張文寧，王芃，周建光，王健，秦崇濤，李宗，李山虎

1.福建中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京100850；3.福建省食品藥品認(rèn)證審評(píng)中心，福建 福州 350003

人4型腺病毒拷貝數(shù)SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法的建立

張文寧1，王芃2，周建光2，王健2，秦崇濤1，李宗3，李山虎2

1.福建中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京100850；3.福建省食品藥品認(rèn)證審評(píng)中心，福建 福州 350003

目的：建立檢測人4型腺病毒拷貝數(shù)的熒光定量PCR方法。方法：提取本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的4型腺病毒全基因組質(zhì)粒，以梯度稀釋質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)模板，選取人4型腺病毒六鄰體區(qū)域基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，進(jìn)行SYBR GreenⅠ熒光定量PCR擴(kuò)增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-4.284x+53.468，由全基因組質(zhì)粒所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，擴(kuò)增反應(yīng)Ct值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系（R2=0.999 609），檢出敏感度可達(dá)1×102拷貝/μL，且與其他幾種腺病毒無交叉反應(yīng)。用該方法檢測4型腺病毒感染細(xì)胞2、12和24h后的病毒拷貝數(shù)，其病毒拷貝數(shù)隨時(shí)間增加，與細(xì)胞病變（CPE）變化保持一致，且熒光定量PCR的測量結(jié)果穩(wěn)定（變異系數(shù)＜6％）。結(jié)論：建立了檢測人4型腺病毒基因拷貝數(shù)的熒光定量RT-PCR方法，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)。

人4型腺病毒拷貝數(shù)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；標(biāo)準(zhǔn)曲線

人腺病毒（human adenovirus，HAdV）是一種無包膜的DNA雙鏈病毒，最早于1953年從小兒扁桃體中分離得到[1-2]，主要在細(xì)胞核內(nèi)繁殖，常引起人上呼吸道和眼部上皮細(xì)胞感染。根據(jù)其不同的免疫學(xué)、生物和生化特性，可分為A～G共7個(gè)亞群，國際病毒分類委員會(huì)（ICTV）已公布了57種血清型[3]。腺病毒近年來作為腫瘤基因治療和疫苗載體，有較為廣泛的應(yīng)用[4]。

目前應(yīng)用最多的腺病毒載體是人血清五型腺病毒（Ad5）載體，它是當(dāng)前腫瘤和人類免疫缺陷病毒（HIV）疫苗臨床研究的主要病毒載體，但人群中普遍存在的Ad5的預(yù)存免疫[5]極大地降低了其使用中的效價(jià)。4型腺病毒（Ad4）是美軍基層官兵訓(xùn)練重癥呼吸道疾病的重要病原體之一，鑒于此，1971～1996年，美國國防部聯(lián)合國家衛(wèi)生署和Wyeth公司開發(fā)了口服Ad4疫苗，經(jīng)胃腸給藥途徑可以激發(fā)受試者血清抗體，多年接種結(jié)果證實(shí)該疫苗是安全的，沒有觀察到病毒間的交叉反應(yīng)，而且該疫苗項(xiàng)目的接種實(shí)施在軍隊(duì)中顯著降低了腺病毒的致病和死亡人數(shù)。對(duì)Ad4的疫苗株和原型株的基因組測序、生物信息學(xué)分析和比對(duì)已經(jīng)完成[6-8]。因此，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了人Ad4載體，期望發(fā)展為一種更有潛質(zhì)的疫苗載體。

