王川東，王艷，鄭悅，張坤梅，胡瑋，施文元，李越中

1 山東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100

2 加州大學(xué)洛杉磯分校 牙學(xué)院，美國 洛杉磯 CA90095

·環(huán)境生物技術(shù)·

黃色粘球菌基于復(fù)雜社會性細(xì)胞行為的生物被膜

王川東1，王艷1，鄭悅1，張坤梅1，胡瑋1，施文元2，李越中1

1 山東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100

2 加州大學(xué)洛杉磯分校 牙學(xué)院，美國 洛杉磯 CA90095

黃色粘球菌具有多樣化的細(xì)胞行為，具備典型多細(xì)胞水平的社會性特征。其形成的生物被膜是目前認(rèn)知的最為復(fù)雜的單種群細(xì)菌生物被膜之一。黃色粘球菌的社會性細(xì)胞行為主導(dǎo)了其生物被膜形成過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，包括固體介質(zhì)表面的細(xì)胞運(yùn)動、群體細(xì)胞的捕食、親緣細(xì)胞的識別、子實(shí)體的發(fā)育、粘孢子的分化以及細(xì)胞程序性死亡等行為過程。文中將介紹相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

黃色粘球菌，生物被膜，細(xì)胞行為，社會性

在自然或者人工培養(yǎng)條件下，細(xì)菌的細(xì)胞之間會互相聚集并被其自身分泌的大分子胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)包裹形成高度結(jié)構(gòu)化和群落化的生物被膜(Biofilm)[1]，該類結(jié)構(gòu)可以附著在特定介質(zhì)(Substratum)的表面或者以絮狀結(jié)構(gòu)(Flocs)懸浮于液體環(huán)境中[2]。越來越多的研究結(jié)果表明，作為細(xì)菌在自然環(huán)境中首選的生存方式，生物被膜已成為地球上分布最為廣泛并且最為成功的生物生活模式[3]；該模式無論是在內(nèi)部細(xì)胞的群體屬性、胞外基質(zhì)的理化性質(zhì)還是細(xì)胞間的相互作用等方面，均與以浮游生長(Planktonic growth)為代表的細(xì)菌自由生活(Free-living bacterial cells)模式存在著顯著的差異[2-3]。胞外基質(zhì)(ECM)，也稱為胞外聚合物(Extracellular polymeric substances)，是構(gòu)建和維持高度結(jié)構(gòu)化和整合性的生物被膜的基本物質(zhì)基礎(chǔ)，主要由胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等由細(xì)胞分泌或者滲漏到胞外的生物大分子構(gòu)成[4]。ECM 可以介導(dǎo)細(xì)胞之間以及細(xì)胞與介質(zhì)表面的粘附過程，同時提供緊密聚合的網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)用以維持生物被膜的機(jī)械穩(wěn)定性[3,5]。在生物被膜形成過程中，完成初始吸附的細(xì)菌細(xì)胞的生物學(xué)特性將發(fā)生明顯的改變，尤其是在生理響應(yīng)(Physiological responses)和發(fā)育動態(tài)(Developmental dynamics)等方面，細(xì)胞將啟動有別于單細(xì)胞狀態(tài)的另外一套基因表達(dá)策略[6]；同時，細(xì)胞之間以合作共贏的方式進(jìn)行交流、適應(yīng)與整合，通過自身的社會性表型相互影響[7]，使整個生物被膜結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成為群落化的“高等”生物。另外，自然條件下的生物被膜可以由單一種群構(gòu)成，也可以由彼此鄰近的不同種群共同構(gòu)成。在多種群生物被膜(Multi-species biofilms)中，不同種類細(xì)胞之間通過交流協(xié)作與優(yōu)勢整合增強(qiáng)了整體應(yīng)對突發(fā)事件的能力，形成了共生適應(yīng)的進(jìn)化方式[8]，這一模式的廣泛存在極大地增加了生物被膜相關(guān)研究的復(fù)雜性。

