倪磊，金震宇，楊帥，金帆,2

1 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 合肥微尺度國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230026

2 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 中國(guó)科學(xué)院軟物質(zhì)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230026

銅綠假單胞菌蹭行運(yùn)動(dòng)單細(xì)胞分析方法的建立及應(yīng)用

倪磊1，金震宇1，楊帥1，金帆1,2

1 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 合肥微尺度國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230026

2 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 中國(guó)科學(xué)院軟物質(zhì)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230026

蹭行運(yùn)動(dòng)在生物被膜形成過(guò)程中對(duì)細(xì)菌適應(yīng)表面環(huán)境以及后續(xù)生物被膜三維結(jié)構(gòu)的形成起重要作用。因此，對(duì)蹭行運(yùn)動(dòng)的原位表征、量化是生物被膜研究中的重要科學(xué)問(wèn)題之一。我們通過(guò)高通量數(shù)據(jù)采集、自動(dòng)化圖像處理、數(shù)據(jù)庫(kù)建立以及圖形化輸出等技術(shù)手段，建立了一整套基于單細(xì)菌的統(tǒng)計(jì)分析方法。利用這一方法對(duì)蹭行運(yùn)動(dòng)中的行走、彈射過(guò)程進(jìn)行了詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)彈射運(yùn)動(dòng)過(guò)程中存在以0.9 s為周期的周期性弛豫。并定量比較了群體感知信號(hào)分子對(duì)蹭行運(yùn)動(dòng)的影響，發(fā)現(xiàn)加入信號(hào)分子后蹭行運(yùn)動(dòng)在高速區(qū)明顯增強(qiáng)。該方法的建立為后續(xù)蹭行運(yùn)動(dòng)分子機(jī)制以及調(diào)節(jié)方式的研究奠定了基礎(chǔ)。

蹭行運(yùn)動(dòng)，生物被膜，銅綠假單胞菌，新方法與新技術(shù)

蹭行運(yùn)動(dòng)特指細(xì)菌利用四型菌毛在固體表面上爬行，在假單胞菌和奈瑟菌屬中十分常見(jiàn)[1]。雖然發(fā)現(xiàn)的早，但對(duì)蹭行運(yùn)動(dòng)早年研究不多，直到發(fā)現(xiàn)其與生物被膜的緊密聯(lián)系后才獲得廣泛關(guān)注。細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌粘附于表面，通過(guò)分泌多種多糖基質(zhì)、蛋白、DNA等胞外聚合物，將其自身包裹起來(lái)而形成的大量細(xì)菌聚集膜狀物。生物被膜會(huì)在人體器官和醫(yī)療移植的器官表面形成而造成感染和移植手術(shù)失敗[2]，在工業(yè)管道內(nèi)部產(chǎn)生后易導(dǎo)致管道堵塞而大大增加能耗成本。某些細(xì)菌產(chǎn)生的生物被膜已經(jīng)成為危害人類健康的重要?dú)⑹?，?jù)估計(jì)人體中約80%的細(xì)菌感染由生物被膜造成[3]，其中銅綠假單胞菌的感染尤為常見(jiàn)，常引起肺炎、尿道炎和中耳炎等疾病。銅綠假單胞菌形成的生物被膜也是許多院內(nèi)感染和術(shù)后感染的病原，由于其對(duì)很多抗生素天生抗藥且易在治療中產(chǎn)生抗藥性，很多感染難以治愈[4]。欲防治生物被膜，需首先理解生物被膜形成的關(guān)鍵因素以及生物被膜難以鏟除的原因，部分研究者把目光聚焦于細(xì)菌的蹭行運(yùn)動(dòng)。

