魏田力，鄭文芝，麻粉蓮，姚立紅，陳愛珺，崔紅，鄭麗舒

1.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京友誼醫(yī)院兒科，北京 100050；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

呼吸道感染住院患兒Merkel細(xì)胞多瘤病毒檢測(cè)及臨床研究

魏田力1，鄭文芝2，麻粉蓮2，姚立紅2，陳愛珺2，崔紅1，鄭麗舒2

1.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京友誼醫(yī)院兒科，北京 100050；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

目的：了解北京地區(qū)Merkel細(xì)胞多瘤病毒（MCPyV）在呼吸道感染住院兒童中的流行情況和臨床特點(diǎn)。方法：采集北京友誼醫(yī)院兒科呼吸道感染住院患兒的鼻咽抽吸物樣本200份，并收集相應(yīng)的患兒臨床資料，采用Taq?Man real-time PCR方法檢測(cè)MCPyV LTAg基因，并經(jīng)測(cè)序確認(rèn)；MCPyV陽(yáng)性樣本同時(shí)檢測(cè)常見的人呼吸道病毒混合感染情況。結(jié)果：200份標(biāo)本中共檢出MCPyV陽(yáng)性6例，檢出率3％；感染兒童年齡從6月到5歲，其中年齡≤3歲的占83.3％（5/6）。診斷包括支氣管肺炎和急性支氣管炎，臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱、咳嗽、喘息。6例陽(yáng)性樣本均與其他呼吸道病毒混合感染，A型流感病毒和呼吸道合胞病毒混合感染最常見，6例陽(yáng)性樣本MCPyV載量均低于10拷貝/μL。結(jié)論：real-time PCR方法檢測(cè)呼吸道感染住院患兒中MCPyV的感染率為3％，6例MCPyV陽(yáng)性樣本均與其他呼吸道病毒混合感染且MCPyV載量較低，不能認(rèn)為MCPyV是兒童呼吸道感染的病因。

Merkel細(xì)胞多瘤病毒；TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR；呼吸道感染

人多瘤病毒（huamn polyomavirus，HPyV）為閉合環(huán)狀雙鏈DNA病毒，因其能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種腫瘤而得名，包括1971年發(fā)現(xiàn)的BKPyV、JCPyV,以及2007年以來發(fā)現(xiàn)的WUPyV、KIPyV、MCPyV、TSPyV、HPyV6、HPyV7、HPyV9、HPyV10、STLPyV、HPyV12和NJPyV等[1]，不同的多瘤病毒感染不同的靶器官并導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)及消化系統(tǒng)等疾病[2]。Merkel細(xì)胞癌（Merkel cell carcinoma，MCC）是一種罕見的、侵襲性的神經(jīng)內(nèi)分泌來源的皮膚腫瘤，主要發(fā)生于老年人和免疫缺陷病人。2008年，F(xiàn)eng等應(yīng)用數(shù)字轉(zhuǎn)錄消減技術(shù)，在MCC組織中檢測(cè)到Merkel細(xì)胞多瘤病毒（Merkel cell polyomavirus，MCPyV），并證明MCPyV與MCC相關(guān)[3]。 隨后，在各種樣本中均檢出MVPyV的基因片段，包括皮膚、呼吸道分泌物、腸道和腫瘤組織，在免疫抑制病人的血液中也存在[4-7]。雖然對(duì)MCPyV的分子生物學(xué)特征已有所了解，但是其與宿主之間的相互影響還不是很清楚，需要研究更多的關(guān)于人多瘤病毒的生物學(xué)和流行病學(xué)資料。TaqMan探針實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法有較好的靈敏度和特異性，可以直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量，且操作簡(jiǎn)單自動(dòng)化程度高。本研究建立了MVPyV LTAg基因的核酸Taq?Man探針實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)200份呼吸道感染住院兒童的鼻咽抽吸物樣本進(jìn)行了檢測(cè)和MCPyV的流行病學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 采樣對(duì)象