作為細(xì)菌應(yīng)對不利環(huán)境(例如捕食者、營養(yǎng)匱乏、缺氧、干旱、高溫和抗生素作用等)而進(jìn)化出的一種自我保護(hù)式生存策略[9]，生物被膜不僅對于細(xì)菌在自然條件下的存活至關(guān)重要，同時還對人類生活產(chǎn)生了廣泛的影響。臨床上的細(xì)菌耐藥性感染[10]、食品加工及儲存過程中的細(xì)菌污染[11]以及工業(yè)生產(chǎn)中的生物淤積[12]等問題很多都起源于細(xì)菌形成的難以根除的生物被膜；與此同時，在廢水處理、生物修復(fù)、電力生產(chǎn)和生物過濾等過程中，細(xì)菌的生物被膜又發(fā)揮了不可替代的作用[13]。因此，對細(xì)菌生物被膜的研究具有重要的基礎(chǔ)理論意義和廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

粘細(xì)菌(Myxobacteria)是一類革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，屬于變形菌門(Proteobacteria)的δ分支，由于其具有特殊的細(xì)胞行為(Cellular behaviors)[14]和多樣的次級代謝特征[15]而受到科研工作者們的重視，被認(rèn)為是一類由單細(xì)胞生物向多細(xì)胞生物過渡的高等原核生物類群[16]。粘細(xì)菌最初從土壤生境中分離得到，近期的分子生態(tài)學(xué)分析表明該類細(xì)菌在自然環(huán)境中廣泛存在[17]。作為粘細(xì)菌的模式種群，黃色粘球菌Myxococcus xanthus能夠行使多樣化的單細(xì)胞和社會性的多細(xì)胞行為[18]，并在此基礎(chǔ)上形成目前認(rèn)知的最為復(fù)雜的單種群細(xì)菌生物被膜之一[19-20]，是研究生物被膜理想的模式材料。本文將介紹相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

1 黃色粘球菌構(gòu)建生物被膜的基本過程

黃色粘球菌的復(fù)雜細(xì)胞行為存在于其生命周期的各個環(huán)節(jié)，參與甚至主導(dǎo)了生物被膜的形成過程。這些細(xì)胞行為大多具備多細(xì)胞水平的社會性特征，主要包括：在固體介質(zhì)表面進(jìn)行單細(xì)胞和群體細(xì)胞的運(yùn)動過程[21]；群體細(xì)胞的捕食(Predation)行為[22-23]；親緣細(xì)胞的識別能力[24]；子實(shí)體(Fruiting body)的發(fā)育和抗逆性粘孢子(Myxospore)的分化過程[25]；細(xì)胞的程序性死亡(Programmed cell death，PCD)現(xiàn)象[14,26]等。

黃色粘球菌生物被膜的形成過程十分復(fù)雜(圖1)，根據(jù)目前已有的研究結(jié)果可以描述為[16,27]：浮游狀態(tài)下的細(xì)胞通過ECM完成在固體介質(zhì)表面的穩(wěn)定吸附，并由探險(xiǎn)性運(yùn)動(Adventurous motility，A-運(yùn)動)和社會性運(yùn)動(Social motility，S-運(yùn)動)系統(tǒng)分別介導(dǎo)，在固體表面進(jìn)行單細(xì)胞和群體細(xì)胞水平的運(yùn)動，從而實(shí)現(xiàn)對于周圍環(huán)境的探索和初始的有序聚集過程[28]；在這一階段，細(xì)胞群體可以采取“狼群戰(zhàn)術(shù)”捕食其他微生物的活體細(xì)胞，從而為自身的生長和繁殖獲取營養(yǎng)[29]；在持續(xù)性的饑餓條件誘導(dǎo)下，黃色粘球菌可以識別自我細(xì)胞，并且利用運(yùn)動能力使其發(fā)生大規(guī)模的聚集；同時上調(diào)胞外基質(zhì)的合成能力，形成初始的生物被膜結(jié)構(gòu)；如果缺少外源性鈣離子，黃色粘球菌細(xì)胞將在固體介質(zhì)表面形成帶有多個凸起結(jié)構(gòu)(Mound)的較為簡單的非發(fā)育型生物被膜，也稱為饑餓誘導(dǎo)的生物被膜，該結(jié)構(gòu)的構(gòu)成細(xì)胞呈現(xiàn)出均一性并且在形態(tài)上與營養(yǎng)細(xì)胞無明顯區(qū)別；當(dāng)外源性鈣離子達(dá)到一定濃度(0.1?5mmol/L)時[30]，黃色粘球菌將激活一系列的信號過程和發(fā)育調(diào)控途徑，球狀或嵴(Ridge)狀聚集的細(xì)胞開始子實(shí)體形態(tài)構(gòu)成(Morphogenesis)和分化過程[31-32]；分泌并構(gòu)建更加結(jié)構(gòu)化的ECM，與部分細(xì)胞分化形成的“結(jié)構(gòu)細(xì)胞”一起構(gòu)建子實(shí)體的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)[33]；在發(fā)育型生物被膜形成的中后期，大量的細(xì)胞發(fā)生自溶(Autolysis)，其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞程序性死亡過程[26]；少部分的細(xì)胞在子實(shí)體結(jié)構(gòu)中發(fā)育形成休眠性的粘孢子；當(dāng)環(huán)境條件適宜時，非發(fā)育型生物被膜可以發(fā)生解聚(Dispersal)使得細(xì)胞恢復(fù)浮游狀態(tài)[34]；同時，成熟的發(fā)育型生物被膜可以通過子實(shí)體的崩解釋放粘孢子到環(huán)境中，從而進(jìn)入下一個循環(huán)周期。這一過程中涉及了復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，例如單細(xì)胞對營養(yǎng)匱乏的感應(yīng)以及應(yīng)答、群體感應(yīng)、雙組分信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄等過程，從而實(shí)現(xiàn)了在時空維度上對黃色粘球菌生物被膜形成過程的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控[35]。