近兩年，不斷出現(xiàn)蹭行運(yùn)動(dòng)研究領(lǐng)域的突破性工作[5-8]。細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)與生物被膜形成的關(guān)系主要體現(xiàn)在3個(gè)方面：1)細(xì)菌通過(guò)四型菌毛的收縮和釋放，增強(qiáng)與表面之間的粘附并促進(jìn)細(xì)菌之間的相互接觸。Comolli等發(fā)現(xiàn)擁有四型菌毛但菌毛無(wú)法收縮的pilT、pilU突變株對(duì)人上皮細(xì)胞和小鼠組織表面的粘附均明顯減弱[9]；2)如何進(jìn)行蹭行運(yùn)動(dòng)決定了細(xì)菌的表面擴(kuò)張能力和生物被膜的三維結(jié)構(gòu)。低流場(chǎng)下的成熟生物被膜通常以蘑菇狀的形態(tài)存在于表面，O’Toole等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌粘附到表面之后會(huì)首先形成微菌落，這些微菌落對(duì)最終的生物被膜結(jié)構(gòu)具有決定性作用，而對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行大范圍篩選發(fā)現(xiàn)無(wú)法合成四型菌毛的相關(guān)突變株無(wú)法在表面形成小菌落，最后只能形成薄薄的單層[10]。Klausen等利用熒光共聚焦的方法對(duì)生物被膜進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間跟蹤觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)蹭行運(yùn)動(dòng)突變株喪失了從微菌落向外繼續(xù)擴(kuò)散的能力，因此無(wú)法完成整個(gè)生物被膜的動(dòng)態(tài)演化過(guò)程，最終無(wú)法形成成熟生物被膜[11]。Zhao等通過(guò)細(xì)菌追蹤和Psl染色的方法證明，銅綠假單胞菌的蹭行運(yùn)動(dòng)協(xié)助細(xì)菌胞外多糖 Psl在表面上的分布并反過(guò)來(lái)引導(dǎo)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、改變粘附行為，從而導(dǎo)致微菌落的形成[12]。3)蹭行運(yùn)動(dòng)主導(dǎo)了細(xì)菌在表面上粘附之后的表型轉(zhuǎn)變。Persat等發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌粘附表面后其四型菌毛的伸縮過(guò)程啟動(dòng)了甲基化蛋白PilJ，進(jìn)而經(jīng)過(guò)cAMP、Vfr通路完成了從表面機(jī)械信號(hào)到細(xì)菌內(nèi)部基因表達(dá)信號(hào)的轉(zhuǎn)化[5]。Luo等證明PilY1蛋白可以調(diào)節(jié)環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸(c-di-GMP)的合成，同時(shí)環(huán)腺苷一磷酸(cAMP)、Vfr、AlgR路徑可調(diào)節(jié)PilY1的表達(dá)，以此將整個(gè)菌毛機(jī)械感應(yīng)機(jī)制引向c-di-GMP調(diào)節(jié)系統(tǒng)[13]。由此可見(jiàn)，蹭行運(yùn)動(dòng)既決定了生物被膜成熟結(jié)構(gòu)的形成，又在細(xì)菌粘附表面后介導(dǎo)表型轉(zhuǎn)變，對(duì)生物被膜的形成十分關(guān)鍵。有學(xué)者已經(jīng)開(kāi)始嘗試通過(guò)加入誘導(dǎo)劑和合成不同微結(jié)構(gòu)的材料來(lái)改變細(xì)菌的蹭行行為，從而達(dá)到抗菌的目的[14-15]。因此對(duì)蹭行運(yùn)動(dòng)的系統(tǒng)性表征在生物被膜構(gòu)成原理的理解及防治方法的探索中都至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的表征方法是將細(xì)菌戳到瓊脂板的底部，通過(guò)測(cè)量細(xì)菌群落邊界的大小來(lái)描述其蹭行運(yùn)動(dòng)的能力[16]。這種方法只能從宏觀上粗略地定量，無(wú)法得到蹭行運(yùn)動(dòng)的細(xì)節(jié)信息，且觀察到的菌斑是由多細(xì)菌集群化協(xié)同運(yùn)動(dòng)形成，與細(xì)致觀測(cè)的目標(biāo)相去甚遠(yuǎn)。欲深入理解蹭行運(yùn)動(dòng)如何決定生物被膜的結(jié)構(gòu)以及介導(dǎo)細(xì)菌表型轉(zhuǎn)變，必須從單細(xì)菌層面出發(fā)，對(duì)表面上細(xì)菌從粘附到長(zhǎng)成生物被膜的過(guò)程進(jìn)行長(zhǎng)期細(xì)致的跟蹤觀測(cè)和定量分析。另一種方法是選取少數(shù)細(xì)菌用顯微鏡記錄其運(yùn)動(dòng)過(guò)程，然后引入粒子追蹤算法進(jìn)行運(yùn)動(dòng)軌跡的分析[14,16]。這種方法可以在單細(xì)菌水平上定量研究蹭行運(yùn)動(dòng)，但只能進(jìn)行少量細(xì)菌的統(tǒng)計(jì)且低效費(fèi)時(shí)，更無(wú)法進(jìn)行推廣。且已有的研究發(fā)現(xiàn)蹭行運(yùn)動(dòng)具有多樣性的特點(diǎn)，在表面上細(xì)菌之間運(yùn)動(dòng)表型差距非常大，運(yùn)動(dòng)有快有慢，有站立行走有貼伏爬行，彈射運(yùn)動(dòng)或頻繁或稀少[17-19]，因此對(duì)少數(shù)細(xì)菌的觀測(cè)無(wú)法真正全面理解蹭行運(yùn)動(dòng)的本質(zhì)，必須進(jìn)行高通量統(tǒng)計(jì)分析。

我們?cè)诖私⒁惶准勺詣?dòng)化數(shù)據(jù)采集和圖像處理、圖形化輸出的方法，系統(tǒng)地描述細(xì)菌運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)軌跡、方向以及轉(zhuǎn)動(dòng)、彈射運(yùn)動(dòng)等情況。同時(shí)，改變以往的實(shí)驗(yàn)方法以實(shí)現(xiàn)大量運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)的高速采集，從而最終完成對(duì)細(xì)菌在固體表面蹭行運(yùn)動(dòng)的全面統(tǒng)計(jì)分析，并利用這一方法對(duì)群體感知機(jī)制與蹭行運(yùn)動(dòng)的關(guān)系進(jìn)行了定量表征。

1 方法

1.1 對(duì)銅綠假單胞菌在固體表面的蹭行運(yùn)動(dòng)行為進(jìn)行原位、高通量、自動(dòng)化的數(shù)據(jù)采集

1.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)中使用的菌種為銅綠假單胞菌(ATCC15692)ΔfliM和ΔfliCΔpilA菌株，均由美國(guó)圣母大學(xué)Joshua D.Shrout實(shí)驗(yàn)室提供，敲除fliM基因是為了消除細(xì)菌鞭毛對(duì)蹭行運(yùn)動(dòng)的干擾。首先從–80℃冰箱中取出凍存的菌種，在含有1.5%瓊脂的LB培養(yǎng)板上劃線，放在恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育18 h。待長(zhǎng)出菌斑后，挑一個(gè)單克隆菌斑接種于1mL限制性培養(yǎng)基FAB+30mmol/L谷氨酸鈉，在37℃恒溫條件下、200 r/min搖菌培養(yǎng)10 h。在對(duì)數(shù)期OD600約0.8收集細(xì)菌，按體積比1∶30稀釋到1mL新鮮的FAB中。LB培養(yǎng)基成分：氯化鈉10 g/L，酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L。FAB培養(yǎng)基成分：硫酸銨2 g/L，十二水合磷酸氫二鈉12 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，氯化鈉3 g/L，氯化鎂93 mg/L，二水合氯化鈣14 mg/L，二水合硫酸鈣200μg/L，七水合硫酸亞鐵200μg/L，一水合硫酸錳20μg/L，五水合硫酸銅20μg/L，七水合硫酸鋅20μg/L，七水合硫酸鈷10μg/L，鉬酸鈉 Na2MoO410μg/L，硼酸5μg/L。