在腺病毒的研發(fā)、應(yīng)用和批量生產(chǎn)過程中，一個(gè)十分重要的步驟是測定病毒的滴度?，F(xiàn)有測定腺病毒滴度的方法有細(xì)胞病變TCID50法[9]、殼蛋白免疫法[10-11]、分光光度計(jì)檢測法和熒光定量PCR[12]法。其中細(xì)胞病變TCID50和腺病毒殼蛋白免疫法均可較為直觀地反映腺病毒的感染能力，但缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)周期太長，尤其是細(xì)胞病變TCID50法所需時(shí)間最長，可達(dá)10～14d，且主要依靠觀察鏡下細(xì)胞形態(tài)來判定細(xì)胞病變，主觀因素較大，使得在絕多數(shù)情況下實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差。殼蛋白免疫法雖然在時(shí)間上已大大縮短，但仍需要2～3d，雖可嚴(yán)格區(qū)分病變與非病變細(xì)胞，但對(duì)于一些尚無商品化抗體的病毒還須自行制備抗體，且其實(shí)驗(yàn)步驟較為繁瑣，實(shí)驗(yàn)條件相對(duì)苛刻，如抗體孵育濃度及時(shí)間均需要一定的探索，對(duì)實(shí)驗(yàn)者本身的實(shí)驗(yàn)技巧也有一定要求。分光光度計(jì)檢測法雖然使用便捷，單次測量耗時(shí)短，但由于大多數(shù)分光光度計(jì)在0.1以下時(shí)讀數(shù)不準(zhǔn)確，因此使用前須大批量制備腺病毒并用氯化銫純化，對(duì)病毒濃度要求高，且包含缺陷性顆粒，其數(shù)量與病毒載體的結(jié)構(gòu)、病毒擴(kuò)增的操作過程等諸多因素有關(guān)，并無固定比例，導(dǎo)致分光光度計(jì)法測得的結(jié)果與病毒的實(shí)際感染力無明顯相關(guān)性，不能真實(shí)反映腺病毒的實(shí)際感染力。熒光定量PCR法所需時(shí)間最短，步驟也較為簡便，同時(shí)重復(fù)性也比較良好，適用范圍最廣。

在本研究中，我們以本課題組構(gòu)建的包含人Ad4完整基因組的大質(zhì)粒pMD-AD4為模板，構(gòu)建了SYBR GreenⅠ熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此為依據(jù)檢測了Ad4感染細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的病毒拷貝數(shù)變化，為Ad4載體的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人 Ad4（HAdV-4株）購自 ATCC；大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD-Ad4全基因組序列質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；A549細(xì)胞購自ATCC，由本實(shí)驗(yàn)室凍存；病毒核酸提取試劑盒、Easy dilution buffer由寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)；Real-time PCR Master Mix由東洋紡（上海）生物科技有限公司生產(chǎn)；質(zhì)粒小提試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；Taq酶產(chǎn)自上海申能博彩生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）購自浙江天杭科技股份有限公司；DMEM產(chǎn)自Sigma公司；臺(tái)式高速離心機(jī)為Eppendorf公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；超微量分光光度計(jì)為Nano Drop公司產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)PCR引物RTHEXONsense（5'CCACAAGTTGGAAATGACAG3'）和RT-HEXONanti（5'GCGAATGAACCATAACAGG3'），由賽百盛公司合成，目的片段為150bp。

1.3 病毒培養(yǎng)與病毒DNA提取

復(fù)蘇液氮中凍存的A549細(xì)胞，待融合度至70％～90％時(shí)傳代至4個(gè)60mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后棄去含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，用PBS沖洗，換含2％FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每皿接種人Ad4病毒原液500μL，感染吸附2h后棄去病毒液，用PBS沖洗未吸附的病毒，換含2％FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別取感染2、12、24h的細(xì)胞，-80℃/37℃交替凍融3次收取培養(yǎng)液，將凍融病毒液通過Millipore 0.22μm微孔濾膜過濾器過濾除菌，得到病毒液。凍融前在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）并拍照。取200μL病毒液，用病毒核酸提取試劑盒提取腺病毒DNA，用作熒光定量PCR反應(yīng)的檢測模板。

1.4 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

提取包含人Ad4全基因組的pMD-Ad4質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品制備的模板，用微量分光光度計(jì)測得質(zhì)粒濃度，參照下式計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)[13]：

根據(jù)計(jì)算結(jié)果，將質(zhì)粒用Easy dilution buffer分別稀釋至 1×108、1×107、1×106、1×105、1×104拷貝/μL，作為標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 建立SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法

1.5.1 擴(kuò)增條件 采用Real-time PCR Master Mix試劑盒，用CFX Connect熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，熒光染料的發(fā)光強(qiáng)度在反應(yīng)過程中自動(dòng)采集，反應(yīng)結(jié)束后機(jī)器自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以pMD-Ad4質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR反應(yīng)體系（模板、混合體系、引物和水）、反應(yīng)條件（變性、退火、延伸的溫度及循環(huán)次數(shù)）進(jìn)行優(yōu)化，選取Ct最小值、熒光最高值、溶解曲線顯示只有特異峰最佳的PCR反應(yīng)條件。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 1/10梯度稀釋pMD-Ad4質(zhì)粒，獲得濃度為 1×108～1×104拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)模板，采用優(yōu)化的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果用SPSS22.0中的曲線擬合，以Ct值為縱坐標(biāo)、起始模板濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 特異性試驗(yàn) 采用已建立的SYBR GreenⅠ方法，分別以 Ad3、Ad7、Ad14及無 RNase的ddH2O為模板進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該方法是否具有特異性。

