程 靜，宋紅萍，黃徐英，劉 萍，徐雅敏

(武漢市普愛醫(yī)院藥學(xué)部 430033)

·論著· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.29.001

南苜蓿總皂苷改善2型糖尿病大鼠糖代謝的作用機制*

程 靜，宋紅萍△，黃徐英，劉 萍，徐雅敏

(武漢市普愛醫(yī)院藥學(xué)部 430033)

南苜?？傇碥眨惶悄虿?，2型；抗炎；糖代謝；胰島素抗藥性

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，加之不健康的生活方式，我國糖尿病患病率迅速上升，糖尿病及其并發(fā)癥已經(jīng)成為嚴(yán)重的社會公共衛(wèi)生問題。其中，2型糖尿病(T2DM)患者所占比例達90%～95%[1]。目前廣泛應(yīng)用的口服降糖藥有磺酰脲類、雙胍類、噻唑烷二酮類、α-糖苷酶抑制劑及胰升糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，但都有不同程度的不良反應(yīng)[2]。從中草藥中尋找安全、有效、不良反應(yīng)小、多靶點作用的替代品，已成為目前研究的熱點。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將糖尿病及其并發(fā)癥歸于“消渴”“消癉”等范疇，認(rèn)為其形成機制以陰虛為本，燥熱為標(biāo)，并有血瘀貫穿病程的始終[3]。南苜蓿系豆科植物苜蓿屬植物南苜蓿(Medicago polymorpha L.)的全草，味苦、平、無毒，具有清熱解毒、利濕退黃、通淋排石的功效，主要用于治療黃疸、尿路結(jié)石、痔瘡出血、腸炎等[4]。糖尿病患者常食用苜蓿食品具有降血糖的作用，研究表明其有效成分主要為皂苷類、黃酮類、多糖類等[5-6]。此外，本實驗室前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)南苜?？傇碥?TSMP)對四氧嘧啶小鼠具有降糖作用，體外可促進HepG2細胞的葡萄糖消耗。本研究基于文獻研究和本實驗室前期研究結(jié)果，系統(tǒng)地探索TSMP防治T2DM的作用機制，為疾病防治提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康無特殊病原體(SPF)級雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量180～220 g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供[合格證號：SCXK(鄂)2008-0005]。高脂飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

1.1.2實驗藥物 TSMP(中山市中健藥物研究所有限公司，含量50%～60%，批號：100828)；葡萄糖粉(重慶和平制藥有限公司，批號：140109)；胰島素(江蘇萬邦生化醫(yī)藥有限公司，批號：1405202)；鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：1403113)。鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司，批號：S0130)；胰島素試劑盒(德國西門子醫(yī)學(xué)診斷公司，批號：37037124)；糖化血紅蛋白(HbΑ1c)(美國Bio-Rad公司實驗室，批號：64001873)?？蛊咸烟?6-磷酸酶(G-6-Pase)一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、抗磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)一抗(美國Abcam公司)。白細胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：AK0014SEP12001)。游離脂肪酸(FFA)、丙酮酸激酶(PK)、己糖激酶(HK)、葡萄糖激酶(GK)、瘦素(Leptin)、考馬斯亮藍試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20131009、20130916、20131106、20131120、20131022、20131129)；G-6-Pase、果糖-1，6-二磷酸酶試劑盒(上海寶曼生物科技有限公司，批號：20131210、20131128)。

1.1.3實驗儀器 拜安康血糖儀及試紙(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)，Bio-Rad D-10型血液分析儀、電泳儀、轉(zhuǎn)移電泳儀槽、蛋白電泳轉(zhuǎn)膜裝置、GelDoc2000型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1TSMP提取[7]取南苜蓿干燥全草，粉碎，50%乙醇提取2次，合并提取液，過濾，濾液回收溶劑，濃縮得濃縮液。將一次濃縮液加入大孔樹脂(AB-8型大孔樹脂)，水-乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，得二次濃縮液。減壓干燥，過篩，得總皂苷，含量50%～60%。

