丁良，李芝香，汪慧淵，肖剛，郭青玉

西安交通大學(xué) 口腔醫(yī)院兒童牙病科，陜西 西安 710004

實(shí)時(shí)定量聚合酶螺旋反應(yīng)定量檢測變形鏈球菌方法的建立

丁良，李芝香，汪慧淵，肖剛，郭青玉

西安交通大學(xué) 口腔醫(yī)院兒童牙病科，陜西 西安 710004

目的：建立實(shí)時(shí)定量檢測口腔內(nèi)變形鏈球菌的實(shí)時(shí)定量聚合酶螺旋反應(yīng)（PSR）方法。方法：針對變形鏈球菌的gtfB基因設(shè)計(jì)4套引物，通過實(shí)時(shí)濁度法和顯色法兩種方法判斷結(jié)果。結(jié)果：從4套引物中篩選出最佳引物，并確定最佳溫度為65℃；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明采用最佳引物能特異性地檢測變形鏈球菌，與13種其他病原核酸無交叉反應(yīng)，敏感性達(dá)10拷貝/μL。結(jié)論：建立了實(shí)時(shí)定量檢測變形鏈球菌的PSR方法，該方法具有簡單快速、特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)，為實(shí)時(shí)定量檢測變形鏈球菌提供了新技術(shù)。

聚合酶螺旋反應(yīng)；變形鏈球菌；齲??；實(shí)時(shí)定量

變形鏈球菌（Streptococcus mutans）是口腔內(nèi)的主要致齲菌，具備黏附牙面的能力，在牙菌斑中產(chǎn)酸且耐酸，能使牙齒表面脫礦，進(jìn)而導(dǎo)致齲損[1]。嬰兒出生后，變形鏈球菌通過母親或攜帶者的唾液在其口腔內(nèi)定植，且定植時(shí)間越早，發(fā)生低齡兒童齲的概率越高[2]。檢測變形鏈球菌的傳統(tǒng)方法是培養(yǎng)法，將菌斑或唾液樣本在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)分離變形鏈球菌后計(jì)數(shù)。這種培養(yǎng)分離后計(jì)數(shù)的方法只能檢測活菌的數(shù)目，不能準(zhǔn)確反映樣品中細(xì)菌的總數(shù)目，而且計(jì)數(shù)結(jié)果受觀察人員主觀性影響較大[3]。除了培養(yǎng)法，其他常用的檢測和鑒定變形鏈球菌的方法有生化檢測法、免疫檢測法、DNA探針法和PCR法等[4]，但這些方法具有耗時(shí)長、不能定量的缺點(diǎn)。

2015年劉威等發(fā)明了聚合酶螺旋反應(yīng)（poly?merase spiral reaction，PSR）[5-6]這一新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法，它利用混合引物，采用Bst DNA聚合酶的鏈置換活性及其擴(kuò)增體系，通過引物結(jié)合、延伸、解鏈、單鏈旋轉(zhuǎn)、再次延伸的循環(huán)，達(dá)到等溫條件下擴(kuò)增核酸的目的。PSR兼具PCR法引物設(shè)計(jì)簡單和LAMP法只需一種酶、反應(yīng)高效的特點(diǎn)，首次實(shí)現(xiàn)了一對引物和一種酶在等溫環(huán)境下的核酸擴(kuò)增。為進(jìn)一步提高PSR法的反應(yīng)速率，引入了加速引物，通過添加加速引物可使反應(yīng)時(shí)間縮短到30min之內(nèi)，50min左右即可完成。在此，我們采用PSR法定量檢測變形鏈球菌。

1 材料和方法

1.1 材料

變形鏈球菌及其他對照樣本均來自本實(shí)驗(yàn)室。DNA恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒（日本榮研化學(xué)株式會社）；2×Tap MIX試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；Triton X-100（Amresco公司）；dNTP（Pharmacia公司）；NP-40（Fluka公司）；瓊脂糖（Amresco公司）；Chelex-100、甜菜堿（Sigma公司）；氯化錳、硫酸鎂、氯化鉀、氫氧化鈉、EDTA、硫酸銨（天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠）；實(shí)時(shí)濁度儀La-320C（日本榮研化學(xué)株式會社）；分光光度計(jì)（Amersham Biosciences公司）；Wealtec Dolphin-DOC凝膠成像系統(tǒng)（Wealtec公司）。

1.2 聚合酶螺旋反應(yīng)的擴(kuò)增原理

單一PCR引物（上游引物F及下游引物B）無法在Bst DNA聚合酶及其反應(yīng)體系中使靶序列得到恒溫?cái)U(kuò)增，而PSR在PCR引物的基礎(chǔ)上從靶序列上取一段序列N加到PCR引物（F和B）的5'端，構(gòu)成了2條復(fù)合引物Ft和Bt，其引物組成及其在靶序列上的結(jié)合位點(diǎn)如圖1所示，這2條引物也是PSR的主引物[7]。

PSR的體系中存在大量甜菜堿，達(dá)到反應(yīng)溫度時(shí)，甜菜堿會使DNA處于單雙鏈的動(dòng)態(tài)平衡，減少了酶的種類，相對提高了反應(yīng)穩(wěn)定性。