連接好裝置后，向flow cell(丹麥科技大學(xué))中提供FAB+0.6mmol/L谷氨酸鈉培養(yǎng)基。在群體感知實(shí)驗(yàn)中則首先使用純化后的DMSO分別配制一級(jí)(3-oxo-C12-HSL)、二級(jí)(C4-HSL)信號(hào)分子(購(gòu)自Sigma Aldrich公司)的10mmol/L母液，按終濃度10μmol/L加入到FAB+0.6mmol/L培養(yǎng)基中。先除去裝置中的氣泡，再將稀釋好的菌液用1mL無(wú)菌注射器注入通道中，用玻璃膠黏住注菌孔。將整個(gè)裝置放在顯微鏡載物臺(tái)上靜置約20min，待玻片表面上粘附足夠數(shù)目的細(xì)菌后，快速?zèng)_走上方懸浮的細(xì)菌，然后將注射器泵流速設(shè)置為3mL/h。

1.1.2 細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)視頻的自動(dòng)化采集

在顯微鏡上加載 ZDC2連續(xù)自動(dòng)對(duì)焦防漂系統(tǒng)，保證高速拍照時(shí)焦平面的穩(wěn)定；加載Ludl XY反饋載物臺(tái)，防止樣品在水平方向的漂移；加載Tokai Hit快速反饋加熱臺(tái)以最大限度減小溫度漲落；亮場(chǎng)照明采用穩(wěn)定、可控的LED燈作為光源，并加入長(zhǎng)波濾光片以減輕光照對(duì)細(xì)菌的損傷。圖像采集使用Andor sCMOS相機(jī)，像素2560×2160，可高速地采集圖像。顯微鏡機(jī)架為Olympus IX81光學(xué)系統(tǒng)，配備100×Olympus油鏡，數(shù)值孔徑1.4。使用Andor IQ3.1軟件來(lái)集成以上設(shè)備，使各設(shè)備同步運(yùn)行。實(shí)驗(yàn)中控溫30℃，圖像采集幀率為10幀/s，先將焦面移到遠(yuǎn)離細(xì)菌的位置，拍攝一張照片作為背景圖像，用作后期的圖像校正。選定一個(gè)細(xì)菌數(shù)目適中的視野拍攝20000張照片，然后移動(dòng)到下一個(gè)視野再拍一張背景圖像，繼續(xù)拍攝20000張照片。如此重復(fù)拍照8個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每次實(shí)驗(yàn)共計(jì)可獲得10000張照片約1000個(gè)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)軌跡，將近1000萬(wàn)個(gè)瞬時(shí)速度點(diǎn)。

1.2 基于 MATLAB圖像處理平臺(tái)編寫(xiě)程序包，對(duì)蹭行運(yùn)動(dòng)原始圖像進(jìn)行高速、自動(dòng)化的定量分析

1.2.1 原始圖像的背景校正

在每個(gè)視野觀測(cè)前，首先將焦面向下方調(diào)節(jié)200μm，拍攝一張沒(méi)有細(xì)菌的照片作為背景照片，然后把所有拍攝的照片用單個(gè)視野的背景照片做除法校正。

1.2.2 細(xì)菌的識(shí)別

第一步，對(duì)背景校正后的圖像做高斯濾波，使圖像更加平滑，降低圖像噪音；第二步，用邊緣濾波器使圖像增強(qiáng)，細(xì)菌邊緣的明暗區(qū)分更顯著；第三步，用高斯濾波減小邊緣濾波造成的噪音；第四步，調(diào)節(jié)圖像的亮度閾值，把第三步得到的圖像轉(zhuǎn)化為二值圖像；第五步，根據(jù)細(xì)菌的大小，把明顯小于細(xì)菌通常尺寸的二值連通區(qū)域刪除掉，再補(bǔ)全細(xì)菌輪廓上可能的空洞。

1.2.3 圖像基本信息的獲取

MATLAB使用的是橢圓擬合的方法，根據(jù)所得的橢圓給出待測(cè)連通域的各個(gè)參數(shù)，細(xì)菌可以看作是一個(gè)長(zhǎng)圓形，橢圓擬合之后，橢圓的長(zhǎng)軸、短軸的長(zhǎng)度代表細(xì)菌的長(zhǎng)度和寬度，橢圓兩個(gè)頂點(diǎn)AB即為細(xì)菌的兩個(gè)極端的位置，橢圓的中心就是細(xì)菌的投影中心位置。橢圓的長(zhǎng)軸與水平方向的夾角(–90°?90°)即為細(xì)菌在平面上的取向角。

1.2.4 細(xì)菌的追蹤

將二值平面圖像時(shí)間序列在空間重組，生成三維圖像矩陣，再逐層掃描矩陣，確定三維空間中的連通域和連通域中的節(jié)點(diǎn)。根據(jù)三維連通性重組、拆分原始圖像，自動(dòng)生成分叉的拓?fù)鋽?shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 數(shù)據(jù)的初步篩選和減噪

首先刪除追蹤時(shí)間低于200 s的數(shù)據(jù)，這些短的數(shù)據(jù)多是由于接觸碰撞導(dǎo)致某些細(xì)菌被反復(fù)重新識(shí)別，或是細(xì)菌在將要分裂又未能完全分離時(shí)反復(fù)被識(shí)別，對(duì)統(tǒng)計(jì)分析的貢獻(xiàn)不大；然后刪除0.1 s內(nèi)細(xì)菌長(zhǎng)度變化超過(guò)10個(gè)像素的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)是由于拍照時(shí)焦面發(fā)生波動(dòng)或者細(xì)菌之間的相互接觸。篩選后記錄的位置和長(zhǎng)度數(shù)據(jù)都包含著巨大的噪音，采用小波減噪，減噪后的結(jié)果很好保留了高頻和低頻的信號(hào)。先對(duì)細(xì)菌的長(zhǎng)度、方向角、細(xì)菌中心的橫縱坐標(biāo)做小波減噪，再根據(jù)以上結(jié)果算出細(xì)菌兩端的位置，進(jìn)而完成對(duì)運(yùn)動(dòng)速度、軌跡的計(jì)算。

1.2.6 生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等各參數(shù)的計(jì)算

對(duì)端點(diǎn)軌跡坐標(biāo)做差分可得細(xì)菌兩端點(diǎn)橫縱坐標(biāo)的速度分量，合成得到速度矢量。根據(jù)細(xì)菌主軸所在的方向，將速度矢量在平行和垂直于主軸的兩個(gè)方向分解得切向速度分量和法向速度分量。對(duì)其中一個(gè)端點(diǎn)所有時(shí)刻的切向位移求和可得該細(xì)菌在觀測(cè)時(shí)間窗口內(nèi)沿著主軸方向的總位移。若該值大于零，則將該端定為頭端，反之則將另一端定為頭端。切向速度分量沿著頭端方向定為正，法向速度分量自主軸順時(shí)針?lè)较蚨檎?/p>

