張少孩　　王鴻　　尚小廣

[摘要] 目的 制備馬錢(qián)子堿微囊，考察其影響因素，找出最優(yōu)方案。 方法 以殼聚糖和明膠為囊材，馬錢(qián)子堿為囊心物，采用復(fù)凝聚法制備載藥微囊。通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以包封率、粒徑為指標(biāo)，確定最佳囊材比、囊心與囊材比及CaCl2的濃度，確定最優(yōu)配方。觀察其形態(tài)，測(cè)定其包封率、粒徑、載藥量、Zeta電位等。 結(jié)果 通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，制備馬錢(qián)子堿微囊的最優(yōu)配方：殼聚糖濃度為5 mg/mL，明膠濃度為4 mg/mL，CaCl2濃度為2%，囊心與囊材比為1∶3。3次平行制備所得的載藥微囊的各參數(shù)的平均值：包封率為28.73%，粒徑為2.15 μm，載藥量為10.6%，Zeta電位為12.61 mV。微囊分散性好，表面平滑完整，囊壁清晰，無(wú)粘連。 結(jié)論 以殼聚糖和明膠為原料的復(fù)凝聚法制備馬錢(qián)子堿微囊具有較高的包封率，且穩(wěn)定性好，制備工藝簡(jiǎn)單。

[關(guān)鍵詞] 馬錢(qián)子堿；微囊；殼聚糖；明膠

[中圖分類(lèi)號(hào)] R917.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）27-0042-04

Study on the preparation technology of brucine microcapsules

ZHANG Shaohai1 WANG Hong2 SHANG Xiaoguang2

1.Department of Pharmacology， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China； 2.Hangzhou Medical College， Hangzhou 310053， China

[Abstract] Objective To prepare brucine microcapsules， investigate the influencing factors and find out the optimal scheme. Methods Chitosan and gelatin were used as the capsule materials，and brucine was taken as the core materials.Drug-loaded microcapsules were prepared by complex coagulation method. Through orthogonal design test， with the encapsulation efficiency and particle size as an indicator， the best ratio of capsule materials， ratio of core to materials and the concentration of CaCl2 were determined， and the optimal formula was determined. Its shape was observed， and the encapsulation efficiency， particle size， drug loading capacity and zeta potential were measured. Results Through orthogonal design test，the optimum formula for preparing brucine microcapsules was as follows： The concentration of chitosan was 5 mg/mL， gelatin concentration 4 mg/mL， CaCl2 concentration 2%， and the ratio of capsule core to capsule materials was 1∶3. The average values of the parameters of the drug-loaded microcapsules prepared in three parallel preparations： The encapsulation efficiency was 28.73%， particle size 2.15 μm， the drug loading capacity 10.6% and Zeta potential 12.61 mV. Microcapsules were with good dispersion， smooth and complete surface， clear wall， and no adhesion. Conclusion The preparation of brucine microcapsules with chitosan and gelatin as raw materials has a high encapsulation efficiency， and the stability is good and the preparation process is simple.

[Key words] Brucine； Microcapsules； Chitosan； Gelatin

馬錢(qián)子堿（brucine，C23H26N2O4·4H2O）為白色結(jié)晶性粉末，在水中微溶，味極苦，屬劇毒品，是馬錢(qián)科植物馬錢(qián)子（Strychnosnuxvomical L1或云南馬錢(qián)StrychnosPierriannas A.W.Hi11）種子的主要生物堿之一[1]。2010 版《中國(guó)藥典》載其味苦，微溫，有劇毒，歸肝、脾經(jīng)。有通絡(luò)止痛、消腫散結(jié)之功?？捎糜诘驌p傷，骨折腫痛，風(fēng)濕頑痹，麻痹癱瘓，癰疽瘡毒，喉嚨腫痛[2]。近年來(lái)馬錢(qián)子用于冶療多種疑難雜癥均取得奇特療效，外用冶療癌痛效果更佳。有文獻(xiàn)報(bào)道，不同粒度的馬錢(qián)子粉末中生物堿的體外釋放速度很快，10 min的累計(jì)釋放率達(dá)到50%～80%，在80 min時(shí)基本釋放完全[3]。馬錢(qián)子堿具有中樞毒性，因此這樣的釋放速度采用常規(guī)方法如口服、注射等給藥往往風(fēng)險(xiǎn)較大，容易引起中毒，且藥效較短。希望通過(guò)適當(dāng)?shù)闹苿┦侄?，延緩馬錢(qián)子堿的釋放速度，同時(shí)降低藥物的毒性，達(dá)到安全用藥的目的。endprint