如圖2，以靶序列上一條單鏈為例（另一條單鏈擴(kuò)增機(jī)理相同），F(xiàn)t的F段能特異性識別靶序列上的Fc段并與之結(jié)合（①），并在Bst DNA聚合酶作用下向3'端缺口處延伸，形成②中的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，該雙鏈在甜菜堿作用下再次解鏈為游離的DNA單鏈，另一條主引物Bt的B段與其中一條單鏈的Bc段（另一條單鏈對后續(xù)反應(yīng)無意義不再考慮）結(jié)合并向3'端缺口延伸（③），生成的單鏈會再次斷開（④），而此時(shí)該單鏈上的Nc段與N段是反向互補(bǔ)的，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則Nc段會旋轉(zhuǎn)與N段結(jié)合，形成第一個(gè)勾形結(jié)構(gòu)，這是PSR的起始步驟，形成的3'端缺口會被Bst DNA聚合酶用堿基填補(bǔ)，繼續(xù)向3'端延伸（⑤），形成⑥的U形結(jié)構(gòu)，而此時(shí)引物Bt的B段再結(jié)合到該結(jié)構(gòu)的Bc段上，繞著U形結(jié)構(gòu)向3'端延伸，展開后生成⑦的DNA雙鏈，同樣該DNA雙鏈在甜菜堿存在的情況下解鏈成單鏈，單鏈的Nc段旋轉(zhuǎn)與N段互補(bǔ)結(jié)合，再次形成一個(gè)勾形結(jié)構(gòu)，并繼續(xù)向3'端缺口延伸，之后會反復(fù)重復(fù)引物結(jié)合、延伸、解鏈、單鏈旋轉(zhuǎn)、延伸的循環(huán)，最終會形成一系列分子大小不一的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，達(dá)到等溫條件下核酸擴(kuò)增的目的。

1.3 DNA模板的制備

用細(xì)菌基因組提取試劑盒制備基因組DNA，具體步驟詳見說明書。

1.4 PSR引物設(shè)計(jì)

對變形鏈球菌gtfB基因（GenBank：JX072978.1）進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定并設(shè)計(jì)4套PSR引物，F(xiàn)T、BT為主引物，IF、IB為加速引物，引物序列見表1。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

圖1 聚合酶螺旋反應(yīng)的引物組成及其在靶序列上的結(jié)合位點(diǎn)

1.5 PSR

25μL反應(yīng)混合物包括20mmol/L Tris-HCl（pH8.8）、10mmol/L KCl、10mmol/L（NH4）2SO4、0.1％Triton X-100、0.8 mol/L甜菜堿、8mmol/L MgSO4、1.4mmol/L dNTP、8 U Bst DNA 聚合酶、40 pmol FT和BT、20 pmol IB和IF。于65℃恒溫反應(yīng)60min左右，以雙蒸水為陰性對照。

圖2 聚合酶螺旋反應(yīng)起始過程（①～⑤）和循環(huán)過程（⑥～⑧）示意圖

表1 擴(kuò)增變形鏈球菌靶序列的4套PSR引物序列

1.6 PSR結(jié)果檢測

采用實(shí)時(shí)濁度儀檢測。PSR過程中發(fā)生以下反應(yīng)：

其中，Mg2P2O7為白色沉淀。依據(jù)這個(gè)原理，日本榮研化學(xué)株式會社開發(fā)出實(shí)時(shí)濁度儀LA-320C，每隔6s測定反應(yīng)管的濁度并繪制成曲線來判斷反應(yīng)的陰陽性。

2 結(jié)果

2.1 最佳引物篩選

用設(shè)計(jì)的4套引物對變形鏈球菌進(jìn)行PSR擴(kuò)增，最先發(fā)生PSR的引物組合為最佳引物。從圖3可見SM2引物組最先發(fā)生PSR，說明SM2引物組的擴(kuò)增效率最高，為最佳引物。

2.2 最佳溫度篩選

對最佳引物組合SM2進(jìn)行最佳溫度篩選，溫度從60～67℃，梯度為1℃，從圖4可見65℃時(shí)最先發(fā)生PSR，因此將最佳溫度定為65℃。

2.3 最佳引物的特異性實(shí)驗(yàn)

陰性對照以水為模板，陽性對照以變形鏈球菌基因組為模板，并以金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、鯊魚弧菌、嗜麥芽假單胞菌、腸出血性大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌、魯氏不動(dòng)桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌為對照檢測特異性。從圖5可見，只有陽性對照的曲線發(fā)生了上升，其他曲線均無變化，表明設(shè)計(jì)的引物SM2具有良好的特異性。

圖3 最佳引物篩選實(shí)驗(yàn)

