卓 維，陳 倩，魯黎明，李立芹

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130)

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1611-1619

卓維，陳倩，魯黎明，等．煙草NtCIPK2基因的克隆及表達(dá)分析[J]．浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29( 10) : 1597 - 1604．

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.01

2017-04-14

植物生理學(xué)與生物化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(SKLPPBKF 1505, SKLPPBKF 1506)

卓維(1994—)，女，重慶人，碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail: 992167898@qq.com

*通信作者，李立芹，E-mail: liliqin88@163.com

煙草NtCIPK2基因的克隆及表達(dá)分析

卓 維，陳 倩，魯黎明，李立芹*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130)

CIPK(CBL-interacting protein kinase)是一類具有生物活性的絲/蘇氨酸蛋白激酶，通過(guò)與類鈣調(diào)神經(jīng)素 B 亞基蛋白(Calcineurin B-like protein，CBL)相互作用從而調(diào)節(jié)植物在適應(yīng)或抵制非生物逆境脅迫中的生理活動(dòng)?；谕葱蛄锌寺煵軰326中NtCIPK2基因cDNA全長(zhǎng)，采用qRT-PCR分析NtCIPK2的組織及逆境脅迫下特異性表達(dá)。結(jié)果表明，該基因全長(zhǎng)1 341 bp，編碼446個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量為50.3 ku，等電點(diǎn)為8.90。同源性分析結(jié)果顯示，該蛋白與絨毛狀煙草(Nicotianatomentosiformis)CIPK2有95%的同源性，故命名為NtCIPK2。生物信息學(xué)分析表明，該蛋白是一個(gè)親水蛋白，其N端含有活化環(huán)結(jié)構(gòu)域S_TKc，C端含有調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域CIPK-C，可能定位在質(zhì)膜。組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，該基因在煙草根、莖、葉、花中均有表達(dá)，其中莖中表達(dá)量最高。逆境脅迫試驗(yàn)表明，該基因受低鉀、高鹽、干旱、H2O2和ABA誘導(dǎo)，參與煙草非生物逆境脅迫的響應(yīng)。

煙草；NtCIPK2；克隆；生物信息學(xué)；基因表達(dá)

煙草是我國(guó)重要的模式生物和經(jīng)濟(jì)作物，無(wú)論是在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，還是在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)方面，都發(fā)揮著重要的作用。低鉀、干旱、鹽堿、冷害等非生物脅迫嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量及品質(zhì)，尤其是低鉀脅迫影響為甚[1]?，F(xiàn)今在我國(guó)鉀素資源相對(duì)貧乏，煙葉中鉀含量也普遍偏低。所以如何提高煙葉中鉀含量及煙草的抗逆性成為當(dāng)前重要的研究方向。

Ca2+是植物體中普遍存在的第二信使，在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及脅迫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究表明，植物在受到逆境脅迫時(shí)，首先引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化[2]，改變的Ca2+濃度會(huì)被相應(yīng)的Ca2+感受器感知，并進(jìn)一步將信號(hào)傳遞至下游。類鈣調(diào)神經(jīng)素B亞基蛋白CBL是植物中一類特殊的鈣感受器，能識(shí)別不同的鈣信號(hào)。CIPK是一類植物中特有的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[3]。CBL與CIPK相互作用后能解除CIPK自抑制，形成CBL-CIPK復(fù)合體，活化狀態(tài)的復(fù)合體能磷酸化修飾下游靶蛋白，從而解碼鈣信號(hào)，并進(jìn)一步將信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞的生理反應(yīng)[4-5]。

