張騰國(guó) 羅丹瑜 郭艷峰 鄭 晟 王 娟

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

油菜RbohB基因的克隆及逆境響應(yīng)表達(dá)分析

張騰國(guó) 羅丹瑜 郭艷峰 鄭 晟 王 娟

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

利用RACE技術(shù)從‘隴油6號(hào)’油菜中克隆得到一個(gè)新的RbohB基因，全長(zhǎng)2 694 bp，開(kāi)放閱讀框2 541 bp，編碼846個(gè)氨基酸。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明RbohB基因表達(dá)受低溫、高鹽、H2O2誘導(dǎo)，MAPKK抑制劑U0126預(yù)處理12 h再經(jīng)低溫、高鹽、H2O2誘導(dǎo)，與單獨(dú)處理結(jié)果相比，RbohB基因表達(dá)明顯降低，表明該基因在油菜適應(yīng)低溫、高鹽、H2O2脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用，U0126對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄有抑制作用。NADPH氧化酶活性受H2O2處理的誘導(dǎo)，U0126預(yù)處理12 h再經(jīng)H2O2處理，與單獨(dú)H2O2處理結(jié)果相比，NADPH氧化酶活性明顯降低，表明MAPKK抑制劑U0126對(duì)該酶活性有抑制作用。

油菜；RbohB基因；分子克??；表達(dá)分析

近年來(lái)的研究結(jié)果表明，NADPH氧化酶活性除了受到Ca2+、鈣依賴(lài)蛋白激酶(CDPK)、RacGTP酶的調(diào)節(jié)外，MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)途徑在NADPH氧化酶活性調(diào)節(jié)過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要的作用。MAP激酶級(jí)聯(lián)途徑是真核細(xì)胞中將外源信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)響應(yīng)的重要途徑之一，該途徑廣泛參與氧爆發(fā)的信號(hào)過(guò)程[9]。玉米葉肉細(xì)胞中干旱和ABA誘導(dǎo)的抗氧化保護(hù)依賴(lài)于H2O2的產(chǎn)生和MAPK的活性[10]。煙草中MEK2-SIPK/NTF4級(jí)聯(lián)可以調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生[6]。H2O2可以激活擬南芥中的MAPK激酶ANP1，ANP1，又可以激活下游的MPK3/MPK6[11]。進(jìn)一步的研究表明，MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)氧爆發(fā)的信號(hào)過(guò)程通過(guò)調(diào)節(jié)NADPH氧化酶活性的過(guò)程而實(shí)現(xiàn)。如煙草中MAPK激酶級(jí)聯(lián)途徑MEK2-SIPK/NTF4和MEK1-NTF6調(diào)節(jié)依賴(lài)于NADPH氧化酶的氧爆發(fā)，進(jìn)而影響著煙草對(duì)病原體侵染的抵抗力[6]。在番茄中油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)產(chǎn)生H2O2，H2O2進(jìn)一步激活番茄中的MAP激酶MPK2，有活性的MPK2反過(guò)來(lái)上調(diào)Rboh基因的表達(dá)、H2O2的積累以及植物的抗脅迫響應(yīng)[12]。番茄中NADPH氧化酶的激活導(dǎo)致質(zhì)外體H2O2的積累，H2O2誘導(dǎo)激活MPK1/2，有活性的MPK1/2進(jìn)一步誘導(dǎo)各種脅迫響應(yīng)[13]。這些研究結(jié)果表明，在ROS產(chǎn)生過(guò)程中，Rboh的轉(zhuǎn)錄激活及翻譯后調(diào)節(jié)是MAP激酶級(jí)聯(lián)途徑的功能之一。以上關(guān)于MAP激酶級(jí)聯(lián)途徑參與NADPH氧化酶(Rboh)的轉(zhuǎn)錄激活及翻譯后調(diào)節(jié)的研究主要集中在ABA、油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)以及病原體侵染等領(lǐng)域，那么在低溫、干旱以及高鹽等非生物脅迫條件下，MAP激酶級(jí)聯(lián)途徑與Rboh之間是否也存在類(lèi)似的調(diào)解關(guān)系，目前還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

