徐明鋒，周慧，李璐，胡利，陳東*

（廣東醫(yī)科大學(xué)1生理學(xué)教研室，2附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，3組織與胚胎學(xué)教研室 湛江 524000）

論著

大鼠脊髓內(nèi)EGFR表達(dá)與PI3K/AKt/mTOR活性的發(fā)育相關(guān)變化

徐明鋒1，周慧2，李璐3，胡利3，陳東3*

（廣東醫(yī)科大學(xué)1生理學(xué)教研室，2附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，3組織與胚胎學(xué)教研室 湛江 524000）

目的研究脊髓組織神經(jīng)元的內(nèi)在生長活性發(fā)育依賴性丟失的可能機(jī)制。方法利用免疫熒光染色、Western blot和PCR等方法檢測神經(jīng)系統(tǒng)不同發(fā)育時(shí)期（胚胎期、新生期和成熟期）脊髓組織中EGFR的表達(dá)以及PI3K/Akt/mTOR活化狀態(tài)，并分析相互之間的關(guān)系。結(jié)果在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟過程中，EGFR的表達(dá)水平在出生前達(dá)到高峰，出生后逐漸降低，成熟期后始終維持在一個(gè)較低的水平；PI3K/AKt信號通路活性增強(qiáng)的同時(shí)EGFR表達(dá)的上調(diào)及mTOR表達(dá)增加。出生后隨著EGFR表達(dá)的下調(diào)，PI3K/AKt通路活性以及mTOR的表達(dá)也隨之減弱。結(jié)論脊髓組織中PI3K/AKt信號通路的活性與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟有關(guān)，EGFR下調(diào)導(dǎo)致PI3K/AKt/mTOR的活性降低可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)在生長活性發(fā)育依賴性丟失的原因之一。

PI3K/Akt信號通路； 神經(jīng)發(fā)育；表皮生長因子受體

目前對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)在生長活性發(fā)育依賴性丟失的機(jī)制所知甚少。已知發(fā)育期神經(jīng)元的生長屬于生長因子依賴性生長，其中生長因子激活的PI3K/Akt信號通路與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)，通路中的作用底物哺乳動(dòng)物雷帕霉素作用靶點(diǎn)蛋白mTOR（mammalian target of rapamycin）目前被認(rèn)為是決定中樞神經(jīng)元內(nèi)在生長活性的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控物[3,6]。表皮生長因子受體（EGFR）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)廣泛，其與配體結(jié)合后，可激活PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)細(xì)胞的分裂、生長。在多巴胺能神經(jīng)元和視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上，EGF激動(dòng)劑可直接促進(jìn)神經(jīng)元突起的發(fā)生，提示EGFR有調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)生和生長的作用[7,8]?；谏鲜稣J(rèn)識，我們推測神經(jīng)元內(nèi)在生長活性發(fā)育依賴性丟失可能與中樞神經(jīng)發(fā)育進(jìn)程中EGFR的下調(diào)及通過PI3K/Akt信號通路導(dǎo)致mTOR的活性降低，從而使成熟后神經(jīng)元的生長活性處于一個(gè)極低水平有關(guān)。因此，本研究擬對胚胎期、新生期和成熟期等不同發(fā)育階段的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脊髓組織中EGFR與PI3K/Akt/mTOR進(jìn)行檢測，試圖分析發(fā)育進(jìn)程中決定中樞神經(jīng)元內(nèi)在生長活性的mTOR與上述信號通路的關(guān)系。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

胚胎期、新生期、成熟期SD大鼠由廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，每個(gè)時(shí)期的動(dòng)物數(shù)量為15只。每個(gè)階段挑取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為檢測點(diǎn)。胚胎期（embryo）3個(gè)時(shí)間點(diǎn)為孕15天（E15）、孕17天（E17）、孕19天（E19）；新生期（newly born）3個(gè)時(shí)間點(diǎn)為出生后第1天（N1）、出生后3天（N3）、出生后1周（N7）；成熟期（adult）3個(gè)時(shí)間點(diǎn)為1月齡（A1）、2月齡（A2）、3月齡（A3）。