2 黃色粘球菌生物被膜中高度結(jié)構(gòu)化和組織化的胞外基質(zhì)(ECM)

在黃色粘球菌的生物被膜中，ECM在菌體細(xì)胞表面和周圍空間形成了一層厚厚的絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)了細(xì)胞之間的聚集、粘連以及細(xì)胞與固體表面之間的粘附作用，為生物被膜的聚集和整合性結(jié)構(gòu)的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)[36]。黃色粘球菌的ECM主要是由胞外多糖(EPS)、蛋白質(zhì)和胞外DNA(Extracellular DNA，eDNA)組成[16]，并且通過這些大分子的復(fù)雜相互作用形成高度有序化和組織化的空間結(jié)構(gòu)，這在其發(fā)育型生物被膜中表現(xiàn)得更為突出。

圖1 黃色粘球菌構(gòu)建復(fù)雜生物被膜的基本過程Fig.1 Basic process of establishing the intricate biofilms byMyxococcus xanthus.After adherence on the solid surface,M.xanthusvegetative cells employ adventurous and social motilities in coordinated efforts to explore the surrounding environment and accomplish various tasks of their complex life cycle.Competing with other microorganisms,M.xanthuscooperatively preys on microbial cells by collectively spreading over the prey and grows on the released nutrients.Under starvation conditions,M.xanthuscells initiate and undergo an intricate process culminating in the formation of biofilms.By controlling the concentration of Ca2+in submerged cultures, simple non-developmental starvation biofilms and highly-organized developmental biofilms ofM.xanthuscan both be cultivated.With insufficient Ca2+,M.xanthuscells aggregate into ridges and mounds to form the non-developmental biofilm, which is a reversible process.At high Ca2+concentration, cells execute a complex multicellular developmental program by forming fruiting bodies, and differentiating into dormant myxospores.When the environmental condition becomes favorable, the cells inside the non-developmental biofilm disperse into planktonic state, and the developmental biofilm releases the myxospores that germinate to produce new vegetative cells for the subsequent life cycle.