油菜是重要的油料作物，白菜型冬油菜新品種‘隴油6號(hào)’是一種超強(qiáng)抗寒性品種，適應(yīng)于極端低溫為-20℃～-30℃的中國(guó)北方旱區(qū)、寒區(qū)種植，是目前能在甘肅省中北部與河西地區(qū)安全越冬的冬油菜品種。本研究以‘隴油6號(hào)’為研究材料，克隆RbohB基因，在低溫、高鹽、H2O2單獨(dú)處理，以及結(jié)合MAPKK專(zhuān)一性抑制劑U0126預(yù)處理情況下，對(duì)該基因的表達(dá)進(jìn)行分析，并對(duì)H2O2單獨(dú)處理，以及結(jié)合MAPKK專(zhuān)一性抑制劑U0126預(yù)處理情況下，對(duì)NADPH氧化酶基因活性變化進(jìn)行了分析，以期對(duì)RbohB基因在植物抗逆脅迫中的作用機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

‘隴油6號(hào)’和‘天油2號(hào)’油菜種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。選取飽滿的‘隴油6號(hào)’和‘天油2號(hào)’油菜種子，用水浸泡約20 min后種于預(yù)先浸透Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的混合營(yíng)養(yǎng)土中，每盆約6～8粒種子，置于室溫條件下培養(yǎng)，光周期為14 h/10 h(光照/黑暗)，光照強(qiáng)度130 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度50%～60%。挑選一月齡長(zhǎng)勢(shì)相同的幼苗用于后續(xù)基因克隆及逆境脅迫處理。

低溫處理：選取長(zhǎng)勢(shì)良好的兩種油菜幼苗置于4℃低溫誘導(dǎo)，分別在處理0、12、24、36、48 h后剪取幼嫩葉片，液氮冷凍，用于RNA的提取。NaCl處理：Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制成不同濃度的NaCl溶液(0、50、100、150、200 mmol·L-1)，浸泡同批生長(zhǎng)的油菜幼苗36 h后剪取幼嫩葉片，液氮冷凍，用于RNA的提取。H2O2處理：Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制成不同濃度的H2O2溶液(0、5、10、15、20 mmol·L-1)，浸泡同批生長(zhǎng)的油菜幼苗24 h后剪取幼嫩葉片，用于RNA的提取及NADPH氧化酶活性的測(cè)定。專(zhuān)一性MAPKK抑制劑U0126經(jīng)預(yù)處理后再逆境處理：將離體幼苗用蒸餾水清洗，放入水中2 h以抵消傷害脅迫，然后放入10 μmol·L-1MAPKK抑制劑U0126的溶液中預(yù)處理12 h，再進(jìn)行各種逆境處理，低溫處理為4℃處理18 h后剪取幼嫩葉片用于RNA的提取，鹽處理為100 mmol·L-1NaCl溶液中處理24 h后剪取幼嫩葉片用于RNA的提取，H2O2處理為10 mmol·L-1H2O2溶液中處理18 h后剪取幼嫩葉片用于RNA的提取及NADPH氧化酶活性測(cè)定。將蒸餾水處理作為對(duì)照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油菜RbohB基因的克隆

RbohB基因中間片段克隆，從Genbank下載已經(jīng)克隆得到的多種植物RbohB序列(包括擬南芥、玉山筷子芥、高山離子芥、獨(dú)行菜、甘藍(lán)等)，用DNAstar軟件Editseq模塊進(jìn)行序列編輯，MegAlign模塊進(jìn)行序列比對(duì),根據(jù)比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物RB-U和RB-D(表1)。選取生長(zhǎng)良好的‘隴油6號(hào)’油菜，利用Trizol試劑進(jìn)行油菜葉片總RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA，按照大連寶生物工程公司的Premix Ex Taq DNA Polymerase操作說(shuō)明書(shū)于25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物按照EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收試劑盒(離心柱型)(購(gòu)自全式金公司)回收，回收產(chǎn)物連入pTG19-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Trans 5α，過(guò)夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取若干白斑菌落進(jìn)行PCR及酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性克隆后送華大基因公司測(cè)序。

表1 PCR引物序列

RACE方法克隆RbohB基因全長(zhǎng)，以提取得到的‘隴油6號(hào)’油菜的總RNA為材料，分別按照TakaRa公司3′-Full RACE試劑盒和Invitrogen公司5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0試劑盒操作方法進(jìn)行RACE擴(kuò)增。3′RACE根據(jù)已得到的油菜RbohB的中間片段序列設(shè)計(jì)兩個(gè)基因特異性引物RB3′I和RB3′O(表1)，試劑盒中自帶的引物3′RACE Outer Primer和3′ RACE Inner Primer(表1)作為匹配的下游引物。油菜總RNA按照試劑盒操作說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用引物RB3′O和3′RACE Outer Primer進(jìn)行一擴(kuò)PCR，以一擴(kuò)PCR產(chǎn)物為模板，用引物RB3′I和3′RACE Inner Primer進(jìn)行二擴(kuò)PCR。將擴(kuò)增得到的預(yù)期大小的片段用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)(購(gòu)自全式金公司)進(jìn)行切膠回收，連接入pTG19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α，篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序。5′RACE根據(jù)已得到的油菜RbohB的中間片段序列設(shè)計(jì)兩個(gè)基因特異性引物RB5′O和RB5′I(表1)。試劑盒中自帶的引物AAP和AUAP(表1)作為匹配的上游引物。按照試劑盒操作說(shuō)明將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用引物RB5′O和AAP進(jìn)行一擴(kuò)PCR，以一擴(kuò)PCR產(chǎn)物為模板，用引物RB5′I和AUAP進(jìn)行二擴(kuò)PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后連入pTG19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α，篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序。