CIPK蛋白激酶家族中每個(gè)成員的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中均含有一個(gè)保守的24個(gè)氨基酸組成的FISL基序(又稱NAF結(jié)構(gòu)域)，該基序是一個(gè)自抑制結(jié)構(gòu)域并介導(dǎo)與CBL的作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻中有27個(gè)，擬南芥中有26個(gè)，楊樹(shù)中有33個(gè)CIPK家族成員[7-8]。CIPK在植物響應(yīng)高鹽、低溫、高溫和低鉀信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。野大麥HbCIPK2在干旱、高鹽和ABA脅迫下表達(dá)增強(qiáng)[10]。玉米ZmCIPK2在高鹽、PEG、低溫和熱處理下被大量誘導(dǎo)上調(diào)[11]。煙草中NtCIPK23受到干旱、鹽脅迫誘導(dǎo)[12]。

本研究從普通煙草K326中克隆到一個(gè)NtCIPK2基因，利用生物信息學(xué)分析NtCIPK2蛋白的理化性質(zhì)、疏水性，并進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)以及同源性分析，同時(shí)運(yùn)用qRT-PCR研究其在煙草根、莖、葉、花組織中的表達(dá)水平，以及低鉀、高鹽、干旱、H2O2和ABA非生物逆境脅迫下該基因的表達(dá)水平，旨在為今后NtCIPK2的功能研究奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

本試驗(yàn)使用的植物材料為普通煙草K326。

大腸埃希菌感受態(tài)DH5α購(gòu)自Vazyme Biotech公司；目的基因的克隆及回收使用的Trizol試劑、載體PMD19-T、高保真Pfu酶，cDNA合成試劑盒，SYBR Green Master mix、限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit 2.0等試劑購(gòu)自TaKaRa，DNA凝膠純化回收試劑盒購(gòu)自天根公司；引物合成與測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料處理

首先挑選籽粒飽滿、大小一致的煙草種子進(jìn)行表面消毒，先用75%的乙醇消毒30 s，然后10%的次氯酸鈉溶液消毒2次，每次10 min，最后用無(wú)菌水反復(fù)清洗5～6次后播種于MS培養(yǎng)基上，置于16 h光/8 h暗，25 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d后，挑取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行低鉀、高鹽、干旱、H2O2和ABA處理，每個(gè)處理設(shè)有3盤(pán)重復(fù)，處理相應(yīng)時(shí)間(0、3、6、12、24 h)后進(jìn)行整株取樣。低鉀培養(yǎng)基是去掉MS培養(yǎng)基中的KNO3，并且用NH4H2PO4代替KH2PO4，濃度為10 μmol·L-1K+，其余成分相同。高鹽、干旱、H2O2和ABA處理培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基中分別加入NaCl(200 mmol·L-1)、PEG-6000(5%)、H2O2(10 mmol·L-1)和ABA(1 μmol·L-1)。

1.2.2 煙草NtCIPK2 基因的克隆

參考GenBank收錄的絨毛狀煙草CIPK2序列(XM_018779044.1)，采用同源克隆的方法，用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物NtCIPK2-F和NtCIPK2-R(表1)。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；35個(gè)循環(huán)。目的片段純化后與pMD19-T載體16 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)，隨后在含有氨芐青霉素(Ampicillin)的LB固體平板上進(jìn)行篩選，菌落PCR檢測(cè)篩選陽(yáng)性克隆，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 煙草NtCIPK2基因生物信息學(xué)分析

利用ExPASyProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam)分析 NtCIPK2編碼蛋白的理化性質(zhì)；用在線軟件ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白的疏水性；運(yùn)用IBCP的在線工具SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在線預(yù)測(cè)NtCIPK2的三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用 Signal-P 在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽；利用 CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)軟件在線分析NtCIPK2編碼蛋白氨基酸的結(jié)構(gòu)域；采用在線工具PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)預(yù)測(cè)NtCIPK2的亞細(xì)胞定位；運(yùn)用MEGA5、Bio Edit及Clustalx-2.0.9軟件以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 煙草 NtCIPK2 基因的表達(dá)分析