細(xì)菌生長(zhǎng)速率分兩類計(jì)算，對(duì)于貼伏于表面的細(xì)菌對(duì)不同時(shí)間菌長(zhǎng)值進(jìn)行線性擬合得到生長(zhǎng)速率，這種情況下傾角定為0°。對(duì)于翹起的細(xì)菌先估計(jì)其實(shí)際長(zhǎng)度，得到估計(jì)的生長(zhǎng)速率。根據(jù)細(xì)菌的長(zhǎng)度和寬度算出翹起的傾角：α=acos((le–b)/(l–b))，其中l(wèi)e為估計(jì)菌長(zhǎng)，l,b為實(shí)際觀測(cè)所得菌長(zhǎng)和菌寬。

1.2.7 對(duì)單細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)的軌跡和速度時(shí)間序列進(jìn)行分析

首先作運(yùn)動(dòng)軌跡均方末端距(MSD)與時(shí)間間隔τ的關(guān)系圖，各取對(duì)數(shù)后線性擬合得到均方末端距斜率kMSD值，作為評(píng)價(jià)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)軌跡曲折程度的參量。對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)速度矢量進(jìn)行相關(guān)性分析，計(jì)算細(xì)菌在蹭行運(yùn)動(dòng)過(guò)程中速度矢量在時(shí)間上的自相關(guān)函數(shù)數(shù)值，corrV(τ)≡，速度自相關(guān)函數(shù)用雙指數(shù)擬合之后可得特征衰減時(shí)間。

1.2.8 建立蹭行運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)庫(kù)

將所有采集到的蹭行運(yùn)動(dòng)參數(shù)抽提出來(lái)，包括運(yùn)動(dòng)速度模量、kMSD、彈射頻率、生長(zhǎng)速率、轉(zhuǎn)動(dòng)速度、行走細(xì)菌比例等，生成總數(shù)據(jù)列表。獲得數(shù)據(jù)庫(kù)之后，對(duì)各運(yùn)動(dòng)參數(shù)進(jìn)行兩兩作圖，具體做法是將限制條件之內(nèi)的數(shù)據(jù)點(diǎn)畫(huà)在二維圖上，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)菌的平均坐標(biāo)位置。然后對(duì)各數(shù)據(jù)點(diǎn)做二維高斯卷積，得到較為平滑的熱圖。此外，將所有符合條件的細(xì)菌樣本中的分布數(shù)據(jù)提取出來(lái)并加以合并，歸一化之后作速度模量分布、角度分布、速度自相關(guān)函數(shù)圖等。增加篩選功能，以比較實(shí)驗(yàn)中不同細(xì)菌群體的運(yùn)動(dòng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 蹭行運(yùn)動(dòng)速度分布的柯西擬合

首先將細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)速度在切向和法向進(jìn)行分解，如圖1A所示。然后分別計(jì)算切向速度和法向速度的概率密度分布，用柯西分布擬合。細(xì)菌在蹭行運(yùn)動(dòng)時(shí)處于小雷諾數(shù)的力學(xué)環(huán)境中，菌毛輸出功W基本上完全消耗于細(xì)菌與表面摩擦中，運(yùn)動(dòng)速度為菌毛輸出功率P與摩擦力f的比值。P和f均有符合正態(tài)分布的特性，因此運(yùn)動(dòng)速度呈柯西分布。柯西分布關(guān)系式：f(x,a,b)=b/(π(x?a)2+b2)。實(shí)驗(yàn)中我們用柯西分布中值(v||,lead,a)來(lái)描述細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的快慢程度，柯西分布半峰寬(v||,lead,b)來(lái)描述細(xì)菌運(yùn)動(dòng)速度的波動(dòng)程度。圖1A、1B為分別對(duì)切向速度和法向速度分布進(jìn)行柯西分布擬合，圖1C、1D所示為實(shí)驗(yàn)中采集到的3個(gè)不同細(xì)菌的速度分布圖及柯西分布擬合參數(shù)的比較。由圖1D可知，1號(hào)、3號(hào)細(xì)菌速度波動(dòng)較為接近，但1號(hào)細(xì)菌明顯運(yùn)動(dòng)更快；2號(hào)、3號(hào)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)速度大小接近，但2號(hào)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)速度的波動(dòng)性更大。

2.2 蹭行運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)速度矢量的自相關(guān)函數(shù)

細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)速度時(shí)間自相關(guān)函數(shù)corrV(τ)≡服從雙指數(shù)衰減(corrV(τ)=A1·exp(-τ/τ1)+ A2·exp(-τ/τ2)+A3)，做擬合之后可得特征衰減時(shí)間。如圖2A所示，該細(xì)菌運(yùn)動(dòng)速度的快衰減特征時(shí)間為0.48 s，預(yù)示著單根菌毛拉伸的持續(xù)時(shí)間。慢衰減特征時(shí)間為4.07 s，預(yù)示著多根菌毛協(xié)同拉伸的持續(xù)時(shí)間。兩衰減幅值(A1,A2)較為接近。圖2B比較了不同細(xì)菌的速度時(shí)間自相關(guān)函數(shù)，可見(jiàn)不同細(xì)菌速度衰減過(guò)程有著顯著差別。值得注意的是，細(xì)菌的自速度相關(guān)函數(shù)曲線上常出現(xiàn)箭頭所指的突出部分，在后面彈射運(yùn)動(dòng)分析時(shí)再做討論。

圖2 細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)速度矢量的時(shí)間自相關(guān)函數(shù)以及雙指數(shù)擬合.(A)單一細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)速度矢量的自相關(guān)函數(shù)以及雙指數(shù)擬合；(B)比較3個(gè)不同細(xì)菌的自相關(guān)函數(shù)，右上小圖為3個(gè)細(xì)菌各自的快衰減過(guò)程特征衰減時(shí)間(τ1).(A)、(B)圖橫坐標(biāo)為時(shí)間間隔，縱坐標(biāo)為相應(yīng)時(shí)間間隔下的速度相關(guān)函數(shù)值Fig.2 Temporal autocorrelation function of the velocity vector of bacteria twitching motility.(A)Temporal autocorrelation function and doulbe-exponential fitting of velocity vector of one single bacterial cell.(B)Comparation of temporal autocorrelation function of three differert bacteria, top right graph is the comparation of the characteristic time of fast decay process(τ1).TheXaxis of(A)and(B)is the time interval,Yaxis is the corresponding value of autocorrelation function.