微囊化是利用高分子原料將固體或液體藥物包封起來(lái)而形成直徑1～250 μm的微型膠囊[4]。微囊具有保護(hù)物質(zhì)免受環(huán)境條件的影響、掩蔽藥物的刺激性、提高藥效，減少副作用、增加藥物穩(wěn)定性、延長(zhǎng)藥物及靶向釋放等功能[5，6]。經(jīng)過(guò)微囊化后的藥物又可以制備成各種劑型，如注射劑、散劑、植入劑、膠囊劑、顆粒劑等，方便臨床用藥[7，8]。本實(shí)驗(yàn)將馬錢(qián)子堿包封在微囊中，使其給藥部位能夠穩(wěn)定持續(xù)的釋放所包裹的藥物，維持恒定的血藥濃度[9]，達(dá)到連續(xù)控制癌癥疼痛的效果，以減少藥物的副作用，提高療效和患者生活質(zhì)量。雖然已有有關(guān)馬錢(qián)子堿微囊的研究報(bào)道[1，3，10]，但是采用復(fù)凝聚法[11，12]制備的報(bào)道很少，為了進(jìn)一步研究馬錢(qián)子堿制劑，本實(shí)驗(yàn)擬采用殼聚糖和明膠為囊材[11-15]，以馬錢(qián)子堿為囊心物，復(fù)凝聚法制備馬錢(qián)子堿微囊，以包封率、粒徑為指標(biāo)，確定最優(yōu)制備配方。并對(duì)制備所得的微囊進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)和體外釋放實(shí)驗(yàn)，以確保其質(zhì)量符合要求。

1 材料與儀器

1.1 材料

馬錢(qián)子堿（南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司，含量≥98%）；明膠（上海試劑總廠，批號(hào)為20031006）；殼聚糖（上海伯奧生物科技有限公司，批號(hào)為080116）。其他化學(xué)試劑全部為分析純或化學(xué)純。

1.2 儀器

AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；SK8200HP超聲波洗濯器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；IKARC-MAG HS4磁力攪拌器；FA25高速乳勻機(jī)（上海弗魯克液體機(jī)器有限公司）；E200MV生物顯微鏡（南京尼康江南光學(xué)儀器有限公司）；TDL-40C低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DKB-501A超級(jí)恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；ZEN3690激光微粒測(cè)定儀（馬爾文儀器）；激光粒度分析儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）。

2 方法和結(jié)果

2.1 馬錢(qián)子堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

2.1.1 馬錢(qián)子堿測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密稱(chēng)取27.5 mg馬錢(qián)子堿，置于50 mL容量瓶，用蒸餾水稀釋至刻度，再精密移取2 mL稀釋25倍成0.022 mg/mL的溶液；以蒸餾水為空白，在190～400 nm波長(zhǎng)范疇內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，曲線見(jiàn)圖1，從圖中可看出，馬錢(qián)子堿在270 nm有吸收，200 nm附近有末端吸收，因此選擇270 nm作為馬錢(qián)子堿的檢測(cè)波長(zhǎng)。并將所用的輔料進(jìn)行以10倍的濃度在190～400 nm波長(zhǎng)范疇內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示輔料對(duì)藥物的吸收沒(méi)有影響。

2.1.2 線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱(chēng)取12.5 mg馬錢(qián)子堿原料藥，置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液。取適量?jī)?chǔ)備液用0.45 μm的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，精密移取續(xù)濾液 1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL和6 mL，置于25 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。采取紫外分光光度計(jì)在270 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，經(jīng)線性擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.0302C-0.0005（R2=0.999）。線性范圍為0～30 μg/mL，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.1.3 精密度測(cè)定 取上述濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入最大處方量的輔料，1 d內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度，每日測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果顯示日內(nèi)精密度RSD為0.56%、0.35%、0.31%（n=5），日間精密度RSD為0.68%，0.74%，0.56%（n=5），所有的RSD均在1%以?xún)?nèi)，符合要求。

