欒嵐，張?zhí)旄?，韓斌，羅文婷，吳非，廖鑫，張君杰，白陽(yáng)，程新宇，滕猛，王翠芳

（1. 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科，沈陽(yáng) 110024； 2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院泌尿外科，沈陽(yáng) 110004）

miR-218-1-3p對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響

欒嵐1，張?zhí)旄?，韓斌2，羅文婷2，吳非1，廖鑫1，張君杰1，白陽(yáng)1，程新宇1，滕猛1，王翠芳1

（1. 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科，沈陽(yáng) 110024； 2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院泌尿外科，沈陽(yáng) 110004）

目的探究miR-218-1-3p對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞周期和凋亡的影響。方法使用LipofectamineTM2000 Reagent將miR-218-1-3p模擬物轉(zhuǎn)染入非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中，實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-218-1-3p的表達(dá)，MTS法檢測(cè)miR-218-1-3p對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-218-1-3p的A549細(xì)胞周期及凋亡的改變，熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞增殖、周期和凋亡相關(guān)指標(biāo)變化。結(jié)果同對(duì)照組相比，miR-218-1-3p模擬物組細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制（P ＜ 0.05），S期和G2-M期細(xì)胞比例明顯降低（P ＜ 0.05），此外miR-218-1-3p模擬物組早期凋亡細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯增加（P ＜ 0.05）。繼續(xù)檢測(cè)了與細(xì)胞增殖、周期和凋亡相關(guān)的指標(biāo)，其中CYCLIN-D1和BCL-2的表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)論miR-218-1-3p可能通過(guò)調(diào)控CYCLIN-D1和BCL-2，從而抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖，對(duì)其產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯并促進(jìn)其凋亡。

miR-218-1-3p； 非小細(xì)胞肺癌； 增殖； 周期； 凋亡

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：

肺癌是世界上第二常見(jiàn)的癌癥，其中80%以上的肺癌是非小細(xì)胞肺癌［1］。其診斷和治療雖然在近幾年取得了一定的進(jìn)步，但肺癌患者的總體生存率仍然不佳［2］。microRNA（miRNA）是一類能夠參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、發(fā)育和細(xì)胞凋亡等多種生物過(guò)程的內(nèi)源性非編碼小分子RNA［3］，它同時(shí)可以調(diào)控其靶基因參與細(xì)胞癌變并調(diào)節(jié)癌癥的轉(zhuǎn)移過(guò)程。miRNA的基因變異同癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)后以及生存相關(guān)［4-6］。miR-218是重要的miRNA之一，它能夠?qū)Χ喾N腫瘤的發(fā)生與發(fā)展起到抑制作用［7］。本研究通過(guò)調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中miR-218-1-3p的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞增殖、周期和凋亡的變化，進(jìn)而探討miR-218-1-3p對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清購(gòu)自以色列bi公司，Trizol試劑和轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)Keygentec公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自澳大利亞Bender Medsystem公司，人肺腺癌A549細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)PCR：根據(jù)操作說(shuō)明采用Trizol （美國(guó)Invitrogen公司）提取細(xì)胞中的總RNA。以RNU6B作為內(nèi)參對(duì)照，根據(jù)操作說(shuō)明使用miR-218-1-3p特異引物在ABI 7900HT （美國(guó)Applied Biosystems公司）中運(yùn)行檢測(cè)miR-218-1-3p （中國(guó)RiboBio公司）的表達(dá)。以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)普通基因引物，其序列參見(jiàn)下表。通過(guò)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)并采用公式RQ=2-??Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 目的基因序列Tab.1 Primer sequences

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：使用含10%胎牛血清的高糖 DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞種入6孔板，依照操作說(shuō)明用LipofectamineTM2000 Reagent試劑盒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染入miR-218-1-3p模擬物組設(shè)置為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染入對(duì)照模擬物組設(shè)置為對(duì)照組。

1.2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線檢測(cè)：將轉(zhuǎn)染miR-218-1-3p模擬物組和對(duì)照組細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取24、48、72、96和120 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，結(jié)束培養(yǎng)前2 h每孔加入20 μ L細(xì)胞增殖比色測(cè)定試劑（MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit），置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。2 h后利用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)490 nm波長(zhǎng)的OD值，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè)：按照操作說(shuō)明使用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)細(xì)胞周期。細(xì)胞在6孔板中轉(zhuǎn)染48 h后，75%乙醇固定，PI染色，使用BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每組進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：按照操作說(shuō)明，使用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞在6孔板中轉(zhuǎn)染48 h后，Annexin V、PI染色，使用BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每組進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)時(shí)定量結(jié)果數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)log2轉(zhuǎn)換，使用x-±s進(jìn)行描述。采用獨(dú)立t檢驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染miR-218-1-3p 模擬物組與對(duì)照組細(xì)胞增殖、周期和凋亡的差異。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-218-3p抑制A549細(xì)胞增殖