1.2.2 油菜RbohB預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用DNAstar軟件Megalign模塊進(jìn)行氨基酸序列的比對(duì)，用ClustalW方法進(jìn)行預(yù)測(cè)氨基酸序列同源性分析；以氨基酸序列為基礎(chǔ)用Clustal方法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；應(yīng)用TopPred對(duì)油菜RbohB預(yù)測(cè)蛋白的疏水性進(jìn)行在線分析；用SOPMA對(duì)油菜RbohB蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)。

1.2.3油菜RbohB基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

提取‘隴油6號(hào)’和‘天油2號(hào)’油菜莖、葉、下胚軸的mRNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，檢測(cè)油菜RbohB基因在不同組織中的表達(dá)量。

經(jīng)不同處理(詳見(jiàn)1.1)后提取‘隴油6號(hào)’和‘天油2號(hào)’油菜總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR模板。分別以ActinF、ActinR(表1)為管家基因引物，RBDL-U、RBDL-D(表1)為RbohB基因引物，按照大連寶生物工程公司的SYBR Premix Ex TaqTM操作說(shuō)明書(shū)于25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增體系為：SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)；55～95℃每30 s漸進(jìn)升高0.5℃，81個(gè)循環(huán)。采用2-△△ct方法分析數(shù)據(jù)，確定基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 NADPH氧化酶活性的測(cè)定

NADPH氧化酶活性的測(cè)量參考植物NADPH氧化酶活性光度法定量檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

測(cè)得的數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進(jìn)行分析，用Origin 9.0進(jìn)行做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜RbohB基因的克隆

根據(jù)GenBank上已知的植物RbohB基因序列，分別設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以隴油6號(hào)油菜中提取得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增得到了一條1 591 bp左右大小的單一條帶(圖1)，此條帶和預(yù)期大小相符，將其測(cè)序結(jié)果與其他植物的RbohB基因進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與擬南芥AtRbohB基因具有較高的同源性。因此可以初步判斷，擴(kuò)增產(chǎn)物為油菜RbohB基因片段。3′RACE擴(kuò)增使用TaKaRa公司的3′-Full RACE試劑盒，擴(kuò)增得到了大約1 332 bp大小的片段(圖2A)。該測(cè)序結(jié)果與前面擴(kuò)增得到的油菜RbohB基因部分片段進(jìn)行序列比對(duì)，重疊部分的序列完全相同，說(shuō)明前面克隆得到的大小為1 591 bp的片段和3′RACE擴(kuò)增的片段來(lái)自于同一條基因。5′RACE擴(kuò)增使用Invitrogen公司的System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0試劑盒，擴(kuò)增得到了293 bp大小的片段(圖2B)。該測(cè)序結(jié)果與之前擴(kuò)增得到的油菜RbohB基因部分片段進(jìn)行序列比對(duì)，重疊部分的序列完全一致，說(shuō)明前面克隆得到的大小為1 591 bp的片段與5′RACE得到的片段來(lái)自于同一條基因。

將3′RACE和5′RACE獲得的片段與之前擴(kuò)增得到的1 591 bp的中間片段進(jìn)行序列拼接，得到了一條全長(zhǎng)為2 694 bp的基因序列，包含一個(gè)2 541 bp開(kāi)放閱讀框(ORF)，起始密碼子ATG前5′-UTR 10 bp，終止密碼子TAG后3′-UTR 143 bp，包含12 bp的polyA。該基因編碼846個(gè)氨基酸(圖3)，預(yù)測(cè)蛋白分子量為96.7 kD，等電點(diǎn)為8.4。為了保證獲得的油菜RbohB基因拼接序列的準(zhǔn)確性，根據(jù)該拼接序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果與拼接而成的序列進(jìn)行比對(duì)，核苷酸組成完全一致。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增油菜RbohB基因片段 M.分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.RbohB基因片段Fig.1 RT-PCR amplification of RbohB fragment in B.campestris L. M.Marker；1.Amplification of RbohB fragment

