作步驟如下：收集細(xì)胞上清液，0.25% 胰酶消化細(xì)胞；1500r/min離心5min；PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000r/min離心5min；加入500μl的Binding buffer懸浮細(xì)胞；加入5μl AnnexinV-FITC混勻后，加入5μl Propidium Iodide（PI），混勻；室溫、避光、反應(yīng)15min；于1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

7 Western blot檢測相關(guān)蛋白

將對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，接種細(xì)胞數(shù)為6×105個(gè)/孔，每孔2ml細(xì)胞懸液。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)80% 匯合度左右時(shí)，按分組要求加入含相應(yīng)濃度藥物的新培養(yǎng)基2ml，處理24h。4℃預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗細(xì)胞3次，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30min并收集PI-103組、AG1478組及PI-103 +AG1478聯(lián)合用藥組細(xì)胞裂解蛋白，采用BCA法檢測樣品中總蛋白的濃度。10% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白后，80v、120min 電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% 脫脂奶封閉 1h～2h；按 1∶1000 的稀釋比例加一抗Akt、p-Akt、p70s6k及p-p70s6k的兔抗人抗體，4℃過夜；TBST洗膜3次；加1∶5000 稀釋的二抗孵育1h，TBST 洗膜3次；ECL化學(xué)發(fā)光，以β-actin蛋白作為內(nèi)參。

結(jié) 果

1 PI-103與AG1478抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖

MTT實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生長曲線（圖1）顯示不同濃度的PI-103（圖1A）單獨(dú)處理SH-SY5Y細(xì)胞24h后，隨著藥物濃度升高，吸光度值逐漸變小，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）為3.2μmol/L；不同濃度的AG1478（圖1B）單獨(dú)處理SH-SY5Y細(xì)胞作用24h后，隨著藥物濃度增加，對細(xì)胞增殖的抑制作用亦越明顯，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）為215.5μmol/L。由此可見，PI-103 和AG1478均能抑制SH-SY5Y細(xì)胞的增殖。

圖1 不同濃度PI-103和AG1478作用于SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞生長曲線Fig. 1 The cell growth curves of SH-SY5Y cells treated with increasing concentrations of PI-103 or AG1478

2 PI-103與AG1478聯(lián)合用藥具有更強(qiáng)的促SHSY5Y細(xì)胞凋亡作用

Hoechst-33528染色后倒置熒光顯微鏡觀察到正常SH-SY5Y活細(xì)胞核呈圓形或橢圓形的彌散、均勻藍(lán)色熒光（圖2A）；PI-103與AG1478均能誘導(dǎo)SHSY5Y細(xì)胞發(fā)生凋亡，表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮，形態(tài)不規(guī)則，呈熒光高亮濃染，以及強(qiáng)熒光碎塊，聚集或散在分布（圖2B，圖2C）；在PI-103與AG1478聯(lián)合處理的SH-SY5Y中，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于PI-103或AG1478單獨(dú)處理的細(xì)胞（圖2D）。

圖2 Hoechst-33528染色顯示SH-SY5Y細(xì)胞凋亡形態(tài)。A，DMSO對照組；B，PI-103單獨(dú)用藥組；C，AG1478單獨(dú)用藥組；D，PI-103與AG1478聯(lián)合用藥組；白色箭頭示凋亡細(xì)胞中濃染或碎裂的細(xì)胞核；比例尺，200μmFig. 2 Hoechst-33528 staining showed apoptotic nuclear morphology of SH-SY5Y cells. A, DMSO control group; B, PI-103 group; C, AG1478 group;D, PI-103+AG1478 combination group; white arrows indicate the condensed or fragmented nuclei of the apoptotic cells; scale bar; 200μm

進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，PI-103與AG1478在IC50濃度下均能誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生凋亡，其凋亡發(fā)生率分別為14.23%±1.22%、13.38%±1.42%；PI-103與AG1478聯(lián)合用藥時(shí)，SHSY5Y細(xì)胞的凋亡發(fā)生率為36.52%±4.70%，較PI-103和AG1478單獨(dú)用藥的凋亡率顯著增高（圖3）。

圖3 PI-103和AG1478誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測分析。 A，細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測；B，細(xì)胞凋亡率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，0.01＜ P＜ 0.05； **，P＜ 0.01；n=4Fig. 3 Flow cytometry detection and analysis of SH-SY5Y cell apoptosis induced by PI-103 and AG1478. A, representative flow cytometry results for apoptosis analysis; B, statistical analysis of apoptotic rates; *, 0.01＜P＜ 0.05; **, P＜ 0.01; n=4

3 PI-103與AG1478聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥更明顯地降低p-Akt和p-p70s6k水平

Western blot檢測顯示，Akt和p70s6k的磷酸化水平在PI-103組分別為對照組的32.58%和18.63%，在AG1478組分別為對照組的37.05%和18.56%，而在PI-103與AG1478聯(lián)合用藥組分別為對照組的11.81%和7.96%（圖4）。由此提示，PI-103與AG1478均能通過影響PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中Akt和p70s6k的磷酸化水平，進(jìn)而可能參與調(diào)控SHSY5Y細(xì)胞凋亡。PI-103與AG1478聯(lián)合用藥則對Akt和p70s6k具有更強(qiáng)的活化作用。

圖4 PI-103和AG1478 對p-Akt 和p-p70s6k水平的影響。A，p-Akt 和p-p70s6k水平的代表性Western blot檢測；B，p-Akt 和p-p70s6k水平Western blot檢測結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，0.01＜ P＜ 0.05；**，P＜ 0.01；n=4Fig. 4 Effects of PI-103 and AG1478 on the levels of p-Akt and p-p70s6k. A, representative Western blot detection for p-Akt and p-p70s6k levels; B,statistical analysis for p-Akt and p-p70s6k levels detected by Western blot; *, 0.01＜P＜ 0.05; **, P＜ 0.01; n=4