1.5.4 靈敏性試驗(yàn) 以 1×106～1×100拷貝/μL 的系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品為模板，同時(shí)設(shè)置以等量無RNase的ddH2O代替模板的陰性對(duì)照進(jìn)行SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)模板濃度做3個(gè)重復(fù)。

1.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) ①批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：分別取等量的 3份不同拷貝（1×106、1×105和 1×104拷貝/μL）的質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR檢測，每份樣品做3個(gè)重復(fù)；②批間重復(fù)性試驗(yàn)：取以上3份樣品，在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行3次獨(dú)立的熒光定量PCR檢測。驗(yàn)證該熒光定量PCR方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

1.5.6 活病毒樣本檢測 應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)建立的人Ad4 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)A549細(xì)胞感染后2、12、24h的病毒DNA拷貝數(shù)進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過對(duì)SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了最佳反應(yīng)體系，獲得了最佳循環(huán)參數(shù)：①反應(yīng)體系：2×混合液10μL，上、下游引物各 500 nmol/L，樣本 1μL，去離子水補(bǔ)至總體積為20μL；②反應(yīng)條件：95℃ 3min預(yù)變性；95℃ 5s，55℃ 10s，72℃ 15s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 5s，65℃ 5s，95℃ 15s；③ 熔 解 曲 線 ：95℃ 5s，60℃ 1min，95℃，1個(gè)循環(huán)，退火延伸時(shí)檢測熒光信號(hào)。

如圖1，擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值為81.5～82℃，標(biāo)準(zhǔn)樣品均出現(xiàn)了單一波峰，陰性對(duì)照未見熔點(diǎn)峰，表明該實(shí)驗(yàn)中SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)為特異性擴(kuò)增。

1/10梯度稀釋pMD-Ad4質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的熒光定量曲線見圖2，由左至右分別為 1×108、1×107、1×106、1×105、1×104拷貝/μL，最下面一條線是 PCR級(jí)水做的陰性對(duì)照。1×108～1×104拷貝/μL pMD-Ad4質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的變化趨勢與此相同，只是曲線抬頭的位置（Ct值）依濃度降低而依次錯(cuò)后3～4個(gè)循環(huán)，顯示為一組斜率相同、間距相等的平行曲線，說明各反應(yīng)組的擴(kuò)增效率相近，且Ct值在不同稀釋率組間呈等差遞減關(guān)系。

為了獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，將以1/10梯度稀釋的pMD-Ad4質(zhì)粒為模板的熒光定量PCR反應(yīng)重復(fù)3次，用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，以所得Ct平均值為縱坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行曲線擬合，求得回歸方程（表1，圖3），得出拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值與Ct值間的線性關(guān)系表達(dá)式為y=-4.284x+53.468，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 609。這說明在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有非常好的線性關(guān)系。

2.2 特異性試驗(yàn)

用建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì) Ad4、Ad7、Ad14及無 RNase的 ddH2O 進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性，而Ad4有良好的擴(kuò)增（圖4），說明其具有較好的特異性。

圖1 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量的熔解曲線

圖2 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量曲線

表1 標(biāo)準(zhǔn)樣品擴(kuò)增的Ct值

2.3 靈敏性和重復(fù)性檢測

圖3 Ct值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量特異性擴(kuò)增曲線

圖5 熒光定量PCR的靈敏性測定

將標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒做1/10梯度稀釋，至無熒光信號(hào)出現(xiàn)，以此計(jì)算熒光定量PCR儀所能檢出的最低模板拷貝數(shù)為 102拷貝/μL（圖5）。同時(shí)，與常規(guī)PCR檢測結(jié)果進(jìn)行了比較。常規(guī)PCR最佳反應(yīng)條件為95℃ 3min預(yù)變性，95℃ 5s，55℃10s，72℃ 15s。常規(guī)PCR所能檢出的最低模板拷貝數(shù)為103拷貝/μL（圖6），表明熒光定量PCR靈敏度比常規(guī)PCR高10倍左右。

批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表2，批內(nèi)變異系數(shù)（CV）為0.43％～0.69％，批間CV為1.21％～2.09％，批內(nèi)、批間重復(fù)性均良好，擴(kuò)增效率穩(wěn)定。

2.4 應(yīng)用Real-time PCR檢測Ad4拷貝數(shù)