2 大鼠脊髓組織取材及冰凍切片制備

2.1 成熟期

別選取1月齡、2月齡和3月齡3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SD大鼠，麻醉后經(jīng)4%多聚甲醛進(jìn)行全身灌注固定，取T9-T11段脊柱，4%多聚甲醛固定過夜。第2天剔除脊柱上的骨骼和肌肉，剝離出脊髓組織，最后截取長度為1.5cm的脊髓組織。

2.2 新生期

分別選取出生后第1天、第3天和第7天的SD新生鼠，置于冰塊上，經(jīng)4%多聚甲醛進(jìn)行全身灌注固定，剪取一段脊柱4%多聚甲醛固定2h后，在體視顯微鏡下用眼科剪和眼科鑷剝離出脊柱中的脊髓組織。上述兩種脊髓組織在包埋前采用10%蔗糖、20%蔗糖、30%蔗糖梯度脫水。脫水完成后再進(jìn)行OCT包埋。

2.3 胚胎期

分別麻醉孕15天、孕17天和孕19天的SD孕鼠，麻醉下取出子宮，剪開子宮取出胚胎，然后在體視顯微鏡下用眼科剪取胎鼠的一段脊柱組織，取中間一段長度為1.5cm的脊柱，此時(shí)并不剔除脊柱上的骨骼和肌肉組織，用該段脊柱代替研究所需的脊髓組織直接進(jìn)行OCT包埋。

3 免疫熒光染色

上述脊髓組織在恒冷箱內(nèi)連續(xù)切片，切片厚度12μm。染色前，胚胎期脊髓組織還需4℃丙酮固定10min后，方可進(jìn)入染色程序。已固定的組織可直接進(jìn)入染色程序，染色前PBS洗3次，2min/次。常規(guī)處理后，用血清封閉，之后即可滴加小鼠抗EGFR一抗（1∶200; Cell Signaling）4℃孵育過夜，次日滴加TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，室溫避光孵育2h后熒光顯微鏡觀察。對照染色均用PBS代替一抗。

關(guān)鍵詞是論文的核心是作者對文章主題進(jìn)行精煉之后得到的結(jié)果，有著很強(qiáng)的代表性[3]。研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，通?？梢杂妙l次高的關(guān)鍵詞來確定并且中心性超過0.1的關(guān)鍵詞，則被認(rèn)為具有較強(qiáng)的影響力，通過該點(diǎn)展開的研究較多[4]。由于不同的人對同一內(nèi)容有不同的理解方式，導(dǎo)致命名的關(guān)鍵詞不一致[5]。因此，本研究將含義相同、相近或存在包含與被包含關(guān)系的關(guān)鍵詞進(jìn)行合并最后重新運(yùn)行軟件，得到圖2。高中心性關(guān)鍵詞(＞=0.1)有大鼠、腫瘤、護(hù)理、糖尿病、教育、教學(xué)、慢性肝病、帕金森病、凋亡、治療、糖尿病、腎病、小鼠十二個(gè)高中心度詞。

4 Western-blot分析

首先提取脊髓組織蛋白，并用BCA蛋白濃度測定法對提取的脊髓組織進(jìn)行蛋白濃度的測定。取蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后然后，利用Western-blot檢測EGFR、mTOR、磷酸化Akt和磷酸化mTOR表達(dá)。一抗：兔抗EGFR（1∶500；Cell Signaling Technology），兔抗 mTOR （1∶200；Abcam），兔抗p-AktS473（1∶200；eBioscience）和兔抗 p-mTORS2448(1∶300；Cell Signaling)。二抗：HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG (1∶1000；Santa Cruz) 。采用HRPECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色（參照BeyoECL顯色試劑盒說明書，碧云天P0018A），利用Tanon3500凝膠圖像分析系統(tǒng)對電泳結(jié)果進(jìn)行拍照，最后用軟件Bandscan 5.0 分析電泳圖片，計(jì)算目的蛋白和內(nèi)參β-actin的比值作為目標(biāo)蛋白的相對含量值進(jìn)行比較分析。