將miR-218-1-3p 模擬物轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞后48 h，實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-218-1-3p，模擬物組中miR-218-1-3p的表達(dá)上調(diào)1 833倍（P ＜ 0.01，圖1A），說(shuō)明轉(zhuǎn)染有效。轉(zhuǎn)染后連續(xù)5 d使用MTS方法檢測(cè)細(xì)胞增殖，繪制細(xì)胞增殖曲線，與對(duì)照組相比，miR-218-1-3p 模擬物組細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制（P ＜0.05，圖1B），可見(jiàn)miR-218-1-3p能抑制A549細(xì)胞增殖。

2.2 miR-218-1-3p對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-218-1-3p 模擬物，48 h后經(jīng)過(guò)PI染色，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化，上調(diào)miR-218-1-3p組G0/G1期細(xì)胞比例同對(duì)照組相比上調(diào)了167%（P ＜ 0.05），而S期和G2/M期細(xì)胞比例同對(duì)照組相比分別下降了16%和51% （P 均＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖1 A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-218-1-3p 模擬物后轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證以及對(duì)增殖能力的影響Fig.1 Validation of transfection efficiency of miR-218-1-3p mimic and effect of proliferation ability in A549 cells

2.3 miR-218-1-3p促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡

在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-218-1-3p模擬物，48 h后經(jīng)過(guò)PI/Annexin V雙染，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化，上調(diào)miR-218-1-3p組早期凋亡細(xì)胞比例為2.19%，較對(duì)照組的1.03%明顯增加（P ＜ 0.05），可見(jiàn)在A549細(xì)胞中miR-218-1-3p可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖3。

圖2 A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-218-1-3p模擬物后細(xì)胞周期的變化Fig.2 Changes in cell cycle and in A549 cells after transfection with miR-218-1-3p mimic

2.4 A549細(xì)胞中上調(diào)miR-218-1-3p相關(guān)指標(biāo)變化

將miR-218-1-3p模擬物轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中48 h后收集細(xì)胞，提取RNA，實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)細(xì)胞增殖、周期和凋亡相關(guān)指標(biāo)Rho A，Rho B，Rho C，CYCLIN A1，CYCLIN B，CYCLIN D1，BCL-2 和 Caspase-3的變化，其中上調(diào)miR-218-1-3p組CYCLIN D1的表達(dá)水平降低至對(duì)照組的（0.58±0.20）倍（P ＜ 0.05），BCL-2的表達(dá)水平降低至對(duì)照組的（0.65±0.15）倍（P ＜0.05）。

3 討論

肺癌是世界上第二常見(jiàn)的腫瘤，也是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。盡管手術(shù)和藥物治療取得了一定的進(jìn)展，但是肺癌患者的總體生存率仍然很低［8］。由于其增殖能力快速，導(dǎo)致被確診時(shí)大多已經(jīng)處于晚期而不可治愈［9］，因此抑制腫瘤細(xì)胞的增殖對(duì)治療肺癌起到至關(guān)重要的作用。

miRNA是一類非編碼RNA，是基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控子。miRNA可以同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)基因或通路從而影響整個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)生物過(guò)程，而miRNA的異常表達(dá)可以導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生［9］。研究［10］表明，在非小細(xì)胞肺癌中存在14種miRNA的表達(dá)發(fā)生改變。

圖3 A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-218-1-3p模擬物后細(xì)胞凋亡情況的變化Fig.3 Changes in apoptosis in A549 cells after transfection with miR-218-1-3p mimic

