楊閃閃，黃巧云，蔡鵬

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070

原子力顯微鏡(AFM)在細(xì)菌生物被膜研究中的應(yīng)用

楊閃閃，黃巧云，蔡鵬

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070

原子力顯微鏡(AFM)作為一項(xiàng)重要的表面可視化技術(shù)，以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)(納米級(jí)的空間分辨率、皮牛級(jí)力靈敏度、免標(biāo)記、可在溶液環(huán)境下工作)被廣泛應(yīng)用于生物被膜的研究。AFM 不僅可以在近生理環(huán)境下對(duì)生物被膜表面超微形貌進(jìn)行可視化表征，同時(shí)還可以通過(guò)納米壓痕對(duì)生物被膜的機(jī)械特性(彈性和粘性)進(jìn)行定量測(cè)量，利用AFM單細(xì)胞和單分子力譜技術(shù)可以獲得生物被膜形成過(guò)程中細(xì)胞-基底以及細(xì)胞-細(xì)胞之間的相互作用力，為生物被膜的實(shí)時(shí)原位系統(tǒng)研究提供了可行性。本文簡(jiǎn)述了AFM的基本操作原理，綜述了近年來(lái)AFM用于生物被膜表面超微結(jié)構(gòu)成像、機(jī)械特性測(cè)量以及相互作用力研究方面的進(jìn)展，并對(duì)AFM在生物被膜研究中面臨的問(wèn)題和未來(lái)的發(fā)展方向進(jìn)行了討論。

原子力顯微鏡，細(xì)菌生物被膜，超微形貌，機(jī)械特性，相互作用力

生物被膜是微生物通過(guò)表面粘附，由自身分泌的胞外聚合物包裹形成的微生物聚集體，是環(huán)境微生物存在的主要形式[1-2]。細(xì)菌在固相表面形成生物被膜一般依次經(jīng)歷以下5個(gè)階段：細(xì)菌運(yùn)移、初始粘附、微菌落形成、生物被膜成熟和脫落[3]。目前，生物被膜的可視化研究主要依賴于各種成像技術(shù)，如激光共聚焦顯微鏡(CLSM)、原子力顯微鏡(AFM)、掃描電子顯微鏡(SEM)等各種顯微成像技術(shù)[4]。AFM 作為一項(xiàng)重要的表面探測(cè)技術(shù)，具有納米級(jí)的空間分辨率和皮牛級(jí)力靈敏度[5]，可在溶液環(huán)境下監(jiān)測(cè)，不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、標(biāo)記、染色等預(yù)處理[6]，這使其特別適合于探測(cè)復(fù)雜的生物體系如生物被膜。自AFM 出現(xiàn)以來(lái)，已在生物被膜研究方面得到了廣泛應(yīng)用，如生物被膜的超微結(jié)構(gòu)成像[7-9]、機(jī)械特性測(cè)量[10-11]、膜表面大分子的原位成像與機(jī)械特性表征[12-13]、單分子力譜[14]、單細(xì)胞力譜[15]等。尤其是近年來(lái)，AFM的性能不斷增強(qiáng)，如高速掃描AFM使得獲取一幅圖像的時(shí)間降至毫秒級(jí)[16]，峰值力輕敲成像模式可以同時(shí)獲取多個(gè)反映樣本物理特性的參數(shù)(如形貌、能量耗散、彈性模量、粘附力、形變等)[17]，多頻AFM技術(shù)則可對(duì)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像[18]，這些技術(shù)的進(jìn)步提升了AFM在生物被膜研究中的應(yīng)用能力。基于此，本文在介紹AFM成像與力曲線測(cè)量原理的基礎(chǔ)上，總結(jié)了近年來(lái)AFM在生物被膜表面超微形貌成像、機(jī)械特性測(cè)量、生物被膜內(nèi)細(xì)胞-基底以及細(xì)胞-細(xì)胞相互作用力方面的進(jìn)展，并對(duì)AFM研究中面對(duì)的困難和未來(lái)的發(fā)展方向進(jìn)行了討論。