圖2 3′RACE和5′RACE PCR結(jié)果電泳圖 A. 3′RACE PCR結(jié)果；B. 5′RACE PCR結(jié)果；M.分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.RACE結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product of 3′RACE and 5′RACE A. PCR product of 3′RACE；B. PCR product of 5′RACE；M.Marker；1.PCR product of RACE

2.2 油菜RbohB預(yù)測(cè)蛋白的生物信息學(xué)分析

從Genbank中下載已經(jīng)克隆得到的其他植物RbohB基因序列，利用DNAStar軟件，將所有基因的CDS區(qū)導(dǎo)入Megalign模塊，用ClustalW方法進(jìn)行氨基酸序列的比對(duì)，預(yù)測(cè)同源性分析。發(fā)現(xiàn)油菜RbohB與擬南芥AtRbohB(NM_202070)、亞麻薺CsrbohB(XM_010459875)的同源性分別為86.7%、87%。同時(shí)，對(duì)擬南芥、亞麻薺等RbohB蛋白質(zhì)序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示(圖4)，油菜RbohB與擬南芥AtRbohB、亞麻薺CsrbohB的親緣關(guān)系較近。油菜RbohB與AtRbohB、CsrbohB均具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TMDⅠ-TMDⅥ)、FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域、NADPH結(jié)合結(jié)構(gòu)域，N-末端都含有2個(gè)可以結(jié)合Ca2+的EF手性模體結(jié)構(gòu)(EF-hand)(圖5)。應(yīng)用TopPred(http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?#forms::toppred)對(duì)油菜RbohB預(yù)測(cè)蛋白的疏水性進(jìn)行在線分析表明，該蛋白有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。用SOPMA對(duì)油菜RbohB蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：油菜RbohB包含44.09% α-螺旋(Alpha helix)、19.98%延伸鏈(Extended strand)、8.87%β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)和27.07%不規(guī)則卷曲(Randomcoil)，油菜RbohB蛋白主要以α一螺旋和不規(guī)則卷曲為主。

圖3 油菜RbohB基因cDNA序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.3 The full-length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of RbohB gene in B.campestris L.

2.3 油菜RbohB基因組織特異性表達(dá)檢測(cè)

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的‘隴油6號(hào)’和‘天油2號(hào)’油菜植株直接提取莖、葉和下胚軸總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果(圖6)表明，RbohB在油菜莖、葉和下胚軸中均表達(dá)，葉表達(dá)量最高，下胚軸其次，莖最弱。

圖4 油菜RbohB與部分植物RbohB基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 The phylogenetic relationship of the RbohB with RbohB from other plant species

圖5 油菜RbohB與其它植物RbohB氨基酸序列比對(duì) *.FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域；#.NADPH結(jié)合結(jié)構(gòu)域Fig.5 Alignment of the B.campestris L. RbohB with RbohB from other plant species *.Represents the FAD binding domain；#.Represents the NADPH binding domain

圖6 RbohB基因在不同組織中的表達(dá)Fig.6 The expression of RbohB gene in different tissues

圖7 不同處理下油菜RbohB基因的表達(dá) A.低溫(4℃)脅迫；B.鹽(NaCl)脅迫；C. H2O2脅迫Fig.7 The expression of RbohB genes of B.campestris L. under different treatments A. Low temperature(4℃) stress; B. Salt(NaCl) stress; C. H2O2 stress

2.4逆境脅迫下油菜RbohB基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)分析

低溫脅迫處理對(duì)油菜RbohB轉(zhuǎn)錄水平的影響，為了分析油菜RbohB基因在油菜抗低溫脅迫中的作用，以‘隴油6號(hào)’和‘天油2號(hào)’兩種油菜葉片為材料，對(duì)其在低溫脅迫前后RbohB基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：油菜RbohB基因的表達(dá)受4℃低溫脅迫誘導(dǎo)，經(jīng)4℃低溫處理12、24、36、48 h后，兩種油菜中RbohB基因的表達(dá)整體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。‘隴油6號(hào)’油菜RbohB基因轉(zhuǎn)錄水平分別提高到對(duì)照組的2.296、3.64、3.114、2.364倍，于24 h達(dá)到最大值?！煊?號(hào)’油菜RbohB基因的相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照的1.422、1.227、0.993、0.903倍，于12 h達(dá)到最大值(圖7A)。就RbohB基因的表達(dá)量增長(zhǎng)趨勢(shì)而言，‘隴油6號(hào)’油菜較‘天油2號(hào)’更明顯，表明RbohB基因在‘隴油6號(hào)’油菜中受低溫脅迫誘導(dǎo)的程度更強(qiáng)，這與‘隴油6號(hào)’油菜比‘天油2號(hào)’更具有抗寒性的生理特性一致。