2014年1～4月于北京友誼醫(yī)院兒科采集200例[男112例，女88例，性別比例1.44∶1，中間年齡為24個(gè)月（3d～14歲）]14歲以下呼吸道感染住院患兒的鼻咽抽吸物（NPA）樣本200份，并收集相應(yīng)的患兒臨床資料，所有收集的樣本經(jīng)過患兒父母的知情同意。NPA樣本采集后送到中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 檢測(cè)方法的建立與評(píng)價(jià)

1.2.1 核酸提取 常規(guī)處理收集的NPA樣本，用QIAamp MinElute Virus Spin Kit提取200份NPA中的病毒總核酸。

1.2.2 TaqMan real-time PCR方法的建立 利用在線軟件（http://sg.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/）設(shè)計(jì)引物和探針，McPyV LTAg為靶基因。上游引物為McPyV-F（5′-TCTGGGTAT GGGTCCTTCTC-3′），下游引物為 McPyV-R（5′-C ATGGTGTTCGGGAGGTATATC-3′），熒光探針為McPyV-P（FAM-ACTGGGAGTCTGAAGCCTGGGATAMRA），擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為79bp。GenBank BLAST評(píng)價(jià)引物和探針的特異性。引物和探針均由Invitrogen公司合成。采用ABI公司的熒光定量檢測(cè)試劑盒（TaqMan Gene Expression）進(jìn)行擴(kuò)增，20μL 反應(yīng)體系包括 2×TaqMan Gene Expres?sion Master Mix 10μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各 1.8μL，探針（10 pmol/μL）0.2μL，模板2μL，無 RNA 酶雙蒸水 4.2μL。反應(yīng)條件：50℃2min，95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀型號(hào)為MX3005P（Agilent Stratagene）。

1.2.3 TaqMan real-time PCR方法的靈敏性、特異性和可重復(fù)性評(píng)價(jià) 反應(yīng)產(chǎn)物與pMD18-T載體連接為pMD18-T/MC，提取質(zhì)粒測(cè)序正確后測(cè)定質(zhì)粒濃度，計(jì)算拷貝數(shù)。1/10梯度稀釋質(zhì)粒pMD18-T/MC，分別以 1010～100拷貝/μL 為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)方法的靈敏性。將本科室保存的其他多瘤病毒（HPyV6、WUPyV、KIPyV、JCPyV）陽(yáng)性核酸樣本作為待檢樣本，用MCPyV的引物探針在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陰性（無RNA酶雙蒸水）和陽(yáng)性（pMD18-T/MC質(zhì)粒）對(duì)照，評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的特異性。用5個(gè)濃度（107～103拷貝/μL）的pMD18-T/MC質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)濃度重復(fù)4次，分別計(jì)算Ct值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)（CV），評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的可重復(fù)性。

1.3 臨床樣本NPA的檢測(cè)和流行病學(xué)分析

用上述建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)200份NPA樣本核酸，對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行測(cè)序鑒定。用普通PCR方法檢測(cè)確認(rèn)的MCPyV陽(yáng)性樣本與常見呼吸道病毒如呼吸道合胞病毒（RSV），人 偏 肺 病 毒（HMPV），人 博 卡 病 毒（HBoV），流感病毒（Flu）A、B、C，副流感病毒1～4（PIV1～4），人 冠 狀 病 毒（HCoV-229E、HCoVOC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1）的共感染性，以及與WUPyV和KIPyV的共感染情況[8]。對(duì)收集的臨床資料進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 TaqMan real-time PCR方法的靈敏性、特異性和可重復(fù)性分析

以不同濃度梯度的質(zhì)粒pMD18-T/MC為模板進(jìn)行real-time PCR，獲得擴(kuò)增曲線，檢測(cè)靈敏度為 1 拷貝/μL，檢測(cè)線性范圍為 1010～100拷貝/μL，陰性對(duì)照無擴(kuò)增信號(hào)（圖1A）；標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.997，表明線性關(guān)系較好（圖1B）。用建立的方法對(duì)本科室保存的其他多瘤病毒（HPyV6、WUPyV、KIPyV、JCPyV）陽(yáng)性樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅陽(yáng)性對(duì)照pMD18-T/MC質(zhì)粒出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他樣本及陰性對(duì)照均未出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線（圖2），表明本方法具有較好的核酸擴(kuò)增特異性。對(duì)5個(gè)不同濃度梯度（107～103拷貝/μL）的pMD18-T/MC質(zhì)粒模板重復(fù)擴(kuò)增檢測(cè)4次，Ct值變異系數(shù)均小于1.5％，證明該方法穩(wěn)定性和可重復(fù)性較好（表1）。