1 AFM簡(jiǎn)介

AFM 主要有激光發(fā)生器、附有針尖的微懸臂、壓電陶瓷掃描器、反射鏡、四象限光電檢測(cè)器以及反饋控制系統(tǒng)等6部分構(gòu)成(圖1A)。力敏感彈性微懸臂一端固定，另一端附有微小的針尖，當(dāng)針尖對(duì)固定的樣品進(jìn)行掃描時(shí)，針尖-樣品間相互作用力會(huì)引起微懸臂變形，由激光源發(fā)出的一束激光照射到微懸臂的背面，經(jīng)反光鏡反射到光電檢測(cè)器上，通過(guò)反饋控制系統(tǒng)即可記錄樣品的表面形貌或樣品-針尖間作用力等方面的信息[5,19-21]?？捎糜跇悠繁砻娉上馵22]、機(jī)械特性測(cè)量[23]、相互作用力[24]等方面的研究。

1.1 超微結(jié)構(gòu)成像原理

AFM 成像模式主要有接觸模式和輕敲模式兩種。在接觸模式下，探針針尖與樣品之間的相互作用力(即懸臂梁形變量)保持恒定；在輕敲模式下，探針振動(dòng)的振幅保持恒定。對(duì)于細(xì)菌樣品，目前最常用的AFM成像模式是輕敲模式[9]，特別是在生物被膜成像、膜表面大分子高分辨率原位成像[25]等方面，輕敲模式橫向剪切力小且有助于獲得高分辨率圖像。

1.2 AFM力曲線測(cè)量原理

AFM探針相對(duì)于樣品在z方向做逼近-回退的往復(fù)運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中，通過(guò)記錄微懸臂偏轉(zhuǎn)量以及掃描管的位移量，根據(jù)胡克定理可繪制樣品與針尖之間的作用力隨掃描管位置變化曲線，簡(jiǎn)稱力曲線(圖1B)。力曲線的具體物理意義為：探針未接觸樣品時(shí)，探針針尖與樣品之間沒有作用力，探針受力為零，懸臂梁初始形變量為零，此過(guò)程在力曲線上表現(xiàn)為一條水平基線(圖1B，過(guò)程1)；針尖接觸并對(duì)樣品進(jìn)行擠壓時(shí)，微懸臂受樣品排斥作用而發(fā)生向上偏轉(zhuǎn)，直至達(dá)到偏轉(zhuǎn)閾值，此過(guò)程在力曲線上表現(xiàn)為排斥力逐漸增大(圖1B，過(guò)程2)；微懸臂達(dá)到偏轉(zhuǎn)閾值后，探針開始逐漸趨離樣品，由于微懸臂仍受斥力，所以該過(guò)程在力曲線上表現(xiàn)為排斥力逐漸減小(圖1B，過(guò)程3)；當(dāng)微懸臂向上的偏轉(zhuǎn)量減小為零后，探針與樣品之間的作用力由排斥力(正值)變?yōu)檎硿?負(fù)值)，此時(shí)微懸臂向下偏轉(zhuǎn)直到克服最大粘滯力而脫離樣品表面后偏轉(zhuǎn)恢復(fù)為零，該過(guò)程在力曲線上表現(xiàn)為向下的峰(圖1B，過(guò)程4)；之后針尖已完全脫離樣品，探針針尖與樣品之間沒有作用力，在探針進(jìn)一步回退過(guò)程中微懸臂受力為零，該過(guò)程在力曲線上表現(xiàn)為一條水平基線(圖1B，過(guò)程5)。通過(guò)對(duì)該力曲線進(jìn)行校正和模型分析，可以得到樣品的彈性和粘性等一系列機(jī)械特性[26-28]；將特定的生物大分子如凝集素連接到AFM 掃描探針的尖端，制備分子或單分子探針(圖1C-2)，借助生物大分子之間特異性(配體-受體)的相互作用，可以對(duì)生物被膜表面的某些大分子(蛋白、多糖、DNA等)定位[5,12]，定量分析生物被膜中分子與分子以及分子與細(xì)胞之間的作用力[27]；同樣的，將細(xì)菌細(xì)胞固定在AFM掃描探針的尖端，制備細(xì)胞或單細(xì)胞探針(圖1C-3)，可以在細(xì)胞水平定量分析生物被膜形成過(guò)程中細(xì)胞-基底以及細(xì)胞-細(xì)胞之間的相互作用力[29,30]。

圖1 AFM結(jié)構(gòu)、成像以及力曲線測(cè)量原理[5-6]Fig.1 The principle of AFM imaging and cellular mechanical properties measurement.(A)The main components of AFM.(B)A schematic diagram of an idealised force-distance curve.(C1)The tip scans the cell surface in buffer with nanometer-scale resolution.(C2)The small interaction force between the tip and cell surface molecules and the tip is generally labeled with a ligand to detect, localize, and manipulate individual receptors.(C3)Single-cell force spectroscopy involves attaching a single live cell to the AFM cantilever, for instance using a colloidal probe coated with bioinspired polydopamine polymers[5-6].