鹽脅迫處理對(duì)RbohB轉(zhuǎn)錄水平的影響，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：油菜RbohB基因的表達(dá)明顯受鹽脅迫的誘導(dǎo)。在不同濃度(50、100、150、200 mmol·L-1)鹽溶液處理36 h后，‘隴油6號(hào)’油菜RbohB基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著鹽溶液濃度的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且其相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照均有明顯的提高，分別提高到對(duì)照的3.411、24.59、12.042、3.16倍，并于100 mmol·L-1達(dá)到最大值?！煊?號(hào)’油菜中，RbohB基因的相對(duì)表達(dá)量所呈現(xiàn)的變化趨勢(shì)與‘隴油6號(hào)’基本一致，但幅度較小，分別是對(duì)照的1.905、2.189、3.945、3.16倍(圖7B)。說(shuō)明RbohB基因在油菜抗鹽脅迫反應(yīng)中發(fā)揮作用，在同樣強(qiáng)度的鹽脅迫條件下，‘隴油6號(hào)’RbohB基因的相對(duì)表達(dá)量要比‘天油2號(hào)’的表達(dá)量高。

H2O2脅迫處理對(duì)RbohB轉(zhuǎn)錄水平的影響，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明：RbohB基因的表達(dá)受H2O2脅迫的誘導(dǎo)。在不同濃度(5、10、15、20 mmol·L-1)H2O2溶液中處理24 h后，‘隴油6號(hào)’油菜中RbohB基因轉(zhuǎn)錄水平隨著H2O2濃度的增大而呈現(xiàn)依次升高的趨勢(shì)，分別是對(duì)照的0.878，2.297，3.117，3.643倍，于20 mmol·L-1達(dá)到了最大值。‘天油2號(hào)’油菜中，隨著處理濃度的增大，表達(dá)量較對(duì)照有不同程度的增強(qiáng)，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，只是變化幅度較小，在15 mmol·L-1達(dá)到最大值(圖7C)。在同樣強(qiáng)度的H2O2脅迫作用下，‘隴油6號(hào)’油菜RbohB基因表達(dá)量比‘天油2號(hào)’的表達(dá)量高，表明RbohB基因在‘隴油6號(hào)’油菜中比‘天油2號(hào)’油菜中受H2O2脅迫誘導(dǎo)程度較強(qiáng)。

圖8 MAPKK抑制劑U0126預(yù)處理下油菜RbohB基因的表達(dá) A.U0126預(yù)處理再低溫(4℃)脅迫；B.U0126預(yù)處理再鹽(NaCl)脅迫；C.U0126預(yù)處理再H2O2脅迫Fig.8 The expression of RbohB genes of B.campestris L. under MAPKK inhibitor U0126 pretreatment A. U0126 pretreatment and then low temperature(4℃) stress; B. U0126 pretreatment and then salt(NaCl) stress; C. U0126 pretreatment and then H2O2 stress

2.5MAPKK抑制劑預(yù)處理對(duì)逆境脅迫下油菜RbohB基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明：4℃低溫處理18 h后，‘隴油6號(hào)’和‘天油2號(hào)’兩種油菜RbohB轉(zhuǎn)錄水平分別提高到對(duì)照的5.579、4.724倍，在經(jīng)過(guò)MAPKK抑制劑U0126預(yù)處理再4℃處理后，‘隴油6號(hào)’和‘天油2號(hào)’油菜中RbohB基因的轉(zhuǎn)錄水平分別提高到各自對(duì)照的3.364、2.412倍，較各自單獨(dú)4℃低溫處理均有明顯降低(圖8A)；100 mmol·L-1NaCl溶液中處理24 h后，‘隴油6號(hào)’和‘天油2號(hào)’油菜中RbohB基因轉(zhuǎn)錄水平分別提高到各自對(duì)照的6.233、1.647倍，在經(jīng)過(guò)MAPKK抑制劑U0126預(yù)處理再100 mmol·L-1NaCl溶液中處理24 h后，‘隴油6號(hào)’和‘天油2號(hào)’油菜中RbohB基因的轉(zhuǎn)錄水平分別為各自對(duì)照的1.569、0.48倍，較各自單獨(dú)鹽處理均有明顯降低(圖8B)；10 mmol·L-1H2O2溶液中處理18 h后，‘隴油6號(hào)’和‘天油2號(hào)’油菜RbohB基因的轉(zhuǎn)錄水平分別提高到各自對(duì)照的23.425、7.944倍，MAPKK抑制劑U0126預(yù)處理12 h再轉(zhuǎn)入10 mmol·L-1H2O2溶液中處理18 h后，‘隴油6號(hào)’和‘天油2號(hào)’油菜中RbohB基因的轉(zhuǎn)錄水平分別為各自對(duì)照的11.081、0.525倍，較各自單獨(dú)H2O2溶液處理均有明顯降低(圖8C)。以上結(jié)果說(shuō)明MAPKK抑制劑U0126預(yù)處理抑制了低溫、鹽以及H2O2脅迫對(duì)油菜RbohB基因的誘導(dǎo)，造成其轉(zhuǎn)錄水平降低。