根據(jù)基因序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)qRT-PCR引物NtCIPK2-qF和NtCIPK2-qR，采用煙草的18SrRNA為內(nèi)參進(jìn)行表達(dá)差異研究。qRT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s和60 ℃延伸45 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán)。所有的樣品都設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后，基因相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算(表1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtCIPK2基因克隆

提取煙草葉片總RNA，以其反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示在1 000～1 500 bp的位置上有清晰的條帶(圖1)。將該條帶回收純化后與pMD19-T載體進(jìn)行連接，

表1引物序列

Table1Primer sequences

引物名稱Primername引物序列PrimersequencesNtCIPK2?FNtCIPK2?RNtCIPK2?qFNtCIPK2?qR18sF18SR5′?ATGGAGGAGAAGAAAGGAAA?3′5′?CTAACTATTAATTGGCTGCT?3′5′?TGCCAATGCTAATGTCGA?3′5′?TTCCTCCTTCTGATCCTTTC?3′5′?CCTACGCTCTGTATACATTAGC?3′5′?GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC?3′

1， NtCIPK2基因；M， Marker 1， NtCIPK2 PCR product; M， Marker圖1 NtCIPK2基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis analysis of NtCIPK2 PCR product

轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。運(yùn)用菌落PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆，隨機(jī)挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，目的片段大小為1 341 bp，通過(guò)NCBI上Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)該序列與普通煙草CIPK2(XM_016635422.1)序列完全一致。

2.2 NtCIPK2基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 NtCIPK2編碼蛋白的理化性質(zhì)及疏水性分析

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)包括氨基酸組成、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和不穩(wěn)定系數(shù)等。分析顯示，NtCIPK2基因共編碼446個(gè)氨基酸，其中亮氨酸(11.2%)，賴氨酸(10.1%)，谷氨酸(8.7%)，絲氨酸(7.0%)含量偏高，色氨酸(1.1%)含量最低。該蛋白預(yù)測(cè)的分子量為50.3 ku，理論等電點(diǎn)pI為8.90，不穩(wěn)定系數(shù)(instability index)為32.66，說(shuō)明該蛋白可能是一個(gè)穩(wěn)定的堿性蛋白。同時(shí)，其親水性平均指數(shù)為-0.265，用在線軟件ProtScale進(jìn)行疏水性分析(圖2)，結(jié)果預(yù)測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白。

2.3.2 NtCIPK2蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用IBCP的在線工具SOPMA對(duì)NtCIPK2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白中35.43%的氨基酸參與α-螺旋(Alpha helix)，30.72%的氨基酸參與無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)，21.52%的氨基酸參與延伸鏈(extended strand)，12.33%的氨基酸參與β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)，由此可見(jiàn)，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的最大元件為α-螺旋(圖3)。運(yùn)用 SWISS-MODEL對(duì)NtCIPK2的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，RasTop軟件進(jìn)行顯示(圖4)，并將結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)進(jìn)行比照，結(jié)果較為統(tǒng)一。

圖2 NtCIPK2蛋白疏水性分析Fig.2 Hydrophobicity analysis of NtCIPK2 protein

圖3 NtCIPK2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Predicted secondary structure of NtCIPK2 protein

圖4 NtCIPK2蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 The predicted advanced structure of NtCIPK2 protein

2.3.3 NtCIPK2蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)信號(hào)肽的預(yù)測(cè)有助于區(qū)分其功能結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞定位。利用Signal-P4.1軟件分析NtCIPK2蛋白信號(hào)肽，根據(jù)信號(hào)肽序列的特征，采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法或隱馬氏模型方法預(yù)測(cè)信號(hào)肽位置及切割位點(diǎn)。其中用Y-score maximum來(lái)判斷信號(hào)肽切割位點(diǎn)，用mean S-score來(lái)判斷是否是分泌蛋白(圖5)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Score為0.104，小于0.5，則預(yù)測(cè)該蛋白不是分泌蛋白，不存在信號(hào)肽。