2 生物被膜的超微形貌成像

利用AFM對(duì)細(xì)胞超微形貌進(jìn)行成像包括在空氣中成像和在溶液中成像兩種方式[31]。在空氣中對(duì)生物被膜進(jìn)行成像時(shí)，干燥過(guò)程使生物被膜失去水分而變得堅(jiān)硬，因此成像空間分辨率較高[7]。例如，Oh等[32]在空氣中對(duì)聚丙烯材料表面不同形成時(shí)間的生物被膜進(jìn)行AFM成像，觀察到培養(yǎng)3 d的生物被膜細(xì)胞成簇狀分布，胞外聚合物圍繞細(xì)胞存在。Volle等[33]對(duì)5種細(xì)菌進(jìn)行 AFM 成像，觀察到枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、惡臭假單胞菌Pseudomonas putida、大腸桿菌Escherichia coliZK1056生物被膜細(xì)胞表面有約1μm長(zhǎng)的菌毛和約8μm長(zhǎng)的鞭毛，而E.coliML35的生物被膜細(xì)胞沒有鞭毛但有約4μm長(zhǎng)的菌毛，藤黃微球菌Micrococcus luteus生物被膜細(xì)胞既沒有鞭毛也沒有菌毛。利用AFM 研究單物種生物被膜和多物種生物被膜的結(jié)構(gòu)差異，F(xiàn)eng等[34]發(fā)現(xiàn)空腸彎曲桿菌Campylobacter jejuniF38011與其他細(xì)菌(金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、腸道沙門氏菌Salmonella enterica、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa)混合培養(yǎng)形成的生物被膜中細(xì)胞排列更緊湊，表面粗糙度不到C.jejuni生物被膜的1/8。通過(guò)對(duì)紫色色桿菌Chromobacterium violaceumATCC31532野生株和缺失信號(hào)分子釋放能力的C.violaceumNCTC13274突變株形成的生物被膜進(jìn)行 AFM 成像，Kamaeva等[35]發(fā)現(xiàn)野生株生物被膜細(xì)胞表面存在大量的胞質(zhì)膜內(nèi)陷結(jié)構(gòu)，而突變株表面則非常光滑，表明C.violaceum通過(guò)胞質(zhì)膜內(nèi)陷結(jié)構(gòu)接收和釋放信號(hào)分子，調(diào)控生物被膜的形成?？諝庵袑?duì)生物被膜進(jìn)行成像雖有助于認(rèn)識(shí)細(xì)胞表面的超微形貌，但將生物被膜細(xì)胞暴露在空氣中會(huì)不可避免地導(dǎo)致細(xì)胞本身結(jié)構(gòu)的改變，從而給成像結(jié)果的解釋帶來(lái)困難[22]。此外，空氣中成像獲得的通常是靜態(tài)圖像，不能獲取生物被膜形成過(guò)程中表面超微結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化的信息[36]。在溶液環(huán)境下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行AFM成像時(shí)，首先需要將細(xì)胞固定到基底[7]。為了增強(qiáng)生物被膜細(xì)胞與基底之間的粘附效果，可在基底表面覆蓋一層帶正電荷的高分子聚合物，通過(guò)靜電吸附作用固定細(xì)胞，但交聯(lián)劑的引入可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)及結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[37]。Liu等[38]利用AFM在生理?xiàng)l件下成功地實(shí)現(xiàn)了納米尺度生物被膜形成過(guò)程的原位實(shí)時(shí)追蹤(圖2)，并從納米力學(xué)的角度劃分了生物被膜形成的不同階段。Li等[39]利用同樣的方法原位監(jiān)測(cè)嗜熱硫氧化硫桿菌Sulfobacillus thermosulfidooxidans在黃鐵礦表面成膜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)成膜初期細(xì)菌通過(guò)釋放胞外聚合物在基底形成一層條件膜促進(jìn)細(xì)胞的初始粘附，并觀測(cè)在生物被膜形成中過(guò)程不斷有新合成的小尺寸礦物形成且均勻分布在生物被膜周圍。Huang等[40]利用AFM發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于富營(yíng)養(yǎng)的LB培養(yǎng)基，土壤礦物(蒙脫石、高嶺石、針鐵礦)表面的細(xì)菌(E.coliTG1,B.subtilis168,P.putidaKT2440，根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciensEHA105)在貧營(yíng)養(yǎng)的M9培養(yǎng)基中更易形成生物被膜。