討 論

NB是多見于兒童期，惡性程度高、預(yù)后差的源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的顱外實(shí)體瘤[7]。盡管近年來多模式聯(lián)合治療對NB的治愈有所改善，但效果仍不理想。鑒于腫瘤細(xì)胞死亡需要啟動(dòng)多種凋亡途徑，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被證實(shí)與NB細(xì)胞活性增加及對化療的抵抗耐藥性增強(qiáng)密切相關(guān)[8,9]。因此，通過適當(dāng)?shù)囊种苿└深A(yù)該信號(hào)通路可能是有前途的治療策略[10]。mTOR作為PI3K/Akt信號(hào)通路的下游分子，匯聚并整合上游的信息，參與細(xì)胞生長、增殖、蛋白質(zhì)合成、自噬和代謝等活動(dòng)，已成為癌癥靶向治療的重要節(jié)點(diǎn)。各種mTOR抑制劑已用于抗癌試驗(yàn)。然而，在許多臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)mTOR抑制劑單一用藥效果很有限，這可能是由于mTOR被抑制后反饋激活PI3K/Akt信號(hào)，致使Akt活性增強(qiáng)[11,12]，亦可能導(dǎo)致PI3K依賴的MAPK信號(hào)激活，提供另一個(gè)反饋回路有關(guān)[13]。因此多靶點(diǎn)聯(lián)合用藥抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是目前抗癌治療的主要策略之一。

PI-103屬于脂質(zhì)激酶家族中的小分子mTOR抑制劑，不但能抑制mTOR同時(shí)也能抑制PI3K[14]，被看作具有潛力的抗腫瘤候選藥物。研究報(bào)道PI-103對多種腫瘤包括NB有抑制作用[15]，這一抑制作用主要是在將PI-103作為一個(gè)靶向聯(lián)合治療藥物與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用的基礎(chǔ)上獲得的。EGFR激活亦可啟動(dòng)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，即EGFR/PI3K/Akt信號(hào)通路[6]。目前聯(lián)合應(yīng)用mTOR抑制劑與EGFR拮抗劑已用于臨床探討其抗腫瘤轉(zhuǎn)移和血管增殖的作用[13]。AG1478作為一種新的EGFR小分子抑制劑，可作用于包括NB多種腫瘤[16]，但單獨(dú)用藥對一些腫瘤效果不佳且亦產(chǎn)生耐藥性[17]。

本實(shí)驗(yàn)單獨(dú)使用PI-103或AG1478觀察到兩者均能抑制SH-SY5Y細(xì)胞生長，且這種抑制作用呈劑量依賴性。PI-103或AG1478均可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中的下游分子Akt和p70s6k蛋白的磷酸化，進(jìn)一步促進(jìn)SH-SY5Y腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤的中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。流式細(xì)胞術(shù)和Western blot結(jié)果顯示聯(lián)合用藥的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)用藥，因此PI-103與AG1478聯(lián)合應(yīng)用從EGFR、PI3K和mTOR等關(guān)鍵性分子多角度、多靶點(diǎn)抑制SH-SY5Y腫瘤細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，其產(chǎn)生的抗腫瘤效果更佳。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合PI-103與AG1478用藥研究為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療積累了資料，由于PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的復(fù)雜性，聯(lián)合用藥治療技術(shù)尚不夠成熟，其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步深入分析。

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Inhibition of proliferation and promotion apoptosis in SH-SY5Y neuroblastoma cells by treatment with combination of PI-103 and AG1478

Liang Shaohua, Yu Zhenhai, Ji Piyou*
(Department of Human Anatomy, Binzhou Medical College, Yantai 264003, China)

ObjectiveTo investigate the effects of combined application of PI-103 and AG1478 on SH-SY5Y neuroblastoma cells.MethodsSH-SY5Y cells were treated with mTOR inhibitor PI-103 and EGFR inhibitor AG1478 separately or in combination.Cell proliferation rate was measured by MTT assay and the half maximal inhibitory concentrations (IC50) was calculated. Annexin V-FITC was used in conjunction with propidium iodide to detect apoptotic cells with flow cytometry and Hoechst-33528 staining was used to evaluate morphology of nuclei. The changes on the levels of PI3K/Akt signaling pathway related proteins were determined by western blot.ResultsBoth PI-103 and AG1478 inhibited SH-SY5Y neuroblastoma proliferation with an IC50 of 3.2 μmol/L and 215.5 μmol/L respectively. The apoptotic rates of SH-SY5Y cells were 14.23%±1.22% and 13.38%±1.42% in response to PI-103 and AG1478 exposure separately at their IC50s after 24 hours. The combined treatment of PI-103 with AG1478 significantly increased the apoptotic rate to 36.52%±4.70%. Meanwhile, the levels of phosphorylated protein kinase B (p-Akt) and phosphorylated ribosomal protein S6 kinase (p-p70s6k) were decreased by the combination of PI-103 and AG1478 more significantly than individual treatments.ConclusionThe combination of PI-103 and AG1478 treatment increased SH-SY5Y tumor cell death through synergistic anti-tumor effects.

Neuroblastoma; PI-103; AG1478; drug combination

G642.41

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 005

2017-05-14

2017-10-08

濱州醫(yī)學(xué)院科技計(jì)劃（BY2013KJ56）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2014HM009）

梁少華，女（1983年），漢族、講師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：jpy821101@163.com