2.1.4 回收率實(shí)驗(yàn) 測(cè)定2.1.3項(xiàng)下的三個(gè)濃度溶液的吸光度值，并進(jìn)行回收率和RSD值的計(jì)算，結(jié)果顯示平均回收率分別為（99.75±0.52）%，（98.97±0.78）%，（99.56±0.45）%，RSD均小于1%（n=3），符合要求。

2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取上述濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入最大處方量的輔料，分別于1 h，2 h，3 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h在270 nm測(cè)定吸光度，結(jié)果顯示溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 微囊的制備及其優(yōu)化[16-17]

2.2.1 微囊制備條件的選擇及優(yōu)化 稱(chēng)取適量明膠，用蒸餾水浸泡適宜時(shí)間，攪拌溶解完全后，加適量液體石蠟及司盤(pán)80，用高速乳勻機(jī)制成W/O型乳液；另稱(chēng)取對(duì)應(yīng)比例的殼聚糖浸泡超聲溶于2%醋酸溶液，加CaCl2及藥物，制得含藥殼聚糖溶液，調(diào)節(jié)磁力攪拌器溫度為30℃，攪拌下將其滴加到W/O型乳液中，用NaOH調(diào)節(jié)pH 4.5，繼續(xù)攪拌90 min，冰浴冷卻至10℃，加適量戊二醛，攪拌120 min。加正丁醇適量，搖勻后靜置30 min，溶液離心5000 rpm 15 min，沉淀用蒸餾水洗滌至無(wú)醛味，干燥，即得微囊。

通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取對(duì)微囊形成及包封率影響較為明顯的3個(gè)因素：殼聚糖與明膠的質(zhì)量比（A）、CaCl2的濃度（B）以及囊心與囊材的質(zhì)量比（C），每個(gè)因素有3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)（表1），以包封率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)以微囊粒徑為參考指標(biāo)，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，篩選出最優(yōu)制備處方。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 微囊包封率的測(cè)定[18] 將各處方制備的微囊混懸液5000 rpm離心15 min后的上清液，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液1～3 mL置于25 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，于270 nm波長(zhǎng)處測(cè)量其吸光度值，以蒸餾水為空白。將測(cè)定的數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得上清液的濃度，并根據(jù)下面公式計(jì)算包封率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.3 微囊載藥量的測(cè)定[19] 精密稱(chēng)取25 mg干燥微囊，研缽中研磨粉碎，加入蒸餾水約15 mL，超聲使微囊中的藥物溶解完全后，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液于270 nm測(cè)吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，按照下式計(jì)算載藥量。見(jiàn)表2。endprint

載藥量（%）=微囊中的藥物重量/微囊重量×100%

2.2.4 微囊粒徑的測(cè)定 將制備所得到的微囊稀釋到一定濃度后，用激光粒度分析儀和ZEN3690激光微粒測(cè)定儀（馬爾文儀器）分別測(cè)定粒徑與Zeta電位。處方篩選的微囊的粒徑和Zeta電位結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.5 處方篩選及制備工藝優(yōu)化結(jié)果[5-6，16-17，20-21] 正交試驗(yàn)結(jié)果級(jí)極差分析見(jiàn)表3，其中綜合評(píng)分=包封率×0.6+D50×0.4。微囊實(shí)驗(yàn)的方差分析見(jiàn)表4。

從以上結(jié)果可以看出，3個(gè)因素的影響程度為B>A>C，即氯化鈣的濃度>殼聚糖與明膠的質(zhì)量比>囊心與囊材的質(zhì)量比。最佳水平組合為A1B2C2，即制備馬錢(qián)子堿微囊的最優(yōu)配方：殼聚糖濃度為5 mg/mL，明膠濃度為4 mg/mL，CaCl2濃度為2%，囊心與囊材比為1∶3。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照所獲得的最佳處方進(jìn)行A1B2C2重復(fù)性試驗(yàn)，制得3個(gè)批次的馬錢(qián)子堿微囊，測(cè)得其包封率分別為28.63%，28.74%，28.82%，均值為28.73%；載藥量為10.35%，10.15%，11.31%，均值為10.6%；SMD為2.46 μm，2.75 μm，2.36 μm，平均SMD為2.52 μm；Zeta電位為12.37 mV，13.41 mV，12.04 mV，平均值為12.61 mV。