由于AFM本身不具有特異性識(shí)別能力，使得大部分情況下僅從AFM圖像中難以辨識(shí)出人們感興趣的細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)，因此研究人員大多借助特定化學(xué)或生物分子修飾的AFM探針，利用生物大分子之間特異性的抗原-抗體作用對(duì)細(xì)胞表面特定生物分子的分布、結(jié)構(gòu)和機(jī)械特性進(jìn)行研究(圖3)[5,41]。例如，利用外源凝集素與菌體表面碳水化合物特異性結(jié)合的特性，F(xiàn)ahs等[13]用3種不同類型凝集素(刀豆素、麥胚素以及來(lái)自P.aeruginosaPAO1的外源凝集素)修飾的探針對(duì)熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescensCIP生物被膜表面的多糖進(jìn)行組分鑒定，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)24 h的生物被膜中含有大量由葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺等單糖分子組成的多糖，利用蟲鏈模型擬合修飾的探針與多糖分子之間的力曲線，推斷出這些多糖組分可能與 EPS的多肽組分相關(guān)聯(lián)。Quiles等[42]對(duì)LB中培養(yǎng)3 h和24 h的P.fluorescens胞外糖原進(jìn)行成像分析，結(jié)果顯示培養(yǎng)3 h樣品的成像區(qū)內(nèi)有80%的區(qū)域檢測(cè)不到糖原的存在，而培養(yǎng)24 h樣品的成像區(qū)內(nèi)這一數(shù)值降到了7%，證明在沒有生長(zhǎng)壓力的情況下細(xì)菌也可以產(chǎn)生大量的糖原；進(jìn)一步分析探針與糖原之間的力曲線發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，糖原分子通過(guò)增加糖鏈的長(zhǎng)度和支鏈的數(shù)量完成胞外多糖的積累。Francius等[41]分別對(duì)鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosusGG野生株和突變株表面的半乳糖和甘露糖進(jìn)行分布成像。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型菌株相比，突變型菌體表面多糖的粘附性、多糖分子長(zhǎng)度及菌體表面兩種多糖分子的密度都大大降低。

圖3 活細(xì)胞表面的分子識(shí)別位點(diǎn)成像[5]Fig.3 Mapping molecular recognition sites on living cells.Topographic image(left)showing two living mycobacteria on a polymer support and adhesion force map(right)recorded on a single cell with a heparin-modified tip[5].

