呂 揚 張雅文 譚 磊 紀文亮 于 萍 毛蘭群* 周 方*

1(北京大學第三醫(yī)院, 北京100191)2(中國科學院化學研究所活體分析化學重點實驗室, 北京100190)

脊髓損傷模型中胞外抗壞血酸濃度的活體在線分析

呂 揚1張雅文1譚 磊1紀文亮2于 萍2毛蘭群*2周 方*1

1(北京大學第三醫(yī)院, 北京100191)2(中國科學院化學研究所活體分析化學重點實驗室, 北京100190)

利用活體微透析技術結合在線高選擇性抗壞血酸電化學檢測技術，以實驗性胸10節(jié)段脊髓鉗夾損傷為動物模型，研究了脊髓損傷過程中胞外抗壞血酸的變化規(guī)律。結果表明，微透析探針植入及鉗夾損傷瞬間，均存在脊髓抗壞血酸濃度高峰，隨后濃度回到穩(wěn)定水平，對照組大鼠脊髓細胞外液中抗壞血酸的平均基礎濃度為(26.17±1.25) μmol/L (n=8)。實驗組脊髓鉗夾損傷后，胞外抗壞血酸水平顯著增加，達到(53.24 ± 1.95) μmol/L(n=8)，這種顯著性升高可能與繼發(fā)性脊髓損傷保護機制導致胞內抗壞血酸外流相關。本研究結果為抗壞血酸參與調節(jié)繼發(fā)性脊髓損傷提供了直接的實驗證據(jù)。

抗壞血酸； 脊髓損傷； 活體微透析； 在線電化學檢測

2017-07-13收稿； 2017-09-13接受

本文系北京市科技計劃項目(新)(No.2144000021)資助

* E-mail: zhou.md@126.com; lqmao@iccas.ac.cn

1 引 言

急性脊髓損傷(SCI)是一種骨科常見疾病，通常發(fā)生在年輕人群中。在北美，每百萬人中就有39人患有急性SCI[1]。 SCI的治療一直是骨科研究重點之一。急性SCI的損害包括兩種機制，即原發(fā)性損傷(包括機械壓迫、出血、電解質從受損細胞中外溢等)和繼發(fā)性損傷(包括損傷后缺血、離子失衡、氨基酸興奮毒性、自由基氧化應激、炎癥介質等)。原發(fā)性損傷發(fā)生于損傷當時且不可逆轉，而繼發(fā)性損傷是細胞和分子水平的主動調節(jié)過程，其演變過程可達數(shù)天之久，具有可逆性且可能被控制[2]。

抗壞血酸(AA)作為重要的抗氧化劑和自由基清除劑之一，在SCI研究領域中越來越受到關注[3]。AA能中和在SCI中產生的活性氧(ROS)，并通過谷氨酸-AA異向交換減少谷氨酸的積累[4]。因此，作為SCI的神經保護劑，研究SCI中AA水平的變化顯得尤為重要。動態(tài)監(jiān)測脊髓中AA濃度對于研究AA抗氧化潛力和損傷后AA的其它可能作用機制至關重要。傳統(tǒng)的用于AA活體檢測的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[5,6]和活體微電極伏安法[7]，但由于AA容易化學氧化且SCI的原發(fā)性損傷時間短等特點，使得上述方法用于SCI中AA水平的檢測仍然存在不足。如HPLC方法由于時間分辨率較低，且在實驗過程中可能會導致AA的氧化，使測得的結果與真實數(shù)值不符。此外，盡管活體微電極伏安法可實時反映AA濃度變化，但AA產物在電極上沉積，電極靈敏度會隨著測定時間的延長而逐漸減低，并且電極的準確標定較為困難。近年來的研究[8,9]表明，利用碳納米管的電化學催化作用構建的檢測體系，可以有效實現(xiàn)AA在電極上的選擇性電化學氧化，避免了其它小分子物質的干擾; 該體系利用微透析技術濾過了大分子蛋白質等容易吸附于電極表面并影響電極穩(wěn)定性的物質，從而保證了檢測體系的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。同時，由于微透析樣品無須經過分離就直接進入電解池進行電化學檢測，所以具有良好的時間分辨率。將微透析技術與選擇性電化學檢測池結合發(fā)展起來的活體在線電化學檢測技術(Online electrochemical system, OECS)由于其高的時空分辨率、穩(wěn)定可靠的矯正和檢測方法，近年來受到了越來越多的關注[10]。