5 RT-PCR檢測

目的基因引物由上海生工公司合成，引物序列如下：EGFR（ P15- TCGGTGCTGTGCGATTTA-3, P25-TGGTGGGCAGGTGTGAT-3，產(chǎn)物大小365bp）；mTOR（P15-CGGGATACTCACGATGGA-3，P25-AACTCCCA AGAGCACCTGTC-3 ，產(chǎn)物大小426bp）；內(nèi)參GAPDH 140bp。引物離心后用0.2%DEPC處理水稀釋至所需濃度，-20℃保存。按照一步法RT-PCR試劑盒要求進(jìn)行目的基因的檢測，基本過程如下：首先將RNA模板、引物、試劑盒內(nèi)的物品置于冰上。依次將各反應(yīng)成分加入PCR管中（反應(yīng)體系25μl，成分如下：RNase-free water 13μl ；5×Buffer 5μl；dNTP Mix 1μl；Primer各 2μl；Enzyme Mix 1μl；Template RNA 1μl）。最后將PCR管放入已經(jīng)預(yù)熱的PCR熱循環(huán)儀中，按以下程序進(jìn)行RT-PCR： reverse transcription 50℃，30min；initial PCR activation step 95℃，15min；3-step cycling： denaturation 94℃，60s、annealing 52℃，45s、extension 72℃，60s； 30 cycles； final extension 72℃，10min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上可觀察電泳帶及其位置，并用相機(jī)拍照記錄電泳結(jié)果。利用軟件Bandscan 5.0分析電泳圖片。 計(jì)算目的基因 和內(nèi)參GAPDH的比值作為目的基因的相對含量值進(jìn)行比較分析。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 不同發(fā)育階段脊髓組織中EGFR的表達(dá)

EGFR蛋白在胚胎期表達(dá)要高于新生期和成熟期，并且在胚胎期呈現(xiàn)發(fā)育相關(guān)性增強(qiáng)，在出生前E19這一天表達(dá)到達(dá)最高峰。在新生期EGFR的表達(dá)逐漸開始下降，至成熟期時(shí)EGFR的表達(dá)為3個(gè)時(shí)期中最低，但是始終維持在一個(gè)相對穩(wěn)定的水平（圖1），與胚胎期表達(dá)的最高峰E19相比，出生后第3天開始各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上EGFR的表達(dá)均低于E19。在基因水平上EGFR mRNA的表達(dá)與EGFR蛋白具有相似的規(guī)律，出生后第1天開始，EGFR基因的mRNA表達(dá)水平就開始顯著下調(diào)，出生以后各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平均低于E19（圖2）。免疫熒光染色顯示，3個(gè)發(fā)育階段的脊髓組織均有EGFR的表達(dá)，但是成熟期的表達(dá)明顯低于胚胎期和新生期（圖3）。

2 不同發(fā)育階段脊髓組織中mTOR的表達(dá)

Western blot檢測顯示，mTOR水平在胚胎期最高，而隨著中樞神經(jīng)的發(fā)育，在新生期開始下降，成熟期后表達(dá)水平極低，幾乎檢測不到（圖4）；不同發(fā)育階段mTOR的mRNA的表達(dá)也發(fā)現(xiàn)相同的規(guī)律（圖5）。由此可見，mTOR的表達(dá)與中樞神經(jīng)發(fā)育進(jìn)程有直接聯(lián)系，其表達(dá)呈發(fā)育依賴性下調(diào)的趨勢，與之對應(yīng)的是脊髓組織神經(jīng)元內(nèi)源性生長活性也呈現(xiàn)出發(fā)育依賴性下調(diào)。

3 不同發(fā)育階段脊髓組織中PI3K/Akt信號通路活性變化

圖1 不同發(fā)育階段大鼠脊髓內(nèi)EGFR水平的變化。A, 代表性Western blot結(jié)果；B，EGFR相對含量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*：與E19比較，P＜0.05Fig. 1 EGFR level changes in rat spinal cords of different development stages. A, representative Western blot results at indicated time; B, statistical analysis for the relative amount of EGFR; *∶ P＜0.05, compared with E19