2.6H2O2脅迫下兩種油菜葉片中NADPH氧化酶活性的變化

在不同濃度H2O2脅迫處理24 h后，‘隴油6號(hào)’油菜中NADPH氧化酶的活性隨著處理濃度的增大而升高，與對(duì)照相比，差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)?！煊?號(hào)’油菜中則呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，并于20 mmol·L-1時(shí)NADPH氧化酶活性迅速下降。在同一脅迫濃度下，‘隴油6號(hào)’油菜中NADPH氧化酶的活性均高于‘天油2號(hào)’(圖9)，這與不同濃度H2O2處理下，兩種油菜中RbohB基因轉(zhuǎn)錄水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果是一致的。

圖9 H2O2脅迫下油菜NADPH氧化酶活性的變化 *,#.每個(gè)處理與對(duì)照之間在P<0.05水平差異顯著；**,##.每個(gè)處理與對(duì)照之間在P<0.01水平差異顯著 下同。Fig.9 Changes of NADPH oxidase activity of B.campestris L. under H2O2 stress *,#.Indicates that the difference between each treatment and the control at P<0.05 is significant; **,##.Indicates that there is a significant difference in P<0.01 between each treatment and control The same as below.

2.7MAPKK抑制劑預(yù)處理對(duì)H2O2脅迫下油菜NADPH氧化酶活性的影響

10 mmol·L-1H2O2溶液中處理18 h后，‘隴油6號(hào)’油菜中NADPH氧化酶活性升高到對(duì)照的126%，‘天油2號(hào)’中升高到對(duì)照的121%，差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。經(jīng)U0126預(yù)處理12 h再H2O2脅迫處理18 h后，兩種油菜中NADPH氧化酶的活性較H2O2單獨(dú)處理均有不同程度的下降，其中‘隴油6號(hào)’油菜中較對(duì)照降低了23.4%，‘天油2號(hào)’中則降低到對(duì)照的36.3%，差異達(dá)到顯著性水平(P<0.05)(圖10)。說(shuō)明兩種油菜中NADPH氧化酶的活性均受H2O2脅迫的誘導(dǎo)而有所升高，但經(jīng)過(guò)MAPKK專(zhuān)一抑制劑U0126預(yù)處理后，其活性有不同程度的降低，這與H2O2脅迫及MAPKK抑制劑預(yù)處理后再H2O2脅迫條件下，兩種油菜中RbohB基因轉(zhuǎn)錄水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果一致。

圖10 MAPKK抑制劑預(yù)處理下油菜NADPH氧化酶活性的變化Fig.10 Changes of NADPH oxidase activity of B.campestris L. under MAPKK inhibitor pretreatment

3 討論

NADPH氧化酶本身最早發(fā)現(xiàn)于人免疫系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞，是一個(gè)異源多聚體蛋白。在植物應(yīng)答生物脅迫和干旱、冷、紫外照射、ABA以及重金屬過(guò)量或缺乏等非生物脅迫反應(yīng)時(shí)，質(zhì)膜NADPH氧化酶通過(guò)短時(shí)間內(nèi)大量產(chǎn)生信號(hào)分子活性氧(ROS)調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞的新陳代謝，使植物及時(shí)應(yīng)對(duì)逆境脅迫作出反應(yīng)，以適應(yīng)環(huán)境的變化。本研究從‘隴油6號(hào)’油菜中克隆得到了含完整編碼序列的NADPH氧化酶RbohB基因，序列分析表明油菜RbohB基因和其他植物中已克隆得到的RbohB基因同源性很高。油菜RbohB基因具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)AD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和NADPH結(jié)合結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)可以結(jié)合Ca2+的EF手性模體。