miR-218作為脊椎動(dòng)物的特異miRNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，它通過(guò)結(jié)合受體蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶、高遷移率族蛋白B1、5’-氨基酮戊酸合成酶2等多個(gè)靶基因的3’非翻譯區(qū)抑制靶基因的表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)作用［11-13］。本研究組之前的研究［14］已經(jīng)證實(shí)，miR-218-1-3p在非小細(xì)胞肺癌組織中低表達(dá)并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究中MTS實(shí)驗(yàn)測(cè)得轉(zhuǎn)染miR-218-1-3p模擬物組細(xì)胞的OD值同對(duì)照組相比均有不同程度降低，說(shuō)明轉(zhuǎn)染miR-218-1-3p模擬物組細(xì)胞的活性下降，其增殖能力受到影響。本研究還使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-218-1-3p模擬物組及對(duì)照組細(xì)胞周期與凋亡的變化，其中實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例同對(duì)照組相比顯著提高（P ＜ 0.05），而S期和G2/M期細(xì)胞比例則有明顯降低（P ＜ 0.05），S期為DNA合成期，是細(xì)胞分裂增殖關(guān)鍵時(shí)期，細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)表明，miR-218-1-3p的上調(diào)抑制了A549細(xì)胞的增殖能力。同時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-218-1-3p模擬物組早期凋亡細(xì)胞比例為對(duì)照組的2.13倍（P ＜ 0.05），說(shuō)明miR-218-1-3p可以增加非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CYCLIN D1是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，作為主要的有絲分裂傳感器，CYCLIN D1與CDK4/CDK6二聚化形成全酶的調(diào)節(jié)亞基，通過(guò)磷酸化pRb蛋白調(diào)控細(xì)胞的G1/S期的進(jìn)展，在細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞周期中起到連接的作用。CYCLIN D1水平的改變對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響非常明顯，其過(guò)度表達(dá)可在多種腫瘤中檢測(cè)到［15-16］，BCL-2為抗凋亡家族成員，其通過(guò)約束促凋亡蛋白Bax和Bak來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，BCL-2的過(guò)表達(dá)同樣可在多種惡性腫瘤細(xì)胞中被檢測(cè)到［17］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)證實(shí)，轉(zhuǎn)染miR-218-1-3p模擬物組CYCLIN D1和BCL-2表達(dá)均有明顯下降，因此推測(cè)miR-218-1-3p可能通過(guò)調(diào)控CYCLIN D1和BCL-2的表達(dá)從而對(duì)A549細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯并促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，本研究初步證明miR-218-1-3p可以降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞S期比例，抑制A549細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。下一步的研究方向?qū)⒚鞔_其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的具體途徑，這對(duì)于尋找miR-218-1-3p在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中的作用位點(diǎn)，進(jìn)而探尋基因治療非小細(xì)胞肺癌新的作用靶點(diǎn)有著非常重要的意義。

［1］ FARHAT FS，HOUHOU W. Targeted therapies in non-small cell lung carcinoma：what have we achieved so far ［J］. Ther Adv Med Oncol，2013，5（4）：249-270. DOI：10.1177/1758834013492001.

［2］ WANG D，NARULA N，AZZOPARDI S，et al. Expression of the receptor for hyaluronic acid mediated motility （RHAMM） is associated with poor prognosis and metastasis in non-small cell lung carcinoma［J］. Oncotarget，2016，7（26）：39957-39969. DOI：10.18632/oncotarget.9554.

［3］ WANG J，LI Z，GE Q，et al. Characterization of microRNA transcriptome in tumor，adjacent，and normal tissues of lung squamous cell carcinoma ［J］. J Thorac Cardiovasc Surg，2015，149（5）：1404-1414.DOI：10.1016/j.jtcvs.2015.02.012.

［4］ WU S，SHEN W，PAN Y，et al. Genetic variations in key microRNAs are associated with the survival of nonsmall cell lung cancer［J］. Medicine （Baltimore），2015，94（47）：e2084. DOI：10.1097/MD.0000000000002084.

［5］ CHIU KL，KUO TT，KUOK QY，et al. ADAM9 enhances CDCP1 protein expression by suppressing miR-218 for lung tumor metastasis ［J］.Sci Rep，2015，5：16426. DOI：10.1038/srep16426.

［6］ SHER YP，WANG LJ，CHUANG LL，et al. ADAM9 up-regulates N-cadherin via miR-218 suppression in lung adenocarcinoma cells ［J］.PLoS One，2014，9（4）：e94065. DOI：10.1371/journal.pone.0094065.eCollection 2014.

［7］ WANG G，F(xiàn)U Y，LIU G，et al. MiR-218 inhibits proliferation，migration，and EMT of gastric cancer cells by targeting WASF3 ［J］. Oncol Res，2017，25（3）：355-364. DOI：10.3727/096504016X147381142 57367.

［8］ CUI R，MENG W，SUN HL，et al. MicroRNA-224 promotes tumor progression in nonsmall cell lung cancer ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（31）：E4288-E4297. DOI：10.1073/pnas.1502068112.