應(yīng)用Western blot對胚胎期孕19天（E19）、新生期出生后第7天（N7）以及成熟期3個(gè)月齡（A3）脊髓組織p-AktS473和p-mTORS2448兩種磷酸化蛋白水平檢測顯示，p-AktS473在胚胎期和新生期的表達(dá)量明顯高于成熟期，即PI3K/Akt的信號通路在出生前活性很高，出生后則低于出生前的水平，但仍然維持相對穩(wěn)定的表達(dá)狀態(tài)；p-mTORS2448的表達(dá)規(guī)律為在胚胎期表達(dá)較高，而在新生期和成熟期則開始下降，尤其是在成熟期p-mTORS2448活性極低，與中樞神經(jīng)元內(nèi)在生長活性發(fā)育依賴性丟失的規(guī)律十分相似（圖6）。由此提示，PI3K/AKt信號通路對中樞神經(jīng)發(fā)育有影響，并且該影響應(yīng)該與影響mTOR的活化進(jìn)而改變了中樞神經(jīng)元內(nèi)在生長活性有關(guān)。

圖2 不同發(fā)育階段大鼠脊髓內(nèi)EGFR mRNA的變化。A，代表性RT-PCR結(jié)果；B，EGFR mRNA相對含量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*：與E19比較，P＜0.05；#：與 N7比較，P＜0.05Fig. 2 EGFR mRNA level change in rat spinal cords of different development stages. A, representative RT-PCR results at indicated time; B, statistical analysis for the relative amount of EGFR mRNA; *∶ P＜0.05, compared with E19；#：P＜0.05 , compared with N7

圖3 不同發(fā)育階段大鼠脊髓EGFR免疫反應(yīng)性的變化。A，胚胎期；B，新生期；C，成熟期；A'、B'和C'分別為A、B和C中方框的放大圖象； △，EGFR免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元；比例尺：A、B和C，100μm；A'、B'和C'，50μmFig. 3 EGFR expression changes determined by immunostaining in rat spinal cords of different developmental stages. A, embryonic stage; B, newborn stage; C, adult stage; A’, B’ and C’, enlarged images of the squares in A, B, and C; △, EGFR positive neurons; scale bar, 100μm in A, B and C; 50μm in A’, B’ and C’

討 論

表皮生長因子受體（EGFR）是一種具有配體介導(dǎo)酪氨酸激酶活性的多功能跨膜糖蛋白。EGF主要通過與EFGR高親和力結(jié)合發(fā)揮作用，磷酸化的EGFR引發(fā)級聯(lián)放大反應(yīng)，激活下游一系列信號通路，主要包括轉(zhuǎn)錄因子激活有關(guān)的JAK/STAT 、絲裂原活化有關(guān)的Ras /MAPK和磷脂酰肌醇有關(guān)的PI3K/Akt等，通過這些信號通路直接參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在細(xì)胞生長、增殖、分化等方面發(fā)揮重要作用[7,8]。

圖4 不同發(fā)育階段大鼠脊髓組織mTOR蛋白的表達(dá)。A，代表性Western blot結(jié)果；B，mTOR相對含量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*：與E19比較，P＜0.05；#：與 N3比較，P＜0.05Fig. 4 mTOR level changes in rat spinal cords of different developmental stages. A, representative Western blot results at indicated time; B, statistical analysis for the relative amount of mTOR; *∶ P＜0.05, compared with E19; #∶ P＜0.05, compared with N3

圖5 不同發(fā)育階段大鼠脊髓組織mTOR mRNA的表達(dá)。A，代表性RT-PCR結(jié)果；B，mTOR mRNA相對含量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*：與E19比較，P＜0.05Fig. 5 mTOR mRNA level change in rat spinal cords of different developmental stages. A, Representative RT-PCR results at indicated time; B, Statistical analysis for the relative amount of mTOR mRNA; *∶ P＜0.05, compared with E19

圖6 不同發(fā)育階段大鼠脊髓內(nèi)PI3K/Akt信號通路活性變化。A，代表性Western blot結(jié)果；B，p-AktS473 和p-mTORS2448相對含量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*：與E19比較，P＜0.05Fig. 6 PI3K/Akt signal pathway activity changes in rat spinal cords of different developmental stages. A, representative Western blot results at indicated time. B, statistical analysis for the relative amount of p-Akt and p-mTOR; *∶ P＜0.05, compared with E19