不同逆境脅迫可以誘導(dǎo)Rboh表達(dá)，調(diào)節(jié)NADPH氧化酶活性，如禾白粉病菌通過(guò)刺激大麥HvrbohA基因表達(dá)，上調(diào)NADPH氧化酶活性，進(jìn)一步通過(guò)H2O2信號(hào)增強(qiáng)植物對(duì)病菌體的抗性[14]。外源ABA處理可以激活Rboh基因的轉(zhuǎn)錄，提高其轉(zhuǎn)錄活性，從而誘導(dǎo)一定量ROS的產(chǎn)生，ROS又可作為信號(hào)分子進(jìn)一步激活Rboh基因的轉(zhuǎn)錄，其結(jié)果是形成了一種信號(hào)放大機(jī)制，即由Rboh介導(dǎo)的ROS信號(hào)傳導(dǎo)途徑[15]。本研究表明，低溫、高鹽、H2O2脅迫都能不同程度地誘導(dǎo)兩種油菜RbohB基因的表達(dá)，說(shuō)明RbohB基因在油菜抵御非生物脅迫的過(guò)程中發(fā)揮了作用。已有研究顯示H2O2可以活化植物的MAPK且延長(zhǎng)MAPK活化時(shí)間可以導(dǎo)致氧爆發(fā)，這些結(jié)果說(shuō)明在ROS和MAPK級(jí)聯(lián)之間可能存在著一種交叉機(jī)制[16]。MEK2-SIPK/NTF4和MEK1-NTF6兩條MAPK級(jí)聯(lián)途徑調(diào)節(jié)著激發(fā)子INFI，它可以誘導(dǎo)煙草RbohB依賴(lài)性氧爆發(fā)，而且這種調(diào)節(jié)機(jī)制激活Rboh基因的表達(dá)主要是在轉(zhuǎn)錄水平上[6]。Zhang等[17]研究結(jié)果表明，油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2可以激活MAP激酶ZmMPK5，被激活的ZmMPK5又可以誘導(dǎo)NADPH氧化酶基因的表達(dá)，進(jìn)而進(jìn)一步提高H2O2的積累。因此，MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng)在ROS產(chǎn)生過(guò)程中的一個(gè)作用可能就是在轉(zhuǎn)錄水平激活Rboh基因的表達(dá)。MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)同時(shí)位于ROS的上下游，提示在MAPK與Rboh之間可能存在一個(gè)正反饋機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，MAPKK抑制劑U0126預(yù)處理12 h后再分別進(jìn)行低溫、高鹽、H2O2脅迫處理，其結(jié)果與各自單獨(dú)低溫、高鹽、H2O2脅迫處理結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)RbohB基因在兩種油菜中的轉(zhuǎn)錄水平都明顯降低。不同濃度H2O2處理后，兩種油菜中NADPH氧化酶活性均有不同水平的升高，而MAPKK抑制劑U0126預(yù)處理再經(jīng)H2O2處理后，兩種油菜中NADPH氧化酶的活性較單獨(dú)H2O2處理的結(jié)果均有所降低，這表明U0126對(duì)NADPH氧化酶的活性具有抑制作用。不論是在油菜RbohB基因的轉(zhuǎn)錄水平還是NADPH氧化酶活性水平上，MAPKK抑制劑U0126對(duì)二者均有抑制作用，因此推測(cè)油菜RbohB基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)可能與由MAPKKK→MAPKK→MAPK構(gòu)成的MAP激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑具有一定的相關(guān)性，即受到MAPK級(jí)聯(lián)途徑的調(diào)控，而且是某種正調(diào)控機(jī)制。

1.Van Breusegem F,Bailey-serres J,Mittler R.Unraveling the tapestry of networks involving reactive oxygen species in plants[J].Plant Physiology,2008,147(3):978-984.

2.Hu X L,Zhang A Y,Zhang J H,et al.Abscisic acid is a key inducer of hydrogen peroxide production in leaves ofMaizeplants exposed to water stress[J].Plant and Cell Physiology,2006,47(11):1484-1495.

3.Mittler R,Vanderauwera S,Gollery M,et al.Reactive oxygen gene network of plants[J].Trends in Plant Science,2004,9(10):490-498.

4.Pogány M,Von Rad U,Grün S,et al.Dual roles of reactive oxygen species and NADPH oxidase RBOHD in anArabidopsis-Alternariapathosystem[J].Plant Physiology,2009,151(3):1459-1475.

5.Kwak J M,Mori I C,Pei Z M,et al.NADPH oxidaseAtrbohDandAtrbohFgenes function in ROS-dependent ABA signaling inArabidopsis[J].The EMBO Journal,2003,22(11):2623-2633.