2.1 胞外多糖(EPS)

EPS是黃色粘球菌 ECM的關(guān)鍵組分，構(gòu)成了生物被膜的基本骨架結(jié)構(gòu)，其基本組成單糖包括甘露糖、半乳糖、氨基半乳糖、葡萄糖、氨基葡萄糖、鼠李糖和木糖等[37]。EPS的生物合成至少包括了單糖合成、單糖裝配成多糖以及多糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面等3個步驟，由合成基因簇(eps)和相關(guān)基因簇(eas)編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶、葡聚糖酶和EPS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同系物[38]參與完成。整個過程受到多個基因位點(diǎn)的嚴(yán)格調(diào)控，例如：趨化性操縱子dif系統(tǒng)[39]和frzS基因[40]，編碼運(yùn)動蛋白的pilA基因[41]，編碼DnaK類似物的stkA[42]和sglK基因[43]等。

EPS在黃色粘球菌形成生物被膜的過程中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能。在細(xì)胞群體運(yùn)動過程中，EPS為四型菌毛(Type Ⅳ pili，TFP)提供了錨定位點(diǎn)，觸發(fā)TFP的收縮進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動[44]，并對單細(xì)胞的運(yùn)動模式產(chǎn)生深刻影響[45]。利用特異性熒光探針和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)對EPS進(jìn)行定位分析[46]發(fā)現(xiàn)，EPS在黃色粘球菌生物被膜的ECM內(nèi)部形成了基本的腳手架結(jié)構(gòu)[47]。能夠顯著影響細(xì)胞的粘附和聚集過程[4]。作為一種天然的生物吸附劑，EPS能夠有效隔離大量的鉛和銀等重金屬離子，從而避免細(xì)胞直接暴露在高濃度的有毒重金屬環(huán)境中[48-49]。當(dāng)影響EPS合成的關(guān)鍵基因缺失后，細(xì)胞的長期存活率和對不良環(huán)境因素(例如紫外照射和 SDS處理)的應(yīng)激能力也會隨之顯著下降[50]；同時，過量的EPS能夠把細(xì)胞限制在高粘度的ECM團(tuán)塊中，從而減弱了細(xì)胞的生長和分裂能力，表明在黃色粘球菌的生物被膜形成過程中相對精密的EPS生物合成調(diào)控是有必要的[50]。

2.2 胞外蛋白

在黃色粘球菌的ECM中，胞外蛋白分子的含量可達(dá)45%左右[37]，但是對其生物功能目前了解不多。在結(jié)構(gòu)層面上，胞外蛋白更多的是作為EPS的附屬分子存在，即使利用蛋白酶水解除去胞外蛋白后，黃色粘球菌依然能夠形成相對完整的生物被膜。蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定了ECM中的41個蛋白組分，其中有20個是膜蛋白或胞內(nèi)蛋白，剩余的21個被認(rèn)為可能是專一性的胞外蛋白。有5個胞外蛋白的功能得到了鑒定，包括蛋白酶、氨基水解酶和粘孢子包被蛋白等[51]。除了編碼 FibA金屬蛋白酶的fibA基因以外，其他編碼基因的失活并不影響黃色粘球菌發(fā)育型生物被膜的形成[52]。

2.3 胞外DNA(eDNA)

近年來的研究表明，eDNA積極參與了細(xì)菌生物被膜的形成和功能發(fā)揮過程，對維持生物被膜的整體穩(wěn)定和抗逆性具有非常重要的作用[53]。雖然在一些細(xì)菌生物被膜中，eDNA可能獨(dú)立存在于ECM的特定區(qū)域[54]，更多的情況是eDNA與其他胞外大分子共同構(gòu)建了復(fù)合型的ECM[55]。在黃色粘球菌的ECM 中也存在著數(shù)量可觀的eDNA，并且這些DNA分子與EPS之間存在著特異性的相互作用，從而形成了強(qiáng)度更高的復(fù)合型網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加了ECM對機(jī)械清除和表面活性劑處理的抵抗能力，并為生物被膜履行各種生物功能提供了物質(zhì)和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[56]。隨著在其他細(xì)菌類群生物被膜中獲得相似的發(fā)現(xiàn)[57-58]，eDNA-EPS之間的相互作用被認(rèn)為廣泛存在并成為DNA分子整合進(jìn)入ECM結(jié)構(gòu)中的主要介導(dǎo)作用，可以作為細(xì)菌生物被膜感染防治的重要靶點(diǎn)[59]。作為水平基因轉(zhuǎn)移(Horizontal gene transfer，HGT)所需遺傳物質(zhì)的重要來源，在自然界微生物生境中 eDNA形成了一個動態(tài)的基因庫，感受態(tài)細(xì)胞能夠通過水平基因轉(zhuǎn)移的方式獲取其中的遺傳物質(zhì)[60]。在黃色粘球菌中，只有EPS缺失突變株可以發(fā)生質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化，這不但使得黃色粘球菌成為變形菌門 δ分支中首個能夠發(fā)生自然轉(zhuǎn)化的細(xì)菌類群，還進(jìn)一步提示了EPS作為一類胞外屏障可以通過與eDNA的相互作用而抑制DNA進(jìn)入細(xì)胞的過程[61]。當(dāng)然，關(guān)于eDNA-EPS之間相互作用的物化本質(zhì)和調(diào)控過程的細(xì)節(jié)還有待進(jìn)一步研究闡明。