我們的研究結(jié)果顯示在脊髓組織中EGFR的表達(dá)會(huì)隨著大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟而逐漸下調(diào)，表現(xiàn)出明顯的發(fā)育依賴性，說明EGFR的表達(dá)確實(shí)和中樞神經(jīng)的發(fā)育成熟有關(guān)。已知當(dāng)配體和EGFR結(jié)合后可激活許多下游效應(yīng)，如分裂、分化、生長、存活有關(guān)的信號通路，包括PKC、Ras、PI3K、MAPK等。說明EGFR對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的這種促發(fā)育、促生長作用應(yīng)該與上述信號通路的激活有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)PI3K/Akt信號通路的活性隨著發(fā)育的進(jìn)程再逐漸的降低，提示在中樞發(fā)育進(jìn)程中，EGFR的表達(dá)與PI3K/Akt信號通路之間存在某種聯(lián)系。

當(dāng)EGFR表達(dá)上調(diào)并被激活形成pEGFR時(shí)，pEGFR可以導(dǎo)致mTOR的激活。mTOR作為PI3K/Akt信號通路的直接作用底物，是一個(gè)具有整合與細(xì)胞營養(yǎng)、能量、氧化等有關(guān)信息，控制細(xì)胞的生長，促進(jìn)蛋白合成的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)[9]，它的活性增高可以明顯促進(jìn)神經(jīng)元的生長，而它的活性降低則無論周圍環(huán)境中是否存在神經(jīng)營養(yǎng)因子，神經(jīng)元的生長都會(huì)出現(xiàn)障礙[3,10]。我們對EGFR的表達(dá)與信號通路PI3K/Akt的關(guān)系觀察發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育階段的脊髓組織EGFR表達(dá)水平不同，與此同時(shí)，PI3K/AKt信號通路的活化狀態(tài)也隨之發(fā)生改變，在出生前中樞脊髓組織EGFR表達(dá)處于較高水平時(shí)，p-Akt表達(dá)也較高，說明該通路的活性也較高。出生后EGFR表達(dá)下調(diào)時(shí)，通路的活性也隨之降低，表明PI3K/Akt信號通路的活化與CNS的發(fā)育以及EGFR的表達(dá)之間具有正相關(guān)性。另外，作為Akt下游的作用底物mTOR的活性的改變也與Akt保持一致，說明EGFR介導(dǎo)的PI3K/AKt信號通路對神經(jīng)發(fā)育進(jìn)程的調(diào)控很可能是通過影響mTOR的活性來實(shí)現(xiàn)的[11-15]。

由此可見，脊髓組織中EGFR的表達(dá)確實(shí)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟有關(guān)，通過PI3K/AKt信號通路影響mTOR的表達(dá)可能是EGFR介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)在生長活性的途徑之一。

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Development-related changes of EGFR expression and PI3K/AKT/mTOR pathway activities in the rat spinal cords

Xu Mingfeng1, Zhou Hui2, Li Lu3, Hu Li3, Chen Dong3*（1Department of physiology, Guangdong Medical University,2Department of otolaryngology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,3Department of Histology and Embryology, Guangdong Medical University, Zhanjiang, Guangdong, 524000）

ObjectiveTo explore the correlation between EGFR expression and PI3K/Akt/mTOR pathway activities in rat spinal cords of different developmental stages.MethodsEvaluated EGFR expression and PI3K/Akt/mTOR activities by immunofluorescence, western blot and PCR in embryo, newborn, and adult rat spinal cord tissues.ResultsDuring the development of nervous system,the EGFR expression level reached its peak before birth, declined gradually afterwards and maintained at a low level upon maturation.Both PI3K/Akt activities and mTOR expression increased prior to birth. The pathway activities reduced in parallel to EGFR changes after birth.ConclusionThe activities of PI3K/AKT signaling pathway in spinal cord tissues likely correlated with the maturity of central nervous system. Decreased PI3K/AKT/mTOR pathway activities, which possibly resulted from the downregulation of EGFR,may be one of reasons for the loss of intrinsic growth-dependent development in central neurons system.

PI3K/Akt pathway; neural development; EGFR

R573

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 001

2017-05-02

2017-09-18

廣東醫(yī)學(xué)院博士人員科研啟動(dòng)項(xiàng)目(2XB14018)

徐明鋒，男（1978年），博士，講師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：849061851@qq.com