3 生物被膜的機(jī)械特性

生物被膜的機(jī)械特性(如硬度、粘彈性)在膜的形成和空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性中起著重要作用[43]。在不利的生存環(huán)境下如干燥、抗生素處理或水流沖擊，細(xì)菌通過(guò)釋放胞外聚合物增加自身的粘性，使細(xì)胞更易在基底形成生物被膜進(jìn)而保護(hù)自身細(xì)胞[26]，或通過(guò)增加自身的硬度來(lái)抵抗剪切力的傷害[44]。Oh等[45]利用AFM研究養(yǎng)分對(duì)生物被膜形成的影響，納米壓痕的結(jié)果顯示，探針和生物被膜表面的粘性隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，表明隨著生物被膜的成熟，細(xì)胞開始釋放胞外聚合物并在生物被膜表面積累；且低養(yǎng)分條件下E.coliO157:H7生物被膜的粘性要大于營(yíng)養(yǎng)豐富條件下形成的生物被膜。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(B.subtilis、M.luteus)和革蘭氏陰性菌(E.coliML35、E.coliZK1056、P.putida)生物被膜的機(jī)械特性測(cè)定結(jié)果顯示，革蘭氏陽(yáng)性菌形成的生物被膜粘彈性要大于革蘭氏陰性菌細(xì)胞，這主要是由于兩種類型細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同所致[33](革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁是由一層厚而致密的肽聚糖和磷壁酸組成，革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁較薄，只含有少量的肽聚糖)[46]。游離態(tài)細(xì)胞由于缺少EPS，其與探針之間的作用力要明顯小于探針與生物被膜之間的作用力[47]。Nunez等[48]利用 AFM 研究E.coli生物被膜受蛭弧菌Bdellovibrio bacteriovorus109J攻擊前后的生理變化，AFM超微結(jié)構(gòu)成像顯示，B.bacteriovorus入侵后E.coli生物被膜中細(xì)胞由棒狀變?yōu)榍蛐危砻婕y理變小并且可以觀察到入侵E.coli細(xì)胞的B.bacteriovorus在細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)圈，正常E.coli細(xì)胞的硬度是B.bacteriovorus感染細(xì)胞的3倍，感染細(xì)胞與AFM探針之間的粘力遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞。Li等[39]利用AFM測(cè)定了黃鐵礦表面S.thermosulfidooxidans生物被膜的表面粘性，發(fā)現(xiàn)生物被膜表面粘性大小分布很不均一，細(xì)胞與細(xì)胞以及細(xì)胞與基底接觸處的粘性較其他區(qū)域的大，這可能是由于 EPS優(yōu)先在這些區(qū)域積累導(dǎo)致的。在不同的溫度(28、33、37、42℃)條件下，生物被膜的粘性也不一樣，P.aeruginosa在37℃時(shí)粘性最大((10.8±0.2)pN/nm)，而此時(shí)生物被膜中胞外聚合物的量也最多[49]。Quiles等[50]將AFM與傅里葉全反射紅外光譜(ATR-FTIR)結(jié)合評(píng)價(jià)抗菌肽的殺菌效果，納米壓痕的結(jié)果顯示，低濃度(12.5 mg/L)處理后，P.fiuorescens生物被膜中細(xì)胞的高度(由200降到125 nm)和彈性都減小(由0.018降到0.015 pN/nm)，高濃度(100 mg/L)處理后，細(xì)胞高度(400 nm)和彈性(0.061 pN/nm)都增加且都高于未經(jīng)處理的細(xì)胞；結(jié)合ATR-FTIR指紋圖譜的信息，作者認(rèn)為在低濃度時(shí)細(xì)胞吸附抗菌肽的同時(shí)也分解磷脂雙分子層，從而導(dǎo)致膜的通透性增加，彈性減弱；高濃度時(shí)，大量吸附的抗菌肽代替磷脂阻塞了由于分解出現(xiàn)的孔洞，反而使細(xì)胞的通透性降低，彈性增強(qiáng)；上述結(jié)果表明低濃度的抗菌肽具有更強(qiáng)的殺菌效果。

4 生物被膜形成過(guò)程中的作用力

在生物被膜形成過(guò)程中，細(xì)菌利用細(xì)胞表面的大分子或釋放到胞外的聚合物如多糖、蛋白、核酸和脂類等，使自身吸附在固相表面或?qū)⒓?xì)胞聚集在一起，形成具有一定機(jī)械穩(wěn)定性的三維空間結(jié)構(gòu)體[1]。細(xì)胞的初始吸附和聚集受各種分子間相互作用力的調(diào)控，包括特異性(如配體-受體之間的分子識(shí)別)和非特異性(如氫鍵、疏水作用力、范德華力、靜電作用力等)的相互作用力[51]。因此，了解生物被膜形成過(guò)程中的力學(xué)信息有助于我們更好地認(rèn)識(shí)生物被膜的形成機(jī)理從而有效地調(diào)控和利用生物被膜。