2.3.4 NtCIPK2蛋白的結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的CDD軟件對(duì)NtCIPK2編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析(圖6)，結(jié)果表明，該蛋白在N端含有保守的活化環(huán)結(jié)構(gòu)域(S_TKc)，此結(jié)構(gòu)域從第13位到267位氨基酸結(jié)束，該區(qū)域磷酸化可以激活CIPK的活性。另外，其C端含有一個(gè)與CBL相互作用的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(CIPK-C)，此結(jié)構(gòu)域從318位到431位氨基酸結(jié)束，是確定CIPK家族蛋白的重要標(biāo)志。

利用PSORT在線預(yù)測(cè)NtCIPK2的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，該蛋白在質(zhì)膜上占0.700，在微體上占0.300，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中占0.200，在線粒體內(nèi)膜中占0.100，預(yù)測(cè)NtCIPK2可能定位在質(zhì)膜上。

2.3.5 NtCIPK2同源性分析

把NtCIPK2編碼的氨基酸序列在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 Blast比對(duì)，按照相似性程度高低選擇19個(gè)基因編碼的氨基酸序列(包括 NtCIPK2)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖7)，結(jié)果表明，NtCIPK2與絨毛狀煙草CIPK2(XP_009630199.1)、馬鈴薯CIPK18(XP_006365327.1)、番茄CIPK(XP_015076663.1)等具有較高的氨基酸序列同源性，分別為95%、94%、89%，與油棕CIPK18(XP_010937988.1)和菠蘿CIPK2(OAY79966.1)的同源性最低，均為69%。

圖5 NtCIPK2的信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.5 Signal peptide prediction of NtCIPK2

圖6 NtCIPK2的結(jié)構(gòu)域分析Fig.6 Structure domain analysis of NtCIPK2

圖7 NtCIPK2進(jìn)化樹(shù)分析Fig.7 The phylogenetic tree analysis of NtCIPK2

2.4 NtCIPK2的組織表達(dá)分析

以生長(zhǎng)60 d K326無(wú)菌苗的根、莖、葉以及成熟苗盛花期的花為材料提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，分析NtCIPK2在各個(gè)組織的表達(dá)量，NtCIPK2在根、莖、葉、花中均有表達(dá)，其中在莖中的表達(dá)量最高，其次是在根中的表達(dá)，在花中的表達(dá)量最低。在莖中表達(dá)量是在根中的2.6倍，是葉中的10.7倍，是花中的24.1倍。說(shuō)明NtCIPK2主要在煙草K326植株的莖中表達(dá)(圖8)。

2.5五種非生物逆境脅迫下NtCIPK2的表達(dá)分析

采用qRT-PCR對(duì)NtCIPK2在低鉀(10 μmol·L-1K+)、5% PEG-6000、10 mmol·L-1H2O2、200 mmol·L-1NaCl和1 μmol·L-1ABA處理后的表達(dá)量進(jìn)行分析。低鉀處理后，NtCIPK2表達(dá)量在12 h達(dá)到最大為對(duì)照(0 h)的5.11倍。5% PEG-6000和H2O2處理后，該基因都在3 h達(dá)到最大，分別為對(duì)照(0 h)的1.63倍和1.87倍(圖9)。

高鹽(200 mmol·L-1NaCl)處理后，NtCIPK2表達(dá)量在6 h達(dá)到最大，為對(duì)照(0 h)的5.95倍；在1 μmol·L-1ABA處理下，該基因表達(dá)量先下降后上升，12 h最低僅為對(duì)照(0 h)的39.1%，24 h最大為對(duì)照(0 h)的4.99倍(圖9)。