本研究利用活體微透析技術結合在線高選擇性AA電化學檢測技術，以SCI為動物模型，成功測定了SCI過程中胞外AA的動態(tài)變化規(guī)律，相關研究未見文獻報道。研究結果表明，急性SCI后，AA基礎濃度顯著增加，這為治療急性SCI的研究提供了有效的分析手段和理論依據(jù)。

2 實驗部分

2.1材料和試劑

抗壞血酸鈉(AA，美國Sigma公司)；人工腦脊液(aCSF)由1.2 mmol/L CaCl2、2.0 mmol/L Na2HPO4、1.0 mmol/L MgCl2、2.7 mmol/L KCl、145 mmol/L NaCl配制，調至pH=7. 4。單壁碳納米管(Single-walled carbon nanotubes， SWCNTs，深圳市納米科技有限公司)，使用前在2.6 mol/L HNO3溶液中回流5 h，經離心、重新分散、過濾、烘干, 備用。純化后的SWCNTs在真空下500℃加熱回流2 h。實驗用水為超純水(18.2 MΩ cm, Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司)。

2.2活體微透析-在線電化學檢測系統(tǒng)(OECS)

本研究采用的活體微透析-在線電化學檢測系統(tǒng)如圖1所示，主要包括薄層電化學池(BASCo)和微透析取樣兩部分。電化學檢測采用三電極體系：玻碳工作電極(GCE，直徑6 mm，Bioanalytical Systems Inc.(BAS),West Lafayette, IN)、Ag/AgCl參比電極和不銹鋼對電極。為了實現(xiàn)AA高選擇性測量，薄層電解池的玻碳電極首先在拋光布上分別用0.30和0.05 μm的Al2O3粉末懸浮液拋光，再于超純水中超聲處理10 min，氮氣吹干。將4 μL 2 mg/mL SWNTs的N,N二甲基甲酰胺的懸浮液滴在處理好的玻碳電極上，常溫揮發(fā)除去溶劑，制得SWCNT修飾電極，用于AA的高選擇性檢測。

將微透析探針(2 mm; BAS Carnegie Medicine)插入水合氯醛麻醉的大鼠脊髓后。用人工腦脊液以2 μL/min的流速連續(xù)灌注，通過微量注射泵(CMA/100; CMA Microdialysis AB，Stockholm，Sweden)驅動，將脊髓微透析液通過微透析導管直接遞送至薄層電化學流動池中，用于實時在線測量AA。

圖1 活體微透析-在線電化學檢測系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic illustration of experimental setup of online-electrochemical system (OCES) for continuously monitoring spinal cord ascorbate change in acute traumatic spinal cord injury (SCI) models

2.3動物實驗

健康雄性Sprague-Dawley大鼠(3月齡，重270～330 g)購于北京大學醫(yī)學部實驗動物中心。將大鼠分開飼養(yǎng)，隨意食用食物和水，并以12 h光/暗循環(huán)維持。實驗當日用水合氯醛(350 mg/kg腹膜內注射)將大鼠麻醉，術中用加熱墊維持體溫在37.8℃。從T8-T12打開大鼠的背部區(qū)域，暴露脊髓。將微透析探針在脊髓T10處插入背角中，用人工腦脊液進行60 min微透析平衡后接入檢測器進行分析。實驗過程中將大鼠分成對照組和損傷組(每組8只大鼠)。對照組后續(xù)未進行任何操作并保持透析至180 min; 對于損傷組，在T10的脊髓上進行鉗夾損傷[11]，隨后保持透析至180 min。