2.3 多細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)的統(tǒng)計(jì)分析

建立蹭行運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)庫(kù)之后，設(shè)定不同的篩選條件可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同細(xì)菌群體的蹭行運(yùn)動(dòng)情況進(jìn)行比較。圖3A比較了細(xì)菌粘附表面之后在不同時(shí)間段的運(yùn)動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)軌跡情況。kMSD基本一致，說(shuō)明不同時(shí)間段細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)軌跡無(wú)明顯區(qū)別。但在粘附表面之初的1.6 h內(nèi)，細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)速度明顯小于后期，提示在初始粘附階段可能存在著表面適應(yīng)的過(guò)程。圖3B給出了細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)在高速區(qū)域(彈射)和低速區(qū)域(平移)的分布情況，可見(jiàn)彈射運(yùn)動(dòng)主要沿著細(xì)菌的兩側(cè)法向方向，而平移則主要沿著細(xì)菌長(zhǎng)軸方向。

圖3 多細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析.(A)對(duì)1000個(gè)細(xì)菌在粘附表面后不同時(shí)間段的蹭行運(yùn)動(dòng)速度和軌跡的統(tǒng)計(jì)分析；橫坐標(biāo)為對(duì)運(yùn)動(dòng)速度統(tǒng)計(jì)后進(jìn)行柯西分布擬合所得切向速度分量的中值，縱坐標(biāo)為對(duì)運(yùn)動(dòng)軌跡均方末端距隨時(shí)間變化在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)下線性擬合所得斜率值.(B)對(duì)1000個(gè)細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)速度矢量在高速部分(左圖)和低速部分(右圖)的統(tǒng)計(jì)熱圖.橫坐標(biāo)為細(xì)菌運(yùn)動(dòng)速度的法向分量值，縱坐標(biāo)為細(xì)菌運(yùn)動(dòng)速度的切向分量值.該熱圖是首先把所有細(xì)菌每一個(gè)時(shí)刻的運(yùn)動(dòng)速度矢量畫(huà)在平面上，然后逐個(gè)做二維高斯卷積后再累加，數(shù)值越大代表出現(xiàn)頻率越高.中間白色斑點(diǎn)為(0,0)位置Fig.3 Statistical analysis of paramers of multicellular twitching motility.(A)Statistical analysis of twitching velocity and motional tracks of1000 bacterial cells at different stage after adhesion to surface.TheXaxis is the medium value of Cauchy distribution fitting of tangential velocity,Yaxis is the linear fitting slope of MSD at bi-logarithmic coordinate.(B)Statistical heat map of twitching velocity of1000 bacterial cells at high speed scale(left map)and low speed scale(right map).TheXaxis is the normal velocity value andYaxis is the tangential velocity value.The heat map were created by first plot velocity vector at all time points of all bacteria on the map,then do Gaussian convolution for all points and accumulation, bigger value on the map represent a bigger probability of occurrence.The white spot in the center represent coordinate position(0,0).

2.4 對(duì)細(xì)菌行走過(guò)程的表征

細(xì)菌行走是指細(xì)菌其中一極上的菌毛完全釋放，另外一極的菌毛將細(xì)菌拉起來(lái)在表面上運(yùn)動(dòng)，細(xì)菌行走對(duì)生物被膜后期成熟結(jié)構(gòu)的形成有重要意義[18]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中詳細(xì)記錄了細(xì)菌行走過(guò)程以及平移和行走間的切換，如圖4A所示。細(xì)菌先是微微翹起在表面上快速平移，到2處后發(fā)生了快速的轉(zhuǎn)變，直立起來(lái)。從3到5一直處于直立狀態(tài)，6到7過(guò)程中經(jīng)歷了上下晃動(dòng)。圖4B中記錄了該過(guò)程細(xì)菌傾角的變化情況。細(xì)菌整體的運(yùn)動(dòng)速率比較大，在一個(gè)很寬的速度范圍內(nèi)波動(dòng)(圖4C)。細(xì)菌行走過(guò)程中投影長(zhǎng)度隨著細(xì)菌立起來(lái)反復(fù)搖晃而有較大波動(dòng)，在直立時(shí)投影長(zhǎng)度接近于細(xì)菌的橫截面直徑(圖4D)。

2.5 對(duì)細(xì)菌彈射運(yùn)動(dòng)的表征

細(xì)菌的彈射運(yùn)動(dòng)最早由 Jin等發(fā)現(xiàn)[17]，表面上的細(xì)菌會(huì)在兩種極為不同的運(yùn)動(dòng)模式間切換——長(zhǎng)時(shí)間的低速運(yùn)動(dòng)和短時(shí)間的高速運(yùn)動(dòng)。高速過(guò)程在幾秒內(nèi)完成，線速度高于低速模式幾十倍，并且伴隨著細(xì)菌主軸轉(zhuǎn)動(dòng)和后續(xù)運(yùn)動(dòng)方向的改變。Jin等認(rèn)為低速過(guò)程是多根菌毛合力的結(jié)果，而高速過(guò)程則是由于單根菌毛的瞬間釋放而失去力學(xué)平衡所致。實(shí)驗(yàn)中，我們將速度模量高于0.1μm/s的非翹起運(yùn)動(dòng)過(guò)程劃定為彈射運(yùn)動(dòng)。我們將彈射事件發(fā)生次數(shù)對(duì)彈射模量在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)系中作圖，發(fā)現(xiàn)一個(gè)明顯的指數(shù)衰減。如圖5A所示，隨著彈射速度模量的增加，該種彈射的出現(xiàn)次數(shù)逐漸減少，線性擬合得衰減級(jí)數(shù)為2.6。對(duì)多個(gè)細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)彈射行為都有這一指數(shù)衰減，衰減級(jí)數(shù)在2.5到3之間。這是一個(gè)典型斷裂噪音(Crackling noise)過(guò)程，在地震和鐵磁相變研究中十分常見(jiàn)。圖5B所示是將500個(gè)細(xì)菌的彈射過(guò)程合并后作出的速度方向分布圖。細(xì)菌傾向于向垂直于菌身方向或者后方彈射運(yùn)動(dòng)，從累計(jì)時(shí)間權(quán)重(左圖)和累計(jì)速度模量權(quán)重(右圖)兩張圖對(duì)比可知細(xì)菌向后彈射的幅度相對(duì)較大。以上結(jié)果還提示細(xì)菌運(yùn)動(dòng)方向后方的菌毛不易釋放。