將所制得的馬錢(qián)子堿微囊在10×10倍的生物顯微鏡下觀察其形態(tài)，并拍下圖像。再在40×10倍狀態(tài)下觀察并拍下圖像，見(jiàn)封三圖5和封三圖6，微囊分散性好，表面平滑完整，囊壁清晰，無(wú)粘連。

3 討論

馬錢(qián)子堿作為馬錢(qián)子生物堿中的主要成分之一，具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用，對(duì)整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有選擇性興奮作用。馬錢(qián)子堿占馬錢(qián)子總生物堿質(zhì)量的30%～40%，屬于有毒成分，使用不當(dāng)容易產(chǎn)生中毒甚至危及生命。如要使其發(fā)揮療效，需要通過(guò)一定的制劑手段，控制體內(nèi)藥物量及釋放速度，達(dá)到安全用藥的目的。微囊作為一種制劑手段，采用合適的高分子材料和制備方法將藥物包裹，通過(guò)選擇的囊材的緩釋作用，使藥物在體內(nèi)釋放減慢，延長(zhǎng)藥效，避免了毒性反應(yīng)的發(fā)生。

復(fù)凝聚法是常見(jiàn)的微囊制備方法，利用兩種相反電荷的高分子原料作為復(fù)合囊材，在一定前提下交聯(lián)，使囊材的溶解度降低而自溶液中析出，包裹囊心物成囊。本實(shí)驗(yàn)中采用的殼聚糖[12-13]和明膠兩種囊材均為是天然化合物，無(wú)毒，有良好的生物相容性和可生物降解性，是比較常用的藥用高分子材料，易得價(jià)廉。殼聚糖為聚陽(yáng)離子型多糖，明膠為兩性化合物，溶液中的pH大于等電點(diǎn)時(shí)使其帶負(fù)電荷，因此實(shí)驗(yàn)中要注意調(diào)節(jié)pH，使明膠始終帶負(fù)電荷。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)法確定了微囊制備的最佳工藝并進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)驗(yàn)證，采用最佳工藝制備的微囊粒徑較小，流動(dòng)性好，包封率和載藥量較好，重復(fù)性好。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)除了實(shí)驗(yàn)所考察的三個(gè)主要因素外，其他因素也會(huì)對(duì)微囊的制備產(chǎn)生一定的影響，如戊二醛、正丁醇、明膠的乳化程度等。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，戊二醛起到交聯(lián)固化的作用，但是要嚴(yán)格控制加入的量，過(guò)多會(huì)使微囊粘連緊密，難以分離；加入量過(guò)少，固化不完全，不易形成微囊。必須要根據(jù)藥物、囊材以及實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選擇，以獲取最合適的固化劑的用量，以確保獲得流動(dòng)性好的微囊。通過(guò)摸索，在本實(shí)驗(yàn)條件下戊二醛最適合的量為1 mL左右。

同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在固化完全后，不加入正丁醇，微囊不能形成沉淀物，難以離心分離；加入正丁醇混勻后，可見(jiàn)底部有沉淀，由此可見(jiàn)正丁醇可以使微囊分離，起到促進(jìn)固化的作用，進(jìn)一步減少微囊間的相互粘連。

在明膠制備W/O型乳液時(shí)，應(yīng)充分乳化，使明膠在液體石蠟中充分分散形成液滴，以便于在后面的成囊過(guò)程中能夠充分與殼聚糖結(jié)合形成微囊，否則難以形成微囊，只是液滴。為了保證乳化完全，明膠必須充分溶解，液體石蠟時(shí)分?jǐn)?shù)次加入，確保乳化完全。

本實(shí)驗(yàn)采用了藥劑學(xué)中經(jīng)常采用的正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)處方篩選和制備方法的確定進(jìn)行了優(yōu)選，具有一定的精密度，但是對(duì)各因素之間的交互作用不能較好的考察，這需要進(jìn)一步改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)制備得到的馬錢(qián)子堿微囊的體外釋放度及體內(nèi)的溶出特性是否能達(dá)到預(yù)期的要求，還有待于進(jìn)一步的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 徐琪，李瑩瑩，王艷宏，等.馬錢(qián)子總生物堿樹(shù)脂復(fù)合物微囊包衣處方研究[J]. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，31（4）：405-409.