2.4 最佳引物的敏感性實(shí)驗(yàn)及實(shí)時(shí)定量方法的建立

將SM2擴(kuò)增的靶序列人工導(dǎo)入質(zhì)粒pUC18，并在大腸桿菌BL21中大量表達(dá)，提純，定量，按1/10梯度稀釋制備成用于絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)品，用于敏感性及實(shí)時(shí)定量PSR，檢測結(jié)果見圖6。以濁度達(dá)到0.1所需時(shí)間計(jì)為Ct值，取拷貝數(shù)的對數(shù)與Ct值做曲線，求R2值，考察線性關(guān)系，結(jié)果見圖7，拷貝數(shù)的對數(shù)與時(shí)間呈線性關(guān)系，可以用來定量檢測變形鏈球菌。

3 討論

人的口腔中充滿細(xì)菌。在濕熱的條件下，會有700多種細(xì)菌在口腔中茁壯成長，其中的變形鏈球菌是牙斑的主要成分之一。變形鏈球菌一層一層地吸附在牙齒上，形成所謂的“生物膜”。它們消耗糖類，產(chǎn)生酸，腐蝕牙齒的釉層，造成牙洞。變形鏈球菌為革蘭陽性球菌，是口腔天然菌群中占比例最大的鏈球菌屬中的一種。反復(fù)研究證實(shí)，變形鏈球菌可以造成嚙齒類動(dòng)物和靈長類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性齲的動(dòng)物模型，表明該菌與人類齲病密切相關(guān)。牙菌斑中生存的變形鏈球菌能迅速發(fā)酵多種碳水化合物而產(chǎn)生多量酸，可使局部pH值下降至5.5以下。變形鏈球菌耐酸性強(qiáng)，在pH4.5的條件下仍能存活并產(chǎn)酸，局部pH值下降維持相當(dāng)長時(shí)間，避開唾液的緩沖作用，從而造成局部硬組織脫礦，齲病病變過程開始。變形鏈球菌能以蔗糖為底物合成胞外葡聚糖、果聚糖及胞內(nèi)多糖。葡聚糖介導(dǎo)細(xì)菌的黏附，促進(jìn)菌斑的形成，是變鏈鏈球菌重要的致齲毒力因子。該菌合成的水溶性葡聚糖、果聚糖、胞內(nèi)多糖還可作為代謝底物提供能量，增強(qiáng)致齲力。變形鏈球菌表面蛋白和脂磷壁酸是菌體表面黏結(jié)素，它們與獲得性膜中的不同受體結(jié)合，促進(jìn)該菌黏附和菌斑的形成。變形鏈球菌不僅是冠部齲病的主要致病菌，也是根部齲的主要致病菌。由此，變形鏈球菌成為研究的熱點(diǎn)。

圖4 最佳溫度篩選實(shí)驗(yàn)

圖5 最佳引物特異性實(shí)驗(yàn)

圖6 最佳引物敏感性濁度法實(shí)驗(yàn)

圖7 拷貝數(shù)的對數(shù)與時(shí)間的線性關(guān)系

近年，聚合酶螺旋反應(yīng)逐漸發(fā)展成熟，在現(xiàn)場診斷和檢測方面取得了很多成績，尤其是在檢驗(yàn)檢疫部門和衛(wèi)生醫(yī)療單位得到了充分應(yīng)用。PSR具備引物簡單、操作便捷、耗時(shí)短、靈敏度高、特異性強(qiáng)等一系列優(yōu)點(diǎn)，再加上恒溫條件，可以說無需專業(yè)操作人員也能實(shí)施現(xiàn)場檢測。本研究對PSR技術(shù)進(jìn)一步延伸，利用其定量的特點(diǎn)來檢測變形鏈球菌，可以為下一步實(shí)時(shí)檢測口腔內(nèi)變形鏈球菌的數(shù)量變化打下良好的基礎(chǔ)。

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Establishment of Quantitative Detection of Streptococcus mu?tans by Real-Time Quantitative PSR Method

DING Liang,LI Zhi-Xiang,WANG Hui-Yuan,XIAO Gang,GUO Qing-Yu*
Xi'an Jiaotong University Stomatological Hospital,Xi'an 710004,China
*Corresponding author,E-mail:guoqinyu@mail.xjtu.edu.cn

Objective:To establish the polymerase spiral reaction（PSR） real-time quantitative method for detec?tion of Streptococcus mutans in oral cavity.Methods:The 4 sets of primers for S.mutans gtfB genes were de?signed and subjected to the PSR to select the optimal set,and then the result was determined by the real-time turbidity method and chromogenic method.Results:The best primer from 4 sets of primers was selected out,and the best temperature was determined to be 65℃.The specificity was indicated by the further experiments showing that there was no cross reaction with 13 other pathogen nucleic acid with the best primers.The sensitivity is up to 10 copies/μL.Conclusion:We established the PSR method of real-time quantitative detection of S.mutans.This method has the characteristic of simpleness and quickness,strong specificity and high sensitivity,which pro?vides a new method for real-time quantitative detecting S.mutans.

polymerase spiral reaction;Streptococcus mutans;dental caries;real-time quantitative

Q78;R378

A

1009-0002（2017）04-0519-05

2016-12-19

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃（2015KTCL03-07）

丁良（1986- ），男，碩士研究生，（E-mail）guomuding@163.com

郭青玉，（E-mail）guoqinyu@mail.xjtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.023