圖5 彈射運(yùn)動(dòng)的表征.(A)雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)下的細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)過(guò)程中彈射頻率與彈射速度模量的關(guān)系圖，紅線為線性擬合結(jié)果；(B)在極坐標(biāo)下顯示對(duì)500個(gè)細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)過(guò)程中彈射運(yùn)動(dòng)方向的累計(jì)時(shí)間權(quán)重統(tǒng)計(jì)(左圖)和累計(jì)速度模量權(quán)重統(tǒng)計(jì)(右圖)，幅角數(shù)值標(biāo)注在坐標(biāo)系外圈，對(duì)應(yīng)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)引導(dǎo)點(diǎn)的速度方向.極徑數(shù)值標(biāo)記在坐標(biāo)系半徑上，對(duì)應(yīng)相應(yīng)的累計(jì)時(shí)間或累計(jì)速度模量值Fig.5 Characterization of slingshot motility.(A)bilogarithmic coordinate plot of slingshot frequency to slingshot velocity module in twitching process, red line is the linear fitting result.(B), Statistical analysis of the slingshot velocity direction with duration time weight(left)or displacement weight(right)of500 cells at polar coordinates plain.The value of arguments were labelled outside the outer ring of the coordinates, corresponding to the velocity orientation of the cell motility leading points.The value of polar radii were labelled at the radius line,corresponding to the cumulative duration time or cumulative displacement.

細(xì)菌的蹭行運(yùn)動(dòng)速度時(shí)間自相關(guān)函數(shù)常出現(xiàn)圖2B中箭頭所指的突出部分。突出部分出現(xiàn)的位置常在τ為0.9 s、1.8 s等位置，說(shuō)明蹭行運(yùn)動(dòng)速度有一定的周期性。我們仔細(xì)觀察導(dǎo)致突出部分出現(xiàn)的速度序列，發(fā)現(xiàn)其中包含很多彈射運(yùn)動(dòng)。而且正好以0.9 s為周期，且大致沿著一個(gè)方向。把彈射運(yùn)動(dòng)區(qū)域速度序列刪除后，突出部分基本消失(圖6A)。這說(shuō)明一次大的彈射過(guò)程可能包含了若干個(gè)子過(guò)程。如圖6B所示為一個(gè)細(xì)菌在200 s內(nèi)速度模量的變化情況，該細(xì)菌共經(jīng)歷了10次跳彈射過(guò)程，每次速度模量也不一致，但都有一定的周期性弛豫，持續(xù)時(shí)間約3 s。對(duì)其中一個(gè)彈射事件的速度模量放大觀察，可清楚看到其中確實(shí)包含著若干子過(guò)程，如圖6C和6D所示。

圖6 細(xì)菌彈射運(yùn)動(dòng)過(guò)程的周期性馳豫.(A)刪除彈射過(guò)程前后細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)速度時(shí)間自相關(guān)函數(shù)的變化情況，橫坐標(biāo)為時(shí)間間隔，縱坐標(biāo)為相應(yīng)時(shí)間間隔下的速度相關(guān)函數(shù)值.(B)400 s內(nèi)某一細(xì)菌的蹭行運(yùn)動(dòng)速度模量隨時(shí)間變化圖，其中速度模量大于0.1μm/s的過(guò)程被定為彈射運(yùn)動(dòng)；(C)和(D)，(B)圖中a彈射運(yùn)動(dòng)事件中速度模量和方向的詳細(xì)變化過(guò)程Fig.6 Periodic relaxation of slingshot motility.(A)Comparation of the temporal autocorrelation function of twitching velocity before and after slingshot processes removing.TheXaxis is the time interval,Yaxis is the corresponding value of autocorrelation function.(B)Time series of velocity modulus twitching motility of one single bacterial cell, the velocity modulus bigger than0.1μm/s were decided as slingshot motility.(C)and(D), detail presentation of changes of the velocity module and orientation of the slingshot event a in(B).

2.6 細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)對(duì)群體感知信號(hào)分子的響應(yīng)分析

Fuqua等首先發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中的群體感知通訊機(jī)制[20]，1998年首先發(fā)現(xiàn)群體感知信號(hào)分子合成基因缺失突變株無(wú)法產(chǎn)生正常結(jié)構(gòu)的生物被膜，且形成的平整生物被膜對(duì)十二烷基硫酸鈉的耐受性明顯減弱[21]。Bjarnsholt等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)群體感知機(jī)制大大增強(qiáng)了生物被膜對(duì)妥布霉素、過(guò)氧化氫及白細(xì)胞的耐受型[22]。此后大量研究者開(kāi)始嘗試設(shè)計(jì)針對(duì)群體感知信號(hào)分子的抑制劑來(lái)對(duì)抗生物被膜[23]，因此細(xì)菌群體感知機(jī)制的闡明對(duì)生物被膜的防治非常重要。