[2] 中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：47-48.

[3] 潘潔文，馬東升，張立國(guó)，等. 馬錢(qián)子生物堿微囊的制備及評(píng)價(jià)[J]. 華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014， 40（3）：296-301.

[4] 許良葵.中藥微囊制備及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016，12（12）：55-56.

[5] 楊曉艷，張愛(ài)武.普羅布考微囊的制備與性質(zhì)考察[J].北方藥學(xué)，2017，14（4）：156-158.

[6] 湯洋，杜倩，時(shí)瑞，等.葡萄籽原花青素微囊的制備工藝優(yōu)化及質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2016，47（12）：1536-1541.

[7] Shaoping Sun，Na Liang，Hiromitsu Yamamoto，et al.pH-sensitive poly（lactide-co-glycolide） nanoparticle composite microcapsules for oral delivery of insulin[J].International Journal of Nanomedicine，2015，10：3489-3498.

[8] Ford Versypt AN，Pack DW，Braatz RD. Mathematical modeling of drug delivery from autocatalytically degradable PLGA microspheres-a review[J]. J Control Release， 2013，165（1）：29-37.endprint

[9] 余琰，范凌云，高健微，等.鹽酸小檗堿微囊的制備及其體外釋藥研究[J].中國(guó)藥房，2015，26（1）：109-112.

[10] 閆雪生，付加雷，李巖，等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化制備馬錢(qián)子微囊[J].中成藥，2010，32（10）：1705-1708.

[11] 冼遠(yuǎn)芳，王超，羅瑩瑩，等.復(fù)凝聚法制備4種殼聚糖微囊的比較[J].西北藥學(xué)雜志，2013，28（2）：183-186.

[12] 賀寶元，張寶艷，李珊，等. 載5-氟尿嘧啶殼聚糖/明膠微粒的制備及藥物釋放性能[J].化工進(jìn)展，2016，35（7）：2151-2155.

[13] 王禮，鄧衛(wèi)利，莫建光，等. 殼聚糖在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展[J].廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，19（2）：90-92.

[14] Li Q，Sun LJ，Gong XF，et al. Simultaneous optimization of multiple response variables for the gelatinchitosan microcapsules containing angelica essential Oil[J]. Iran J Pharm Res，2017，16（1）：50-62.

[15] Xu F，Zhao T，Wang S，et al.Preparation of magnetic and pH-responsive chitosan microcapsules via sonochemical method[J].J Microencapsul，2016，33（2）：191-198.

[16] 楊代宏，郭國(guó)領(lǐng).馬來(lái)酸氨氯地平微囊制備工藝研究[J].海峽藥學(xué)，2016，28（6）：19-22.

[17] 吳凱波，梁金燕.復(fù)凝聚法制備左旋多巴膠囊的工藝研究[J].中國(guó)處方藥，2016，14（8）：28-29.

[18] 艾鳳偉，莊海濤，凌勇，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化青蒿素微囊的制備工藝[J].中成藥，2015，37（7）：1457-1462.

[19] 馬桂芝，滕亮，李文英，等.乳化-溶劑揮發(fā)法制備左旋多巴微囊[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，37（1）：47-53.

[20] 安杉杉.雷貝拉唑鈉樹(shù)脂復(fù)合物微囊的研制[D].廣東藥學(xué)院，2015，5：47-58.

[21] 朱岳鑫，饒麗明，吳立蓉.復(fù)凝聚法制備丹皮酚微囊的研究[J].中國(guó)處方藥，2016，14（6）：34-36.

（收稿日期：2017-07-31）endprint