3 結果與討論

3.1抗壞血酸定量分析

圖2 在線電化學方法檢測不同濃度AA標準溶液的電流響應。插圖為濃度與電流值的線性關系，電極施加電位為+30 mV，參比電極為Ag/AgCl，流速2 μL/minFig.2 Current response recorded for ascorbic acid (AA) standard solutions in artificial cerebrospinal fluid (aCSF) with on-line electrochemical system. Inset is plot of current vs. AA concentration. The microdialysis probe was perfused with aCSF at flow rate of 2 μL/min. Working electrode is polarized at +30 mV(vs. Ag/AgCl electrode)

為了更好地研究動物模型中AA的變化規(guī)律，在進行SCI動物實驗之前，先用AA標準溶液進行定量分析。碳納米管具有優(yōu)良的電化學性質，其修飾的玻碳電極可用于選擇性檢測AA[8,9]，碳納米管側壁碳的性質類似于高溫熱解石墨電極的層狀碳， 其電化學性質不活潑。相反，碳納米管的端口碳的性質類似于高溫熱解石墨電極的邊緣碳，而且具有良好的電化學活性，能加快氧化還原物質的異相電子轉移[12,13]，利用層層組裝的技術制備的穩(wěn)定的碳納米管膜電極，有效實現(xiàn)了AA在電極上的選擇性電化學氧化。本研究制備了單壁碳納米管修飾的玻碳電極，以此作為工作電極，用于選擇性檢測AA。如圖2所示，分別將1、5、10、25、50和100 μmol/L AA溶液由微量注射器經微透析管路泵進薄層電解池內，可以測得明顯的電流梯度變化，電流強度與AA濃度呈良好的線性關系，線性方程為：y=8.058x-16.18(R2=0.9995)。表明本研究構建的在線電化學檢測系統(tǒng)可以用于生理狀態(tài)下的AA變化規(guī)律的研究。

圖3 (A)探針植入后，將人工腦脊液泵入薄層電解池，基線第一次回歸平穩(wěn)，然后鉗夾T10脊髓處制造急性損傷模型，基線再次回歸平穩(wěn)，較未損傷之前顯著升高。箭頭分別表示探針植入、AA水平、基礎值SCI、AA水平升高時間；(B) 對照組(方塊點線)和損傷組(圓點線)脊髓AA的變化 (n=8)，箭頭指示開始施加急性損傷的時間。急性SCI引起大鼠脊髓AA水平顯著性升高，而未損傷組脊髓AA水平無明顯變化(p< 0.05)Fig.3 (A) Typical current-time responses of ascorbate recorded in micro-dialysates continuously sampled from spinal cord in SCI group rats. Other conditions were the same as those in Fig.2. (B) Statistical results of spinal cord ascorbate levels in control group (cube line)and SCI group(dot line). The time interval for data acquisition is 10 min. Data were obtained from the results of 16 different rats, and represented as mean p<0.05 by unpaired t-test between the lesion group and the control group