6.Asai S,Kohji K,Yoshioka H.MAPK signaling regulates nitric oxide and NADPH oxidase-dependent oxidative bursts inNicotianabenthamiana[J].The Plant Cell,2008,20(5):1390-1406.

7.Zhao Z G,Chen G C,Zhang C L.Interaction between reactive oxygen species and nitric oxide in drought-induced abscisic acid synthesis in root tip ofwheatseedlings[J].Australian Journal of Plant Physiology,2001,28(10):1055-1061.

8.Shen W Y,Nada K,Tachibana S.Involvement of polyamines in the chilling tolerance of cucumber cultivars[J].Plant Physiology,2000,124(1):431-440.

9.Ren D T,Yang H P,Zhang S Q.Cell death mediated by MAPK is associated with hydrogen peroxide production inArabidopsis[J].Journal of Biological Chemistry,2002,277(1):559-565.

10.Zhang A Y,Jiang M Y,Zhang J H,et al.Nitric oxide induced by hydrogen peroxide mediates abscisic acid-induced activation of the mitogen-activated protein kinase cascade involved in antioxidant defense in maize leaves[J].New Phytologist,2007,175(1):36-50.

11.Moon H,Lee B,Choi G,et al.NDP kinase 2 interacts with two oxidative stress-activated MAPKs to regulate cellular redox state and enhances multiple stress tolerance in transgenic plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,100(1):358-363.

12.Nie W F,Wang M M,Xia X J,et al.Silencing of tomatoRBOH1 andMPK2 abolishes brassinosteroid-induced H2O2generation and stress tolerance[J].Plant,Cell & Environment,2012,36(4):789-803.

13.Zhou J,Xia X J,Zhou Y H,et al.RBOH1-dependent H2O2production and subsequent activation of MPK1/2 play an important role in acclimation-induced cross-tolerance in tomato[J].Journal of Experimental Botany,2014,65(2):595-607.

14.Trujillo M,Altschmied L,Schweizer P,et al.Respiratory burstOxidasehomologueA of barley contributes to penetration by the powdery mildew fungusBlumeriagraminisf.sp.hordei[J].Journal of Experimental Botany,2006,57(14):3781-3791.

15.Sagi M,Fluhr R.Production of reactive oxygen species by plant NADPH oxidases[J].Plant Physiology,2006,141(2):336-340.

16.Cathcart M K.Regulation of superoxide anion production by NADPH oxidase in monocytes/macrophages:contributions to atherosclerosis[J].Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology,2004,24(1):23-28.

17.Zhang A Y,Zhang J,Ye N H,et al.ZmMPK5 is required for the NADPH oxidase-mediated self-propagation of apoplastic H2O2in brassinosteroid-induced antioxidant defence in leaves of maize[J].Journal of Experimental Botany,2010,61(15):4399-4411.

The National Natural Science Foundation of China(31460099)

introduction：ZHANG Teng-Guo(1971—),male,Dr.,professor,Mainly engaged in the study of physiological and molecular biology.

date:2016-12-19

CloningandExpressionAnalysisofRbohBGeneinBrassicacampestrisL.

ZHANG Teng-Guo LUO Dan-Yu GUO Yan-Feng ZHENG Sheng WANG Juan

(School of Life Sciences,Northwest Normal University,Lanzhou 730070)

A novelRbohBgene was isolated fromBrassicacampestrisL. Longyou 6 by RACE. The full-length cDNA ofRbohBis 2 694 bp, with open reading frame (ORF) 2 541 bp, encoding a 846 amino acid protein. By RT-PCR analysis, transcript level ofRbohBwas increased in response to cold, high salt and H2O2stress. However, MAPKK inhibitor U0126 pretreatment 12 h before cold, high salt and H2O2stress, compared with the single stress, the expression level ofRbohBwas significantly decreasing. The results suggested thatRbohBplayed an important role during cold, high salt and H2O2stress inB.campestrisL. and U0126 has inhibitory effect toRbohBgene transcription. The activity level of NADPH oxidase was increased in response to H2O2stress. However, U0126 pretreatment 12 h before H2O2stress, compared with the single H2O2stress, NADPH oxidase activity was significantly decreasing. The result showed that MAPKK inhibitor U0126 has inhibitory effect to NADPH oxidase activity.

BrassicacampestrisL.;RbohBgene;molecular cloning;expression analysis

國(guó)家自然科學(xué)基金(31460099)

張騰國(guó)(1971—)，男，博士，教授，主要從事抗逆生理及分子生物學(xué)研究。

2016-12-19

S565.4

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.05.016