3 黃色粘球菌的表面運(yùn)動系統(tǒng)

運(yùn)動能力是眾多細(xì)菌在進(jìn)化初期就形成的一種用于趨利避害的細(xì)胞行為，這對于它們在自然環(huán)境中的生長和存活至關(guān)重要。在初始的海洋環(huán)境中，基于鞭毛(Flagella)旋轉(zhuǎn)的泳動(Swimming)行為在細(xì)菌運(yùn)動中占了主導(dǎo)地位，但卻不適用于高粘度的液體或者含水量較少的固體生境[62]。因此，在生物被膜形成過程中，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的有效聚集主要借助細(xì)胞在固體表面不依賴鞭毛的運(yùn)動能力，例如銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa的顫動(Twitching motility)[63]。黃色粘球菌則進(jìn)化出了在固體表面沿著其長軸方向遷移的兩個相對獨(dú)立的運(yùn)動系統(tǒng)：介導(dǎo)細(xì)胞個體獨(dú)立運(yùn)動的探險(xiǎn)性運(yùn)動系統(tǒng)(A-運(yùn)動)和介導(dǎo)細(xì)胞群體聚集及菌落擴(kuò)展的群體性運(yùn)動系統(tǒng)(S-運(yùn)動)[28]。兩個系統(tǒng)均通過Frz化學(xué)感應(yīng)信號通路調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動過程中的方向反轉(zhuǎn)(Reversal)而實(shí)現(xiàn)趨化性過程[64-65]。

A-運(yùn)動系統(tǒng)可以驅(qū)動單個黃色粘球菌細(xì)胞在固體表面進(jìn)行不依賴于細(xì)胞外附屬性推進(jìn)器的平滑運(yùn)動，因而被認(rèn)為是真正意義上的滑行運(yùn)動(Gliding motility)[66]。關(guān)于A-運(yùn)動的分子機(jī)制，存在著不同的理論模型[21]，其中的焦點(diǎn)粘附模型(Focal adhesion model)[67]和螺旋轉(zhuǎn)子模型(Helical rotor model)[68]獲得了更多實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持。S-運(yùn)動系統(tǒng)主要介導(dǎo)了黃色粘球菌細(xì)胞在固體表面的群體運(yùn)動過程，在運(yùn)動機(jī)制上與顫動系統(tǒng)非常類似[66]。Shi等提出的S-運(yùn)動模型被廣泛接受[44,69-70]：首先，細(xì)胞通過 TFP系統(tǒng)的兩個ATP酶PilB和PilT催化位于單極的菌毛蛋白(Pilin)PilA的聚合和解聚，從而實(shí)現(xiàn)TFP蛋白細(xì)絲的延伸和收縮；胞外基質(zhì)的EPS部分為TFP的收縮提供了一個特異性的錨定位點(diǎn)；進(jìn)行S-運(yùn)動時，細(xì)胞前導(dǎo)端伸出的TFP細(xì)絲抓住附近細(xì)胞產(chǎn)生的EPS并激發(fā)收縮，從而拉動細(xì)胞以粘-滑(Stick-slip)交替的方式前進(jìn)；當(dāng)細(xì)胞通過反轉(zhuǎn)改變運(yùn)動方向時，TFP的產(chǎn)生端在化學(xué)感應(yīng)系統(tǒng) Frz的調(diào)控下發(fā)生切換；同時，對于EPS的強(qiáng)烈依賴使得黃色粘球菌在固體表面進(jìn)行S-運(yùn)動時，細(xì)胞必須以群體方式進(jìn)行。