3.2SCI過程中AA變化規(guī)律的研究

由連續(xù)實時測定AA的典型結果(圖3A)可知，本體系可以實現(xiàn)從探針植入到SCI全過程的實時檢測，其中，在探針插入和SCI造模過程中引起的尖峰是由于儀器在再次充電過程中引起的充電電容的衰減以及手術過程中引起的噪音導致的。為避免由此引起的實驗誤差，在插入微透析探針平衡60 min基線回歸穩(wěn)定后，再進行測量電流信號。經過線性回歸曲線矯正，測得麻醉大鼠脊髓(T10)處的細胞外液中AA的平均基礎水平為(26.17±1.25) μmol/L(n=8，圖3A)。在SCI發(fā)生時(圖3A)，損傷區(qū)域脊髓胞外AA濃度急劇升高，可能是由于神經細胞死亡后，細胞膜上通道蛋白質的失活或者細胞膜完整性破壞，細胞內儲存的高濃度AA會瞬間大量釋放到細胞間液，導致細胞外AA濃度明顯增加。隨后AA濃度緩慢下降，推測是由于壞死細胞內自由水的釋放以及損傷后血管壁通透性增加，組織間液增多，導致AA溶液被稀釋，濃度降低。隨后，AA濃度在60 min左右達到穩(wěn)定，測得實驗組脊髓基礎濃度變?yōu)?53.24±1.95) μmol/L (n=8)(圖3B)。基礎濃度的升高一方面可能是由于針對ROS的防御機制而引起的；另一方面，AA釋放可能與興奮性毒性谷氨酸的攝取有關。已知谷氨酸在SCI期間釋放和積累[14]，通過直接損傷神經元[15,16]和少突膠質細胞[17]，以及通過活性氧的產生導致神經毒性[18]。損傷還會觸發(fā)大量谷氨酸的釋放，而谷氨酸作為神經細胞內重要的興奮性神經遞質又進一步加重神經細胞去極化擴散和能量物質的消耗。這也進一步增加了神經細胞內AA向細胞間液的釋放，同時也觸發(fā)了“級聯(lián)放大”效應，即神經去極化與谷氨酸釋放互為因果，不斷惡性循環(huán)，逐漸加重。AA的增加可能是通過異交換轉運蛋白吸收細胞外谷氨酸[4]，由損傷誘導的AA釋放可促進從細胞外液吸收積聚的谷氨酸以防止其積累。除這兩種機制外，由于能量失效和三磷酸腺苷(ATP)在SCI發(fā)生初始階段耗盡所引起的缺氧去極化，神經細胞內的AA流出[19]，這也可能是導致細胞外AA增加的原因。因此，SCI期間細胞外AA的變化所提供的信息，不僅可用于理解SCI中的復雜神經化學過程，而且還可用于后期開發(fā)這種疾病的治療藥物。

4 結 論

利用活體微透析技術結合在線高選擇性AA電化學檢測技術，以SCI為動物模型，研究了SCI過程中胞外AA的變化規(guī)律。發(fā)現(xiàn)T10處SCI后，胞外AA水平顯著增加，這種顯著性升高可能與繼發(fā)性SCI保護機制導致胞內AA外流相關。本研究為AA參與調節(jié)繼發(fā)性SCI提供了直接的實驗證據(jù)。同時，本研究進一步證明活體在線微透析系統(tǒng)可以用于SCI模型中生理活性小分子變化規(guī)律的研究。

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This work was supported by the Beijing Science and Technology Project (New), China (No.2144000021).

ContinuouslyMonitoringofConcentrationofExtracellularAscorbicAcidinSpinalCordInjuryModel

LYU Yang1, ZHANG Ya-Wen1, TAN Lei1, JI Wen-Liang2, YU Ping2, MAO Lan-Qun*2, ZHOU Fang*1
1(PekingUniversityThirdHospital,Beijing100191,China)2(KeyLaboratoryofAnalyticalChemistryforLivingBiosystems,InstituteofChemistry,ChineseAcademyofSciences,Beijing100190,China)

Acute traumatic spinal cord injury (SCI) represents one of the most devastating injuries that afflict the human body. Ascorbic acid (AA) plays an important role in mammalian central nervous system, especially in SCI. In this study, the change of AA concentration after SCI was investigated by using an on-line electrochemical method integrated withinvivomicrodialysis. A microdialysis probe (2 mm in length) was implanted into the spinal cord of an anesthetized rat (Thoracic-10). Microdialysis perfusate (2 μL/min) was collected in the sample loop of an on-line injector for direct injection onto a glassy carbon electrode which was modified with the heat-treated single-walled carbon nanotubes (SWNTs). Normal ascorbic acid concentration in the extracellular fluids of spinal cords was (26.17 ± 1.25) μmol/L (n=8). The experimental spinal cord injury, induced by a lesion at T-10, significantly increased the extracellular ascorbic acid levels to (53.24±1.95) μmol/L (n=8). This study provides the experimental evidence on the essential roles of ascorbic acid in spinal cord injuries.

Ascorbic acid; Spinal cord injury;Invivomicrodialysis; On-line electrochemical detection

13 July 2017; accepted 13 September 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.171091