圖1 MCPyV TaqMan real-time檢測(cè)的靈敏性分析和標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 NPA樣本的MCPyV檢測(cè)和流行病學(xué)分析

200份NPA樣本共檢出MCPyV陽(yáng)性樣本6例（3％），包括2名男性患兒（2/112，1.8％）和4名女性患兒（4/88，4.5％），感染兒童年齡從6個(gè)月到5歲，大部分為嬰幼兒，年齡≤3歲的占83.3％（5/6）。陽(yáng)性嬰幼兒主要診斷為支氣管肺炎和急性支氣管炎，癥狀包括發(fā)熱、咳嗽、喘息。6例MCPyV陽(yáng)性樣本在NPA中的病毒載量均小于10拷貝/μL，結(jié)果見表2。

2.3 MCPyV陽(yáng)性樣本與其他呼吸道病毒混合感染情況

6例MCPyV陽(yáng)性樣本均與其他呼吸道病毒混合感染，混合感染率為100％。其中A型流感病毒和RSV是最常見的混合感染，混合感染率分別為66.7％（4/6）和50％（3/6）。在混合感染中，最常見兩重混合感染，占50％（3/6），三重和四重混合感染分別為33.3％（2/6）、16.7％（1/6），結(jié)果見表3。

圖2 MCPyV TaqMan real-time檢測(cè)的特異性

表1 MCPyV TaqMan探針實(shí)時(shí)定量PCR方法可重復(fù)性分析

3 討論

多瘤病毒科的病毒是感染人類的最小病毒之一，基因組長(zhǎng)度和粒徑大小均相似，直徑40～45nm，無包膜的二十面體病毒粒子包括5000bp大小的環(huán)形雙鏈DNA基因組。基因組分為3個(gè)區(qū)域，即非編碼控制區(qū)（NCCR），編碼大T和小T抗原的早期基因和編碼衣殼蛋白VP1、VP2、VP3的晚期基因[9]。目前，HPyV家族有13個(gè)成員，包括1971年分離到的BKPyV和JCPyV，以及2007年以來檢測(cè)到的KIPyV、WUPyV等11種人多瘤病毒。發(fā)現(xiàn)WUPyV和KIPyV以來，世界各地的呼吸道樣本中都檢測(cè)到病毒序列，表明這2種病毒在呼吸道疾病人群中廣泛傳播[10]。人多瘤病毒中只有2種與人類特異性疾病相關(guān)：MCPyV與MCC相關(guān)[3]，MCC為罕見的皮膚病，在老年人和免疫抑制人群中常見；TSPyV與罕見的免疫缺陷病人的濾泡性皮膚病trichodysplasia spinulosa相關(guān)[11]。因?yàn)槎嗔霾《緮?shù)量在增加，因此其在疾病中的作用受到廣泛關(guān)注。