4.1 細(xì)胞與基底的作用力

粘附是生物被膜形成的第一步也是最關(guān)鍵的步驟[3]。AFM 單細(xì)胞探針測(cè)定的結(jié)果顯示，乳酸乳球菌Lactococcus lactis的SdrC蛋白過(guò)量表達(dá)細(xì)胞與甲基修飾的疏水性表面之間存在強(qiáng)的相互作用，大小在5000到20000 pN之間，而與羥基修飾的親水表面或缺失SdrC蛋白突變株與疏水表面之間的作用力則都在5000 pN以下，證實(shí)在生物被膜形成初始階段，SdrC蛋白通過(guò)疏水作用調(diào)控細(xì)胞的粘附[52]。利用相同的研究手段，Chatel等[53]發(fā)現(xiàn)P.fluorescens通過(guò)表面的LapA蛋白調(diào)控細(xì)胞在疏水表面上的粘附。Boks等[54]利用 AFM 研究4種表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis與親水或疏水表面之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)接觸時(shí)間小于5 s時(shí)，4種細(xì)菌與兩種類型表面之間的作用力都在0.4 nN左右，隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞與甲基修飾的疏水表面之間的作用力基本沒有變化，作者認(rèn)為這可能是由于疏水作用的時(shí)間較短，細(xì)菌借助疏水作用在短時(shí)間內(nèi)克服細(xì)胞與表面之間的能障并迅速固定在基底；對(duì)于親水的玻璃表面，細(xì)胞與之接觸10 s后兩者之間的作用顯著增加，接觸60 s時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，最大作用力為1.9 nN，對(duì)探針與基底分離時(shí)的力曲線進(jìn)行泊松分析，發(fā)現(xiàn)S.epidermidis與親水表面接觸時(shí)，細(xì)胞主要是通過(guò)氫鍵作用(占總作用力的80%)粘附在基底。Beaussart等[55]利用AFM定量評(píng)價(jià)P.aeruginosa四型菌毛在細(xì)菌吸附中的貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)菌毛與疏水基底之間發(fā)生非配位相互作用。比較野生株和菌毛缺失突變株與玻璃基底之間的作用力，證實(shí)革蘭氏陰性菌(E.coli、P.putida)主要是通過(guò)菌毛的非配位作用調(diào)控其在玻璃表面的粘附。Huang等[40]研究發(fā)現(xiàn)E.coliTG1與土壤礦物針鐵礦之間存在強(qiáng)的相互作用，作用力大小為97 pN。Lower等[56]利用AFM檢測(cè)到希瓦氏菌Shewanella oneidensis在厭氧條件與針鐵礦有較強(qiáng)的粘附力，通過(guò)將細(xì)胞與針鐵礦相互作用的力譜圖和針鐵礦薄膜包被探針與重組 MtrC或OmcA分子相互作用的力譜圖進(jìn)行比對(duì)，推知外膜多肽與針鐵礦之間存在鍵合作用[57]。Xu等[58]測(cè)定了E.coliZK1056包被的懸臂梁和5種不同材質(zhì)表面之間的作用力，發(fā)現(xiàn)懸臂梁與不同材料之間分離時(shí)，力的斷裂距離與細(xì)胞表面菌毛的長(zhǎng)度吻合，證明菌毛調(diào)控E.coliZK1056在不同化學(xué)材料表面的粘附行為。Diao等[59]利用AFM研究了不同鹽濃度下嗜酸氧化亞鐵硫桿菌Acidithiobacillus ferrooxidans的粘附行為，發(fā)現(xiàn)不同鹽濃度下胞外聚合物和細(xì)菌胞外附件如菌毛可通過(guò)調(diào)整自身的構(gòu)象影響細(xì)菌在黃銅礦表面的粘附行為。