然而，當(dāng)前對(duì)群體感知機(jī)制與蹭行運(yùn)動(dòng)之間的關(guān)系尚不清楚，Beatson等認(rèn)為群體感知與蹭行運(yùn)動(dòng)并無(wú)關(guān)聯(lián)，他們觀察銅綠假單胞菌群體感知系統(tǒng)的多個(gè)突變株發(fā)現(xiàn)細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)行為與野生型基本一致[24]。而 Patriquin等在研究鐵元素對(duì)細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)的關(guān)聯(lián)時(shí)發(fā)現(xiàn)鐵元素的缺乏促進(jìn)蹭行運(yùn)動(dòng)，并且是通過(guò)二級(jí)群體感知系統(tǒng)rhlIR完成的[25]。后來(lái)Glick等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)rhlIR系統(tǒng)控制的鼠李糖脂的分泌促進(jìn)了細(xì)菌的蹭行運(yùn)動(dòng)[26]。由此可見(jiàn)群體感知系統(tǒng)在某些條件下會(huì)影響蹭行運(yùn)動(dòng)。我們以銅綠假單胞菌為模型，原位觀測(cè)并定量分析細(xì)菌在過(guò)量加入一級(jí)、二級(jí)群體感知信號(hào)分子下的蹭行運(yùn)動(dòng)行為。

圖7為加入不同群體感知信號(hào)分子后細(xì)菌的彈射速度分布情況，圖A顯示加入一級(jí)、二級(jí)信號(hào)分子均可增強(qiáng)細(xì)菌的彈射速度模量，圖 B顯示加入二級(jí)信號(hào)情況下細(xì)菌彈射運(yùn)動(dòng)頻率有所增加。圖C給出了細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的速率分布，加入兩種信號(hào)分子均使得細(xì)菌運(yùn)動(dòng)加快?？傮w來(lái)看，一級(jí)、二級(jí)群體感知系統(tǒng)對(duì)蹭行運(yùn)動(dòng)的影響相似，這提示群體感知可能是通過(guò)二級(jí)信號(hào)系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)蹭行運(yùn)動(dòng)的，一級(jí)系統(tǒng)通過(guò)開(kāi)啟二級(jí)系統(tǒng)而促進(jìn)蹭行運(yùn)動(dòng)，這與 Glick等的觀點(diǎn)一致。

圖7 外源加入群體感知信號(hào)分子條件下細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)比較.(A)分別加入10μmol/L一級(jí)和二級(jí)群體感知信號(hào)分子后對(duì)細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)在高速區(qū)域的統(tǒng)計(jì)分析.橫坐標(biāo)為細(xì)菌運(yùn)動(dòng)速度的法向分量值，縱坐標(biāo)為細(xì)菌運(yùn)動(dòng)速度的切向分量值.該熱圖是首先把所有細(xì)菌每一個(gè)時(shí)刻的運(yùn)動(dòng)速度矢量畫(huà)在平面上，然后逐個(gè)做二維高斯卷積后再累加，數(shù)值越大代表出現(xiàn)頻率越高.(B)統(tǒng)計(jì)加入群體感知信號(hào)分子后細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)的彈射頻率；(C)統(tǒng)計(jì)加入群體感知信號(hào)分子后細(xì)菌在高速區(qū)域的速度模量分布Fig.7 Comparation of bacterial twitching motility under addition of quorum sensing signaling molecules.(A)Statistical analysis of twitching velocity at high speed scale after addition of10μmol/L3-oxo-C12HSL or C4-HSL.TheXaxis is the normal velocity value andYaxis is the tangential velocity value.The heat map were created by first plot velocity vector at all time points of all bacteria on the map, then do Gaussian convolution for all points and accumulation,bigger value on the map represent a bigger probability of occurrence.(B)Statistical analysis of bacterial slingshot frequency after addition of quorum sensing signaling molecules.(C)Statistical analysis of twitching velocity modulus distribution at high speed scale after addition of quorum sensing signaling molecules.

3 結(jié)論

細(xì)菌的蹭行運(yùn)動(dòng)行為對(duì)其形成生物被膜具有重要的作用，對(duì)蹭行運(yùn)動(dòng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析是當(dāng)前這一領(lǐng)域的重要問(wèn)題。本文通過(guò)對(duì)多種顯微鏡硬件的集成以及自主開(kāi)發(fā)圖像處理程序?qū)崿F(xiàn)了對(duì)細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)行為的高通量、自動(dòng)化的表征，建立了一套標(biāo)準(zhǔn)化的蹭行運(yùn)動(dòng)分析工具并利用這一工具對(duì)細(xì)菌行走、彈射運(yùn)動(dòng)進(jìn)行了細(xì)致的表征，并以群體感知機(jī)制為例比較了不同條件下細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)情況。相信這一方法將為系統(tǒng)地研究蹭行運(yùn)動(dòng)分子機(jī)制以及調(diào)控原理打開(kāi)新的局面。

[1]Burrows LL.Pseudomonasaeruginosatwitching motility: type IV pili in action.Annu Rev Microbiol,2012,66(1):493–520.

[2]Bruellhoff K, Fiedler J, M?ller M, et al.Surface coating strategies to prevent biofilm formation on implant surfaces.Int J Artif Organs,2010,33(9):646–653.

[3]Parsek MR, Singh PK.Bacterial biofilms: an emerging link to disease pathogenesis.Annu Rev Microbiol,2003,57(1):677–701.

[4]Wolcott RD, Ehrlich GD.Biofilms and chronic infections.JAMA,2008,299(22):2682–2684.

[5]Persat A, Inclan YF, Engel JN, et al.Type IV pili mechanochemically regulate virulence factors inPseudomonasaeruginosa.Proc Natl Acad Sci USA,2015,112(24):7563–7568.

[6]Kilmury SLN, Burrows LL.Type IV pilins regulate their own expression via direct intramembrane interactions with the sensor kinase PilS.Proc Natl Acad Sci USA,2016,113(21):6017–6022.

[7]Anyan ME, Amiri A, Harvey CW, et al.Type IV pili interactions promote intercellular association and moderate swarming ofPseudomonas aeruginosa.Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(50):18013–18018.

[8]Oliveira NM, Foster KR, Durham WM.Single-cell twitching chemotaxis in developing biofilms.Proc Natl Acad Sci USA,2016,113(23):6532–6537.

[10]O’Toole GA, Kolter R.Flagellar and twitching motility are necessary forPseudomonas aeruginosabiofilm development.Mol Microbiol,1998,30(2):295–304.