3 討論

CIPK基因家族廣泛分布于高等植物根、莖、葉等組織器官中。本試驗(yàn)從普通煙草K326中克隆到一個(gè)CIPK家族成員NtCIPK2基因的cDNA序列，通過(guò)對(duì)其編碼的蛋白CIPK2結(jié)構(gòu)域分析，其N端激酶催化域含有一個(gè)典型激活環(huán)S_TKc，C-端含有一個(gè)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域CIPK-C。調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中包含的高度保守NAF結(jié)構(gòu)域是CIPKs家族的典型特征[13]。CIPK分子的活化依賴于NAF基序的自我抑制與特定CBL的相互作用，兩者共同解讀植物脅迫下細(xì)胞的鈣信號(hào)變化[14]。氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，NtCIPK2與絨毛狀煙草CPK2、馬鈴薯CIPK18等具有很高同源性。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，NtCIPK2可能定位在質(zhì)膜中。在茄子中，SmCIPK2也定位到質(zhì)膜上[15]，也有研究表明CIPK2定位在質(zhì)膜和細(xì)胞核[10，16]。

不同組織之間沒(méi)有相同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)The bars with different lowercase letters showed significance at the level of 0.05圖8 NtCIPK2在煙草不同組織中的相對(duì)表達(dá)量分析Fig.8 Analysis of relative expression of NtCIPK2 in different tissues of tobacco

同一處理不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)間沒(méi)有相同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Under the same treatment at different time, the bars with different lowercase letters showed significance at the level of 0.05圖9 NtCIPK2在10 μmol·L-1 K+、5% PEG-6000和10 mmol·L-1 H2O2處理下的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Relative expression of NtCIPK2 under10 μmol·L-1 K+、5% PEG-6000和10 mmol·L-1 H2O2treatment

本研究利用qRT-PCR分析NtCIPK2在煙草K326不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示該基因在根、莖、葉、花中均有表達(dá)，莖中表達(dá)量最高。這與白刺N(yùn)tCIPK2表達(dá)不一樣，該基因在根中表達(dá)量最高[17]，原因可能與鹽生植物耐鹽性有關(guān)，白刺屬于鹽生植物。為保證植株正常生長(zhǎng)，需從根部吸收更多水分和離子，通過(guò)細(xì)胞液中積累無(wú)機(jī)離子或合成有機(jī)溶質(zhì)等方式進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)以減輕或避免傷害[18]；這與小麥TaCIPK2和TaCIPK25表達(dá)模式一致，該基因也在莖中表達(dá)最高[19-20]，推測(cè)煙草和小麥中NtCIPK2可能與莖中離子運(yùn)輸有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在高鹽(200 mmol·L-1NaCl)處理下，NtCIPK2的表達(dá)量明顯上調(diào)，6 h達(dá)到最大，這與小麥TaCIPK2表達(dá)模式一致[21]，表明NtCIPK2表達(dá)受高鹽誘導(dǎo)。在1 μmol·L-1ABA處理下，NtCIPK2在0～12 h表達(dá)量降低，水稻OsCIPK2在ABA處理下表達(dá)量也先下調(diào)[22]。在5%PEG-6000模擬干旱處理下，NtCIPK2表達(dá)上調(diào)，3～24 h均受到誘導(dǎo)。有研究將大豆CIPK基因家族分為4個(gè)亞組，CIPK2屬于Ⅳ亞組，屬于Ⅳ亞組中的基因在干旱脅迫下反應(yīng)明顯[23]。例如，用20%PEG-6000處理玉米ZmCIPK2，該基因在6 h誘導(dǎo)最強(qiáng)烈[11]；用15%PEG-6000處理大麥HbCIPK2，該基因在3～12 h顯著誘導(dǎo)，24 h小幅度下降[10]；但同樣處理下，白梨PbCIPK2表達(dá)則受到抑制，12～24 h逐漸下降至最低[24]，以上均說(shuō)明CIPK2基因與植物干旱脅迫相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，TaCIPK2蛋白通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞膜穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)ROS清除系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)植物抗旱能力[20]；水稻OsCIPK的誘導(dǎo)模式與其干旱應(yīng)激反應(yīng)因子相關(guān)，OsCIPK23的過(guò)表達(dá)能誘導(dǎo)多種抗旱相關(guān)基因的表達(dá)，從而間接地參與對(duì)干旱的響應(yīng)[25-26]。