4.2 細(xì)胞與細(xì)胞的作用力

細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用對(duì)于生物被膜的形成和3D結(jié)構(gòu)的維持至關(guān)重要，同時(shí)還影響著生物被膜中細(xì)胞的存活、基因的表達(dá)、細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)以及分化[51]。在生物被膜形成過(guò)程中，細(xì)菌通過(guò)膜表面的大分子或釋放到胞外的多聚物(多糖、蛋白、核酸以及脂類等)將細(xì)胞聚集在一起，維持生物被膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[1]。三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAAs)是革蘭氏陰性菌如伯克霍爾德菌Burkholderia cepacia表面一種常見的蛋白，El-Kirat-Chatel等[60]利用 AFM 單分子力譜證實(shí)兩個(gè)TAAs蛋白之間存在相互作用，力的大小為118 pN；通過(guò)擬合不同加載力條件下的力曲線，發(fā)現(xiàn)TAAs蛋白之間存在弱的親同性相互作用，推斷細(xì)胞表面的TAAs蛋白通過(guò)親同性相互作用參與調(diào)控B.cepacia生物被膜的形成。Feuillie等[52]利用AFM單細(xì)胞探針技術(shù)研究L.lactis細(xì)胞表面蛋白 SdrC在生物被膜形成過(guò)程中的作用，結(jié)果顯示，兩個(gè)過(guò)量表達(dá)SdrC的細(xì)胞之間接觸1 ms后可檢測(cè)到的最大粘附力為98 pN，接觸100 s后作用力增加到230 pN，而接觸相同時(shí)間的蛋白過(guò)表達(dá)細(xì)胞與蛋白缺失細(xì)胞以及兩個(gè)蛋白缺失細(xì)胞之間均未檢測(cè)到力的存在，證實(shí)L.lactis借助SdrC蛋白調(diào)控細(xì)胞-細(xì)胞之間的相互作用；單細(xì)胞探針技術(shù)分析兩個(gè)野生型耐甲氧苯青霉素S.aureus細(xì)胞之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)短時(shí)間接觸后，記錄的力曲線中有8%出現(xiàn)了SdrC-SdrC蛋白相互作用的特征峰，長(zhǎng)時(shí)間接觸后特征峰出現(xiàn)的概率增加到29%，從而明確了SdrC蛋白在金黃色葡萄球生物被膜形成過(guò)程中的貢獻(xiàn)。利用相似的研究方法，Bausier等[61]證實(shí)S.aureus表面的FnBPA蛋白參與調(diào)控生物被膜的形成，單細(xì)胞探針的結(jié)果顯示，兩個(gè)過(guò)量表達(dá) FnBPA蛋白的細(xì)胞之間的作用力大小為800–2000 pN；單分子探針的結(jié)果顯示，單個(gè)FnBPA蛋白與過(guò)表達(dá)FnBPA的細(xì)胞之間的作用力大小為125 pN，說(shuō)明可能有多對(duì)FnBPA蛋白參與兩個(gè)細(xì)胞之間的相互作用；利用FnBPA修飾的單分子探針對(duì)細(xì)胞表面進(jìn)行成像，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得出蛋白過(guò)表達(dá)的細(xì)胞表面FnBPA密度約為2000個(gè)/μm2，依據(jù)Hertz理論可知兩個(gè)細(xì)胞的接觸面積約為0.004μm2，從而推算出約有8對(duì)FnBPA蛋白參與細(xì)胞間的相互作用；進(jìn)一步分析細(xì)胞-細(xì)胞作用過(guò)程中的力曲線，作者最終提出有10對(duì)FnBPA蛋白參與兩個(gè)S.aureus細(xì)胞間的相互作用。PIA是一種存在于胞外聚合物中的陽(yáng)離子多聚糖，Dague等[62]利用AFM單細(xì)胞探針技術(shù)證實(shí)其參與調(diào)控細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用，而且實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，細(xì)胞間的作用力會(huì)隨離子強(qiáng)度的增加而降低，當(dāng)離子強(qiáng)度增加到500mmol/L時(shí)，兩個(gè)過(guò)表達(dá)PIA的S.epidermidis細(xì)胞間檢測(cè)不到相互作用的力，表明PIA是通過(guò)靜電作用參與調(diào)控生物被膜的形成。Vanzieleghem 等[63]利用羧基修飾的探針對(duì)不同離子強(qiáng)度下表達(dá)PIA的S.epidermidis進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)在生理?xiàng)l件下(pH7.4)，隨著離子強(qiáng)度由0.1mmol/L增加到150mmol/L，帶負(fù)電荷的探針在細(xì)胞表面檢測(cè)到力的概率由79%下降到零，可見離子強(qiáng)度通過(guò)改變細(xì)胞表面陽(yáng)離子多聚糖的電荷性質(zhì)影響生物被膜的形成。Dague等[64]發(fā)現(xiàn)在不含有Zn2+的溶液中，兩個(gè)S.aureus細(xì)胞之間發(fā)生相互作用的概率為5%–31%，添加 Zn2+后這一概率增加到80%–100%；利用AFM對(duì)細(xì)胞表面進(jìn)行成像分析，結(jié)果顯示添加Zn2+后細(xì)胞表面變得更加平滑，彈性和粘性都明顯增加，表明 Zn2+通過(guò)改變細(xì)胞表面大分子的空間結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)控生物被膜形成過(guò)程中細(xì)胞-細(xì)胞之間的相互作用。