1.2.2動物分組及處理[8]70只雄性SD大鼠中，挑選10只作為對照組，始終飼以基礎(chǔ)飼料；其他大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)4周，大鼠禁食不禁水12 h后，按體質(zhì)量腹腔注射STZ溶液30 mg/kg，72 h后經(jīng)尾靜脈采血測空腹血糖(FBG)，F(xiàn)BG>11.1 mmol/L為糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。對照組腹腔注射同等體積的枸櫞酸緩沖液。將成模的T2DM大鼠40只分為TSMP高劑量組(1.4 g/kg)、TSMP低劑量組(0.7 g/kg)、二甲雙胍組(0.2 g/kg)、模型組(等量0.5%羧甲基纖維素鈉)，各10只。此時更換為正常飼料，同時開始灌胃，每天1次，連續(xù)給藥4周。期間每周測1次血糖。

1.2.3指標(biāo)檢測

1.2.3.1血液指標(biāo)及肝糖原 給藥結(jié)束后，禁食12～16 h，烏拉坦(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血測定胰島素抵抗指數(shù)(IRI)、FBG、HbΑ1c、IL-1β、TNF-α、FFA及Leptin水平。測定肝糖原水平。

1.2.3.2糖代謝相關(guān)酶活性 處死大鼠后，立即解剖分離取得肝臟，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，剝掉結(jié)締組織表面的脂肪。剪碎結(jié)締組織，用生理鹽水反復(fù)洗滌至無血色為止，再加生理鹽水少許，用組織勻漿器做成勻漿，以3 000 r/min離心10 min后，取上清液測定PK、HK、GK、G-6-Pase及果糖-1，6-二磷酸酶的活性。

1.2.3.3肝臟組織中G-6-Pase、PEPCK蛋白的表達 采用試劑盒提供的方法，冰上操作，從肝臟組織中提取蛋白樣品。然后以二喹啉甲酸(BCA)法測定各樣品中蛋白質(zhì)水平，-20 ℃保存。采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)分別檢測蛋白樣品中G-6-Pase、PEPCK蛋白的表達。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠IRI、FBG、HbΑ1c及肝糖原水平比較 與對照組比較，模型組大鼠的IRI及FBG、HbΑ1c水平明顯升高(P<0.05)。治療前，各給藥組與模型組大鼠的FBG水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后，與模型組比較，TSMP高劑量組和二甲雙胍組大鼠的IRI及FBG、HbA1c水平均降低(P<0.05)，TSMP高、低劑量組和二甲雙胍組大鼠的肝糖原水平均升高(P<0.05)，見表1。

2.2各組大鼠IL-1β、TNF-α、FFA及Leptin水平比較 與對照組比較，模型組大鼠的IL-1β、TNF-α、FFA、Leptin水平均明顯升高(P<0.05)。治療后，與模型組比較，TSMP高劑量組大鼠的IL-1β、TNF-α、FFA、Leptin水平均明顯降低(P<0.05)，見表2。

表1 各組大鼠IRI、FBG、HbA1c及肝糖原水平比較

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與模型組比較

表2 各組大鼠IL-1β、TNF-α、FFA及Leptin水平比較

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與模型組比較

表3 各組大鼠PK、HK、G-6-Pase、果糖-1，6-二磷酸酶及GK活性比較

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與模型組比較

2.3各組大鼠PK、HK、G-6-Pase、果糖-1，6-二磷酸酶及GK活性比較 與對照組比較，模型組大鼠的PK、HK、GK活性均下降(P<0.05)，G-6-Pase、果糖-1，6-二磷酸酶活性均上升(P<0.05)。治療后，與模型組比較，TSMP高劑量組大鼠的PK、HK、GK活性均上升(P<0.05)，G-6-Pase、果糖-1，6-二磷酸酶活性均下降(P<0.05)，見表3。

2.4各組大鼠肝臟組織中G-6-Pase與PEPCK蛋白表達 給藥4周后，與模型組比較，TSMP高劑量組大鼠G-6-Pase與PEPCK蛋白表達水平均降低(P<0.05)，見圖1。