[11]Klausen M, Heydorn A, Ragas P, et al.Biofilm formation byPseudomonasaeruginosawild type,flagella and type IV pili mutants.Mol Microbiol,2003,48(6):1511–1524.

[12]Zhao K, Tseng BS, Beckerman B, et al.Psl trails guide exploration and microcolony formation inPseudomonasaeruginosabiofilms.Nature,2013,497(7449):388–391.

[13]Luo Y, Zhao K, Baker AE, et al.A hierarchical cascade of second messengers regulatesPseudomonasaeruginosasurface behaviors.mBio,2015,6(1): e02456–14.

[14]Haley CL, Kruczek C, Qaisar U, et al.Mucin inhibitsPseudomonasaeruginosabiofilm formation by significantly enhancing twitching motility.Can J Microbiol,2014,60(3):155–166.

[15]Singh PK, Parsek MR, Greenberg EP, et al.A component of innate immunity prevents bacterial biofilm development.Nature,2002,417(6888):552–555.

[16]Oura H, Tashiro Y, Toyofuku M, et al.Inhibition ofPseudomonasaeruginosaswarming motility by1-naphthol and other bicyclic compounds bearing hydroxyl groups.Appl Environ Microbiol,2015,81(8):2808–2818.

[17]Jin F, Conrad JC, Gibiansky ML, et al.Bacteriause type-IV pili to slingshot on surfaces.Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(31):12617–12622.

火熱的背后，是截至去年底申報(bào)上來(lái)的統(tǒng)計(jì)數(shù)字，根據(jù)中國(guó)工業(yè)互聯(lián)網(wǎng)產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟（AII）發(fā)布的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我國(guó)當(dāng)前有269個(gè)平臺(tái)類產(chǎn)品，裝備、消費(fèi)品、原材料、電子信息是主要應(yīng)用方向。工信部有關(guān)負(fù)責(zé)人稱：“工業(yè)互聯(lián)網(wǎng)平臺(tái)數(shù)量快速增長(zhǎng)。目前，有一定行業(yè)區(qū)域影響力的區(qū)域平臺(tái)超過(guò)50家?！?/p>

[18]Gibiansky ML, Conrad JC, Jin F, et al.Bacteria use type IV pili to walk upright and detach from surfaces.Science,2010,330(6001):197.

[19]Ni L, Yang S, Zhang RR, et al.Bacteria differently deploy type-IV pili on surfaces to adapt to nutrient availability.npj Biof Microb,2016,2:15029.

[20]Fuqua WC, Winans SC, Greenberg EP.Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators.J Bacteriol,1994,176(2):269–275.

[21]Davies DG, Parsek MR, Pearson JP, et al.The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm.Science,1998,280(5361):295–298.

[22]Bjarnsholt T, Jensen PO, Burm?lle M, et al.Pseudomonasaeruginosatolerance to tobramycin,hydrogen peroxide and polymorphonuclear leukocytes is quorum-sensing dependent.Microbiology,2005,151(2):373–383.

[23]O’Loughlin CT, Miller LC, Siryaporn A, et al.A quorum-sensing inhibitor blocksPseudomonas aeruginosavirulence and biofilm formation.Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(44):17981–17986.

[24]Beatson SA, Whitchurch CB, Semmler ABT, et al.Quorum sensing is not required for twitching motility inPseudomonasaeruginosa.J Bacteriol,2002,184(13):3598–3604.

[25]Patriquin GM, Banin E, Gilmour C, et al.Influence of quorum sensing and iron on twitching motility and biofilm formation inPseudomonas aeruginosa.J Bacteriol,2008,190(2):662–671.

[26]Glick R, Gilmour C, Tremblay J, et al.Increase in rhamnolipid synthesis under iron-limiting conditions influences surface motility and biofilm formation inPseudomonasaeruginosa.J Bacteriol,2010,192(12):2973–2980.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Single-cell analysis method for twitching motility ofPseudomonas aeruginosa

Lei Ni1, Zhenyu Jin1, Shuai Yang1, and Fan Jin1,2
1Hefei National Laboratory for Physical Sciences at the Microscale,University of Science and Technology of China,Hefei230026,Anhui,China
2CAS Key Laboratory of Soft Matter Chemistry,University of Science and Technology of China,Hefei230026,Anhui,China

Twitching motility is very important forPseudomonas aeruginosain the adaptation of surface environment and in the3-D structure formation of mature biofilm.To quantitatively characterize twitching motilityin situ, we developed a method by combining high-throughput data acquisition, automatic image processing and database establishment.This method is based on single cell analysis and big data visualization.A periodic relaxation of0.9 second was resolved during slingshot motility analysis.Twitching motilities of bacteria under addition of two quorum sensing signaling molecules were studied, cells moved faster after signal addition.This method may help understand the molecular mechanism and regulatory circuits of twitching motility.

twitching motility, biofilm,Pseudomonas aeruginosa, new method and new technology

March31,2017;Accepted:May19,2017

Lei Ni.Tel: +86-551-63606925; E-mail: nilei@mail.ustc.edu.cn

倪磊, 金震宇, 楊帥, 等.銅綠假單胞菌蹭行運(yùn)動(dòng)單細(xì)胞分析方法的建立及應(yīng)用.生物工程學(xué)報(bào),2017,33(9):1611–1624.

Ni L, Jin ZY, Yang S, et al.Single-cell analysis method for twitching motility ofPseudomonas aeruginosa.Chin J Biotech,2017,33(9):1611–1624.

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2012CB933802), National Natural Science Foundation of China(Nos.21274141,21474098,91013009).

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2012CB933802)，國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos.21274141,21474098,91013009)資助。

時(shí)間：2017-06-19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170619.1535.002.html

倪磊 博士，2010年本科畢業(yè)于安徽大學(xué)，2016年在中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)獲博士學(xué)位，現(xiàn)在中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)微尺度國(guó)家實(shí)驗(yàn)室做博士后。主要從事銅綠假單胞菌運(yùn)動(dòng)學(xué)及細(xì)菌內(nèi)部各種信號(hào)傳導(dǎo)通路等方面的研究。