低鉀(10 μmol·L-1K+)處理后，NtCIPK2表達(dá)量上調(diào)，12 h達(dá)到最大，表明NtCIPK2的表達(dá)受低鉀處理誘導(dǎo)。不同植物CIPK2表達(dá)模式不同，不同CIPK家族成員對(duì)低鉀脅迫反應(yīng)不同。茄子SmCIPK2在低鉀處理后，表達(dá)量上調(diào)，6 h達(dá)到最大[15]。甘蔗SsCIPK23、水稻OsCIPK10和玉米ZmCIPK9在低鉀處理后其表達(dá)都被誘導(dǎo)[27-29]。但在低鉀處理下CIPK2被誘導(dǎo)的機(jī)制尚未明確，目前AtCBL1/AtCBL9-AtCIPK23信號(hào)系統(tǒng)研究得較清楚。當(dāng)胞外K+濃度低時(shí)，AtCBL1和AtCBL9能夠通過(guò)與AtCIPK23互作，激活定位于質(zhì)膜上的K+通道蛋白AtAKT1，促使K+內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)節(jié)低鉀條件下植物K+的吸收[30]。

本試驗(yàn)選擇5種處理(10 μmol·L-1K+、5%PEG-6000、10 mmol·L-1H2O2、200 mmol·L-1NaCl和1 μmol·L-1ABA)以研究NtCIPK2的表達(dá)模式，在不同的脅迫條件，該基因表達(dá)情況發(fā)生改變，暗示了該基因在低鉀、干旱、鹽脅迫、H2O2和ABA脅迫下發(fā)揮重要作用。但NtCIPK2蛋白在其發(fā)揮的具體作用，尚待進(jìn)一步研究。今后可構(gòu)建GFP融合表達(dá)蛋白確定其亞細(xì)胞定位，通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)尋找與NtCIPK2互作的蛋白，深入研究NtCIPK2基因的功能，為從分子水平闡明NtCIPK2蛋白在非生物逆境脅迫中的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

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CloningandexpressionanalysisofNtCIPK2geneinNicotianatabacum

ZHUO Wei， CHEN Qian， LU Liming， LI Liqin*

(CollegeofAgronomy，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

CIPK(CBL-interacting protein kinase)is a class of bioactive serine/ threonine protein kinase that interacts with the calcineurin B-like protein (CBL) to regulate the physiological activity of plants in adapting or resisting to abiotic stress. The homologous sequences were used to clone the full length cDNA ofNtCIPK2 gene in the tobacco cultivar K326， and qRT-PCR was used to analyze the tissue-specific and abiotic stress expression pattern ofNtCIPK2. The results showed that this gene contained 1 341 bp and encoded 446 amino acid. The predicted molecular weight was 50.3 ku and the isoelectric point (pI) was 8.90. The homology analysis showed that the protein had 95% homology withNicotianatomentosiformisCIPK2， thus it was named asNtCIPK2. Bioinformatics analysis showed that NtCIPK2 was a hydrophilic protein whose N-terminus contained a conserved active loop domain S_TKc and the C-terminus contained the regulatory domain CIPK-C， and might be localized in the plasma membrane. Expression patterns showed that the gene was expressed in roots， stems， leaves and flowers in mature stage， which has the highest expression in stems. Expression patterns under abiotic stress indicated the gene expression was induced by low-potassium， high-salt， drought， H2O2and ABA treatment， and involved in the response to abiotic stress inNicotianatabacum.

tobacco;NtCIPK2; cloning; bioinformatics; gene expression

S572

A

1004-1524(2017)10-1597-08

（責(zé)任編輯張 韻)