1：對照組；2：模型組；3：TSMP低劑量組；4：TSMP高劑量組；5：二甲雙胍組；*：P<0.05，與模型組比較

圖1 Western blot測定肝臟組織中G-6-Pase及PEPCK蛋白表達

3 討 論

本研究以高脂飼料喂養(yǎng)加STZ誘導(dǎo)T2DM大鼠模型，觀察TSMP的降血糖作用，并探討其可能的作用機制。實驗結(jié)果提示，TSMP干預(yù)后能有效地降低T2DM大鼠的FBG、HbA1c水平，升高肝糖原水平，增強葡萄糖在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為糖原的儲存形式而降低血糖。

T2DM中大多存在胰島素抵抗、FFA升高及Leptin抵抗等，導(dǎo)致或參與炎性反應(yīng)，進而影響肝臟、肌肉和脂肪細胞等胰島素敏感細胞磷酸化，使胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，進而誘發(fā)胰島素抵抗[9]。FFA是脂肪代謝的中間產(chǎn)物，是機體主要的能量來源，升高的FFA可以使胰島素受體底物的絲氨酸殘基磷酸化作用增強，影響胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致糖代謝障礙[10]。Leptin在脂肪細胞和胰島素之間起負(fù)反饋的信號傳遞作用[11]。炎性因子通過炎癥信號通路中介的激活參與肝臟和肌肉組織對胰島素敏感性的影響，最終導(dǎo)致胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，從而產(chǎn)生胰島素抵抗[12]。實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠IL-1β、FFA、TNF-α及Leptin水平均明顯升高，而TSMP能有效降低T2DM大鼠的IL-1β、FFA、TNF-α、Leptin水平及IRI。TSMP可能通過降低FFA水平，調(diào)節(jié)胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運，改善糖代謝障礙；還可能減輕炎性反應(yīng)和降低Leptin水平，從而緩解胰島素抵抗作用。

肝臟通過血糖氧化分解、糖異生和肝糖原合成或分解對血液葡萄糖水平起到重要的調(diào)節(jié)作用。本實驗對肝臟產(chǎn)生和消耗葡萄糖的關(guān)鍵酶進行研究。其中，HK參與葡萄糖分解過程，PK催化糖酵解，GK參與葡萄糖代謝過程，果糖-1，6-二磷酸酶參與糖異生途徑，G-6-Pase是催化葡萄糖-6-磷酸水解為葡萄糖的關(guān)鍵酶。糖尿病狀態(tài)中這些酶活性失衡，HK、PK、GK活性降低，G-6-Pase、果糖-1，6-二磷酸酶活性升高，導(dǎo)致血糖升高[13]。本實驗結(jié)果顯示，TSMP使T2DM大鼠肝臟組織中HK、PK、GK活性升高，G-6-Pase、果糖-1，6-二磷酸酶活性下降，降低血糖，提示TSMP可以改善T2DM大鼠肝臟內(nèi)糖代謝紊亂，可能通過促進葡萄糖氧化代謝和抑制糖異生，減少葡萄糖生成，進而改善糖尿病。

胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，糖代謝紊亂，糖異生過度活躍，導(dǎo)致大量肝糖輸出，血糖水平持續(xù)上升，從而產(chǎn)生T2DM。其中G-6-Pase和PEPCK是肝臟糖異生中兩個關(guān)鍵的限速酶，抑制它們的表達水平能有效阻止肝臟糖異生，減少內(nèi)源性葡萄糖生成，這是其治療T2DM的重要機制[14]。本實驗結(jié)果顯示，TSMP可降低T2DM大鼠肝臟糖異生限速酶G-6-Pase和PEPCK的蛋白表達水平，抑制肝臟糖異生，減少葡萄糖生成，從而降低血糖。

綜上所述，TSMP可以改善T2DM大鼠的糖代謝紊亂狀態(tài)，其機制可能是促進肝細胞合成糖原，促進葡萄糖的利用并減少葡萄糖的生成，減輕炎性反應(yīng)，改善胰島素抵抗，從而達到對T2DM的治療效應(yīng)。