以提取的人Ad4基因組為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測量3次），并由得出的Ct值計(jì)算感染后2、12、24h的病毒DNA拷貝數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其病毒拷貝數(shù)隨時(shí)間增加與CPE變化保持一致，且熒光定量PCR的測量結(jié)果穩(wěn)定（CV＜6％）（表3，圖7）。

圖6 普通PCR的靈敏性測定

圖7 不同時(shí)間點(diǎn)鏡下細(xì)胞CPE狀態(tài)

表2 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR批內(nèi)與批間重復(fù)性試驗(yàn)

表3 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)人Ad4拷貝數(shù)

3 討論

構(gòu)建腺病毒DNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線是建立一個(gè)腺病毒基因組拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與Ct值的線性方程關(guān)系，依據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以簡便準(zhǔn)確地獲得腺病毒基因組的拷貝數(shù)。線性回歸方程中的相關(guān)系數(shù)R2是標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建是否成功的重要參數(shù)，也是衡量質(zhì)粒各梯度濃度之間擴(kuò)增效率是否一致的指標(biāo)，一般認(rèn)為R2＞0.995為相關(guān)性較好。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.999 609，且小組內(nèi)變異小于1％（低于一般默認(rèn)的6％），說明其穩(wěn)定性好，可用于后續(xù)的樣品測定。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)腺病毒基因組模板的制備純度有一定的要求。在實(shí)驗(yàn)中我們嘗試了2種提取腺病毒基因組的方法，即腺病毒基因組粗提法和病毒核酸試劑盒法分別提取基因組。粗體法即在病毒液中先直接加入蛋白酶K消化大部分病毒蛋白，再用乙醇沉淀方法獲得腺病毒DNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示粗提法制備的病毒DNA用于熒光定量PCR反應(yīng)的重復(fù)性較差，而病毒核酸試劑盒提取法重復(fù)性較好。分析原因可能在于粗提法中各類雜質(zhì)沒有去除完全，病毒DNA溶液中殘留的雜質(zhì)干擾了PCR的反應(yīng)結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其引物選取的是人Ad4六鄰體區(qū)域高變區(qū)的片段，所以目前建立的方法只適用于檢測人Ad4的基因組拷貝數(shù)，不能用于其他型別的腺病毒。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們擬腺病毒六鄰體的型別同源區(qū)DNA設(shè)計(jì)PCR引物，從而擴(kuò)大應(yīng)用范圍，期望建立一種適用于多種型別腺病毒拷貝數(shù)測定的熒光定量PCR檢測方法。

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Development of SYBR GreenⅠReal-Time PCR Assay for Human Adenovirus Type 4 Copy Number

ZHANG Wen-Ning1,WANG Peng2,ZHOU Jian-Guang2,WANG Jian2,QIN Chong-Tao1,LI Zong3*,LI Shan-Hu2*
1.College of Pharmacy,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;3.Fujian Food and Drug Certification Center,Fuzhou 350003;China
*Corresponding authors,LI Zong,E-mail:1730070412@qq.com;LI Shan-Hu,E-mail:lishanhu6@163.com

human adenovirus type 4（HAdV-4）copy number;real time quantitative PCR;standard curve

Q78

A

1009-0002（2017）04-0528-06

2017-04-07

國家科技重大專項(xiàng)（2014ZX09J14105-070）

張文寧（1990- ），男，碩士研究生，（E-mail）384179873@qq.com；王芃（1976- ），女，助理研究員，（E-mail）hellenhello@sina.com；二者為并列第一作者

李宗，（E-mail）1730070412@qq.com；李山虎，（E-mail）lishanhu6@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.025

[Abatract]Objective:To develop a method for detecting human adenovirus type 4（HAdV-4） copy number using real time quantitative PCR（RT-PCR）.Methods:The HAdV-4 whole genome plasmid was extracted and purified to 10 fold dilution series as the standard templates,primers were designed according to the hexon gene region.Then the standard curve for detecting HAdV-4 copy number was constructed.Results:The standard curve con?structed by HAdV-4 whole genome plasmid reflected amplification reaction Ct value in linear with the virus DNA copy number（linearity:R2=0.999 609）.This method was used to detect the virus DNA copy number of the cells infected with HAdV-4 at 2,12 and 24 hours of infection,it can be seen that the copy number increased over time,which was in consistent with cytopathic effect（CPE）,and finally the stable data were got.Conclusion:Thestandard curve for quantitative detection of HAdV-4 gene has been constructed by fluorescence quantitative RTPCR.It was sensitive and specific,accurate and reliable to detect HAdV-4 DNA copy number.