［9］ QI J，MU D. MicroRNAs and lung cancers：from pathogenesis to clinical implications ［J］. Front Med，2012，6（2）：134-155. DOI：10.1007/s11684-012-0188-4.

［10］ ZHU X，ZHANG X，WANG H，et al. MTA1 gene silencing inhibits invasion and alters the microRNA expression profile of human lung cancer cells ［J］. Oncol Rep，2012，28（1）：218-224. DOI：10.3892/or.2012.1770.

［11］ ZHANG C，GE S，HU C，et al. MiRNA-218，a new regulator of HMGB1，suppresses cell migration and invasion in non-small cell lung cancer ［J］. Acta Biochim Biophys Sin （Shanghai），2013，45（12）：1055-1061. DOI：10.1093/abbs/gmt109.

［12］ LAI X，CHEN Q，ZHU C，et al. Regulation of RPTPα-c-Src signalling pathway by miR-218 ［J］. FEBS J，2015，282（14）：2722-2734.DOI：10.1111/febs.13314.

［13］ LI Y，LIU S，SUN H，et al. MiR-218 inhibits erythroid differentiation and alters iron metabolism by targeting ALAS2 in K562 cells ［J］. Int J Mol Sci，2015，16（12）：2856-2868. DOI：10.3390/ijms161226088.

［14］ 欒嵐，韓斌，王翠芳，等. MicroRNA-218-1-3p在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義［J］. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，43（2）：181-183.

［15］ PYSZ MA，HAO F，HIZLI AA，et al. Differential regulation of cyclin D1 expression by protein kinase C α and ε signaling in intestinal epithelial cells ［J］. J Biol Chem，2014，289（32）：22268-22283.DOI：10.1074/jbc.M114.571554.

［16］ CASIMIRO MC，DI SANTE G，JU X，et al. Cyclin D1 promotes androgen-dependent DNA damage repair in prostate cancer cells［J］. Cancer Res，2016，76（2）：329-338. DOI：10.1158/0008-5472.CAN-15-0999.

［17］ ZHANG Y，LIU C，BARBIER O，et al. Bcl2 is a critical regulator of bile acid homeostasis by dictating Shp and lncRNA H19 function ［J］.Sci Rep，2016，6：20559. DOI：10.1038/srep20559.

（編輯 于 溪）

Effects of miR-218-1-3p on Cell Proliferation，Cycle，and Apoptosis of Non-small Cell Lung Cancer

LUAN Lan1，ZHANG Tiange2，HAN Bin2，LUO Wenting2，WU Fei1，LIAO Xin1，ZHANG Junjie1，BAI Yang1，CHENG Xinyu1，TENG Meng1，WANG Cuifang1

（1. Department of Pathology，Central Hospital Affiliated To Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China； 2. Department of First Urology Surgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the effect of miR-218-1-3p on the proliferation，cycle，and apoptosis of A549 cells in non-small-cell lung cancer.MethodsmiR-218-1-3p was transfected into non-small cell lung cancer A549 cells by LipofectamineTM2000 Reagent，and the expression of miR-218-3p was detected by real-time PCR. Invasion and migration were assayed using the Transwell method. The effect of miR-218-1-3p on the proliferation of A549 cells was assayed by the MTS method. Changes in the cell cycle and apoptosis of A549 cells transfected with miR-218-1-3p was detected by flow cytometry. Changes in indicators related to cell proliferation，cycle，and apoptosis were detected by fluorescence quantitative PCR.ResultsCompared to the control group，the cell proliferation of A549 cells was significantly inhibited （P ＜ 0.05） and the proportion of cells in the S and G2-M phases was significantly decreased when miR-218-1-3p was up-regulated.In addition，compared with the control group，the early apoptotic rate was significantly increased by up-regulating miR-218-1-3p. We further detected indicators related to cell proliferation，cycle，and apoptosis and found that CYCLIN-D1 and BCL-2 were significantly downregulated.ConclusionmiR-218-1-3p may inhibit proliferation，induce cell cycle arrest，and promote cell apoptosis of non-small cell lung cancer A549 cells by regulating CYCLIN-D1 and BCL-2.

miR-218-1-3p； non-small cell lung cancer； proliferation； cycle； apoptosisin

R34

A

0258-4646（2017）11-0980-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.11.005

國(guó)家自然科學(xué)基金（81401907）；沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院青年基金（20102029）

欒嵐（1977-），女，副主任醫(yī)師，博士.

欒嵐，E-mail：luanlan33@163.com

2017-05-24