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ThemechanismoftotalsaponinsfromMedicagopolymorphaonglycometabolismintype2diabeticrats*

ChengJing，SongHongping△，HuangXuying，LiuPing，XuYamin

(DepartmentofPharmacy,Pu′aiHospitalofWuhanCity,Wuhan,Hubei430033,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effect of total saponins from Medicago polymorpha (TSMP) on glucose metabolism in type 2 diabetes mellitus (T2DM) rats and its possible mechanism.MethodsT2DM rats were established by feeding with fat diets and intraperitoneally injecting with STZ 30 mg/kg.The rats were divided into control group,model group,metformin group (0.2 g/kg),TSMP high dose group (1.4 g/kg) and TSMP low dose group (0.7 g/kg),which were administrated for four weeks.At the end of administration,blood samples were collected to determine insulin resistance index(IRI),levels of fasting blood glucose (FBG),glycosylated hemoglobin (HbA1c),hepatic glycogen,interleukin(IL)-1 β,tumor necrosis factor(TNF)-α,free fatty acids (FFA) and Leptin,and activities of pyruvate kinase (PK),hexokinase (HK),glucose-6-phosphatase (G-6-Pase),fructose-1,6-bisphosphatase and glucokinase (GK).Western blot was used to detect the expression levels of G-6-Pase and phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) proteins.ResultsCompared with the model group,high dose (1.4 g/kg) TSMP decreased IRI,levels of FBG,HbA1c,IL-1β,TNF-α,FFA and Leptin,and activities of G-6-Pase and fructose-1,6-bisphosphatase in T2DM rats (P<0.05),while increased level of hepatic glycogen,and activities of PK,HK and GK (P<0.05).Moreover,high dose (1.4 g/kg) TSMP down-regulated expression levels of G-6-Pase and PEPCK protein in liver tissues.ConclusionChronic administration of TSMP can improved glucose homeostasis in T2DM rats,which might be related to promoting utilization of glucose,and alleviating inflammatory and insulin resistance.

total saponins from Medicago polymorpha；diabetes mellitus，type 2；anti-inflammatory；glycometabolism；insulin resistance

國家自然科學(xué)基金資助項目(81503146)；武漢市衛(wèi)生計生委中醫(yī)藥類重點課題資助項目(WZ15A01)。

程靜(1983-)，主管藥師，碩士，主要從事中藥藥理學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:Songhongping@126.com。

目的探討南苜?？傇碥?TSMP)對2型糖尿病(T2DM)大鼠糖代謝的作用及其可能的機制。方法采用高脂加小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)T2DM大鼠模型，將大鼠分為對照組、模型組、二甲雙胍組(0.2 g/kg)、TSMP高劑量組(1.4 g/kg)、TSMP低劑量組(0.7 g/kg)，連續(xù)給藥4周，末次給藥后測定胰島素抵抗指數(shù)(IRI)、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、肝糖原、白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、游離脂肪酸(FFA)、瘦素(Leptin)水平，以及丙酮酸激酶(PK)、己糖激酶(HK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)、果糖-1，6-二磷酸酶、葡萄糖激酶(GK)的活性；檢測肝臟組織中G-6-Pase、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)蛋白的表達。結(jié)果與模型組比較，給予高劑量(1.4 g/kg)TSMP能降低T2DM大鼠IRI、FBG、HbA1c、IL-1β、TNF-α、FFA、Leptin水平，升高肝糖原水平，提高PK、HK、GK的活性，降低G-6-Pase、果糖-1，6-二磷酸酶的活性，并下調(diào)肝臟組織中G-6-Pase、PEPCK蛋白表達水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論TSMP可以改善T2DM大鼠的糖代謝紊亂，可能與其促進葡萄糖的利用，減輕炎性反應(yīng)和改善胰島素抵抗有關(guān)。

R285.5

A

1671-8348(2017)29-4033-03

2017-03-18

2017-06-16)