5 展望

AFM的出現(xiàn)為納米尺度下原位可視化表征生物被膜表面超微形貌、定量研究生物被膜機(jī)械特性以及膜形成過(guò)程中細(xì)胞與基底、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用力提供了強(qiáng)有力的支撐，為深入開展生物被膜研究帶來(lái)了新機(jī)遇。例如，在土壤學(xué)領(lǐng)域，土壤生物被膜可以增加群落整體對(duì)有毒有害物質(zhì)的耐受性，避免原生動(dòng)物的捕食，增加水平基因轉(zhuǎn)移的頻率等，開展土壤生物被膜的研究對(duì)于深入理解土壤生物過(guò)程的本質(zhì)，更好地調(diào)控生物參與的養(yǎng)分循環(huán)、污染物降解和土壤健康具有重要意義。土壤生物被膜中微生物大多以多物種形式存在，利用AFM闡明生物被膜中關(guān)鍵物種之間的相互作用機(jī)制，對(duì)于認(rèn)識(shí)和調(diào)控土壤生物被膜至關(guān)重要。但AFM在生物被膜研究中的應(yīng)用目前仍面臨如下諸多挑戰(zhàn)：1)生物被膜組成非常復(fù)雜，除了細(xì)胞外還含有各種類型的生物大分子，目前的單分子探針技術(shù)只能對(duì)膜表面?zhèn)€別的多糖和蛋白進(jìn)行定位分析。因此，應(yīng)加快研發(fā)更多新的分子探針以及同時(shí)識(shí)別多種分子的探針，以實(shí)現(xiàn)納米尺度下對(duì)生物被膜表面多種組分的同時(shí)識(shí)別、定位和成像。2)樣品機(jī)械特性的研究主要集中在彈性和粘性等表征，缺乏對(duì)力曲線數(shù)據(jù)的深度挖掘，應(yīng)考慮與模擬生物學(xué)和數(shù)字信息技術(shù)相結(jié)合，以得到更多有價(jià)值的生物表面性質(zhì)信息。3)AFM僅能獲得生物被膜表面的信息，難以對(duì)膜內(nèi)不同深度的結(jié)構(gòu)和化學(xué)信息進(jìn)行探究。因此，AFM 需要與其他檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合使用，目前AFM技術(shù)已與激光掃描共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡、透射電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、拉曼顯微鏡等[13,65]技術(shù)結(jié)合使用，多技術(shù)的聯(lián)合將成為AFM技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Application of atomic force microscopy(AFM)to study bacterial biofilms

Shanshan Yang, Qiaoyun Huang, and Peng Cai
State Key Laboratory of Agricultural Microbiology,College of Resource and Environment,Huazhong Agricultural University,Wuhan430070,Hubei,China

Because of the nanometre resolution, piconewton force sensitivity, label-free technique and the ability to operate in liquid environments, atomic force microscopy(AFM)has emerged as a powerful tool to explore the biofilm development processes.AFM provides three-dimensional topography and structural details of biofilm surfaces underin-situconditions.It also helps to generate key information on the mechanical properties of biofilm surfaces, such as elasticity and stickiness.Additionally, single-molecule and single-cell force spectroscopies can be applied to measure the strength of adhesion, attraction, and repulsion forces between cell-solid and cell-cell surfaces.This paper outlined the basic principleof AFM technique and introduced recent advances in the application of AFM for the investigation of ultra-morphological,mechanical and interactive properties of biofilms.Furthermore, the existing problems and future prospects were discussed.

atomic force microscopy(AFM), bacterial biofilms, ultra-morphology, mechanical properties, interaction forces

May9,2017;Accepted:July27,2017

Peng Cai.Tel/Fax: +86-27-87288618; E-mail: cp@mail.hzau.edu.cn

楊閃閃, 黃巧云, 蔡鵬.原子力顯微鏡(AFM)在細(xì)菌生物被膜研究中的應(yīng)用.生物工程學(xué)報(bào),2017,33(9):1399–1410.

Yang SS, Huang QY, Cai P.Application of atomic force microscopy(AFM)to study bacterial biofilms.Chin J Biotech,2017,33(9):1399–1410.

Supported by:National Key Research Program of China(No.2016YFD0800206), National Natural Science Foundation of China(No.41522106).

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(No.2016YFD0800206)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No.41522106)資助。

時(shí)間：2017-08-24

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170824.0943.001.html

蔡鵬 博士，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院教授，教育部青年長(zhǎng)江學(xué)者，國(guó)家萬(wàn)人計(jì)劃首批“青年拔尖人才”，國(guó)家自然科學(xué)優(yōu)秀青年基金和全國(guó)百篇優(yōu)秀博士學(xué)位論文獲得者?，F(xiàn)擔(dān)任中國(guó)土壤學(xué)會(huì)土壤生物與生物化學(xué)專業(yè)委員會(huì)委員、《農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報(bào)》編委等學(xué)術(shù)職務(wù)。主要從事土壤生物化學(xué)與環(huán)境方向研究，在土壤礦物-有機(jī)物-微生物相互作用、土壤生物膜形成機(jī)制、重金屬和病原菌污染土壤修復(fù)等研究方面取得了一些有價(jià)值的研究成果，發(fā)表SCI論文60余篇，作為副主編參編教材1本。獲國(guó)際環(huán)境生物地球化學(xué)學(xué)會(huì)Wolf Vishniac獎(jiǎng)和中國(guó)土壤學(xué)會(huì)優(yōu)秀青年學(xué)者獎(jiǎng)。