血清學(xué)研究表明，非MCC的健康成人MCPyV血清抗體陽(yáng)性率為88％和57.9％，小于10歲的兒童MCPyV血清抗體陽(yáng)性率為25％[12-13]，表明兒童期就已暴露于MCPyV。由于很多HPyV的初次感染發(fā)生在嬰幼兒時(shí)期，作為探討MCPyV對(duì)呼吸道致病性的第一步，我們用基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測(cè)了呼吸道感染住院兒童NPA中的MCPyV感染情況。住院患兒200份NPA的MCPyV檢測(cè)率為3％，與另外2項(xiàng)NPA中的檢測(cè)結(jié)果類似（3/140，2.1％[14]；27/635，4.25％[15]），但低于意大利研究者對(duì)下呼吸道感染住院病人的呼吸道樣本的檢出率（15/87，17.24％）[16]。本研究顯示MCPyV主要在3歲以內(nèi)的兒童中檢出，最常見的癥狀是咳嗽和發(fā)熱。6名MCPyV陽(yáng)性患兒均與其他常見的呼吸道病毒共感染,A型流感病毒和RSV最常見。其中2名MCPyV感染兒童與另一種呼吸道感染較為常見的多瘤病毒W(wǎng)UPyV共感染。在本研究中，MCPyV的病毒載量較低，均低于10拷貝/μL，且均與其他呼吸道病毒共感染，還不能表明MCPyV的是住院兒童呼吸道感染的病因。雖然不能肯定MCPyV是通過呼吸道傳播，但間接表明呼吸道是其可能的傳播途徑。關(guān)于MCPyV可能的分泌和傳播途徑，最近的研究表明環(huán)境樣本（門把手、自動(dòng)售票機(jī)）中75％能檢測(cè)到病毒DNA。用DNA酶處理后進(jìn)行病毒載量檢測(cè)，5％的MCPyV DNA被保護(hù)，可導(dǎo)致MCPyV潛在感染[17]。此外，TSPyV、HPyV6、HPyV7和MCPyV在健康人的皮膚上可被檢出，在采集呼吸道樣本時(shí)要防止樣本污染。

盡管MCPyV在NPA的檢出率較低為3％，但本研究表明了其有可能的傳播模式。核酸擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展導(dǎo)致了病毒發(fā)現(xiàn)的革命性改變，在過去的幾年中發(fā)現(xiàn)了多種新的多瘤病毒，這一趨勢(shì)在未來幾年內(nèi)是否會(huì)延續(xù)尚待分曉，這些新發(fā)現(xiàn)的多瘤病毒對(duì)人的致病性也需要進(jìn)一步的研究。

表2 MCPyV陽(yáng)性呼吸道感染兒童的臨床特點(diǎn)

表3 MCPyV與其他常見呼吸道病毒混合感染情況

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Clinical Study and Detection of Merkel Cell Polyomavirus in Hospitalized Children with Respiratory Tract Infection

WEI Tian-Li1,ZHENG Wen-Zhi2,MA Fen-Lian2,YAO Li-Hong2,CHEN Ai-Jun2,CUI Hong1*,ZHENG Li-Shu2*
1.Department of Pediatrics,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050;2.National Institute for Viral Disease Control and Prevention,China CDC,Beijing 100052;China
*Co-corresponding authors,ZHENG Li-Shu,E-mail:zhenglishu2000@sina.com;CUI Hong,E-mail:cuihong100@sina.com

Objective:To investigate the prevalence and clinical features of Merkel cell polyomavirus（MCPyV）in hospitalized children with respiratory tract infection（RTI） in Beijing.Methods:A total of 200 nasopharyngeal aspirates（NPA） were collected from hospitalized children with RTI in Beijing Friendship Hospital.LTAg gene of MCPyV was detected with an established TaqMan real-time PCR and confirmed by sequencing.All the MCPyV-positive specimens were screened for other common respiratory viruses.Results:The prevalence of MCPyV was 3％（6/200）,the infected children ranged in age from 6 month to 5 years and children ≤3 years of age accounted for 83.3％（5/6） of cases.6 MCPyV-positive patients were diagnosed with bronchopneumonia and acute bronchitis.The most common symptoms were cough,fever and asthma.All 6 MCPyV-positive patients were coinfected with other respiratory viruses,of which influenza virus A and respiratory syncytial virus were most common.Additional?ly,their viral loads were lower than 10 copies/μL NPA specimen.Conclusion:The prevalence of MCPyV was 3％in NPA specimens from hospitalized children with RTI,measured by real-time PCR.Regarding the 100％coin?fection rate and the low viral load,MCPyV is not considered to be the cause of respiratory diseases.

Merkel cell polyomavirus（MCPyV）;TaqMan real-time PCR;respiratory infection

R373;Q78

A

1009-0002（2017）04-0510-05

2017-02-11

魏田力（1973- ），女，主治醫(yī)師，（E-mail）denysu2003@163.com

鄭麗舒，（E-mail）zhenglishu2000@sina.com；崔紅，（E-mail）cuihong100@sina.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.021