黃色粘球菌同時擁有的兩套相對獨(dú)立的表面運(yùn)動系統(tǒng)在細(xì)菌中是不常見的，它們在形成生物被膜過程中是否存在著功能分化是一個重要的科學(xué)問題。在相對堅(jiān)硬、干燥的支持介質(zhì)上，黃色粘球菌主要依賴于 A-運(yùn)動系統(tǒng)驅(qū)動菌落(Swarm)外單個細(xì)胞的位移[71]，其生物被膜的整體擴(kuò)展能力和菌落外新聚集結(jié)構(gòu)的形成能力受到明顯抑制。在柔軟、濕潤的支持介質(zhì)上，S-運(yùn)動系統(tǒng)主導(dǎo)了黃色粘球菌細(xì)胞的群組化擴(kuò)展[71]，從而使得生物被膜的形成能力大大提高。在浸潤于液體中的固體表面上，細(xì)胞完全吸附的要求使得 A-運(yùn)動系統(tǒng)不再發(fā)揮作用，黃色粘球菌只使用S-運(yùn)動系統(tǒng)驅(qū)動細(xì)胞的聚集和擴(kuò)散[69]；與此同時，部分細(xì)胞還可以擺脫對于EPS的依賴，進(jìn)行單細(xì)胞水平的S-運(yùn)動過程，從而實(shí)現(xiàn)對新環(huán)境的快速探索[72]。更為重要的是，S-運(yùn)動過程中TFP-EPS的特異性相互作用可以對細(xì)胞的定位進(jìn)行引導(dǎo)，使得細(xì)胞群體更有效地聚集從而形成初始的生物被膜結(jié)構(gòu)[45,72]。在生物被膜內(nèi)部，ECM在EPS的主導(dǎo)下可以形成蜂窩樣的微管道結(jié)構(gòu)，作為TFP結(jié)合和收縮的錨定位點(diǎn)，通過引導(dǎo)細(xì)胞的S-運(yùn)動形成特定的ECM-細(xì)胞空間分布[73]。除了EPS以外，黃色粘球菌的S-運(yùn)動也受到環(huán)二鳥苷酸(Bis-(3′-5′)-cyclic dimeric guanosine monophosphate，c-di-GMP)的調(diào)控。高濃度的c-di-GMP會減少pilA基因的轉(zhuǎn)錄并降低TFP的組裝，從而抑制依賴于TFP的S-運(yùn)動過程。這在一定程度上解釋了成熟的生物被膜中，高細(xì)胞濃度的區(qū)域細(xì)胞運(yùn)動減弱并且被膜結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定的現(xiàn)象[74]。因此，獨(dú)立存在并且協(xié)調(diào)運(yùn)作的雙運(yùn)動系統(tǒng)使得黃色粘球菌在不同培養(yǎng)條件下能夠有效聚集并形成生物被膜，顯著提升了其對復(fù)雜自然環(huán)境的適應(yīng)能力。

4 黃色粘球菌的群體捕食行為

黃色粘球菌是細(xì)菌中捕食類群的典型代表，可以把多種原核生物和少數(shù)高等的真核生物作為獵食目標(biāo)[75]。當(dāng)黃色粘球菌形成非發(fā)育型的生物被膜后，以“狼群戰(zhàn)術(shù)”為策略的群體捕食過程變得更加高效[29]。處于生物被膜內(nèi)部的細(xì)胞呈漣漪狀(Ripple)進(jìn)行群體擴(kuò)展和搜尋，并保持與被捕食對象在細(xì)胞數(shù)量上的相對優(yōu)勢[76]。黃色粘球菌龐大的基因組能夠編碼產(chǎn)生豐富的降解酶和具有抗細(xì)/真菌活性的抗生素[77]，通過外膜囊泡(Outer membrane vesicles)的包裹分泌到胞外[78]，從而成為其在捕食過程中的有效武器。在生物被膜結(jié)構(gòu)中，通過電鏡觀察，外膜囊泡的數(shù)量大大增加，并在胞外形成高度有序的囊泡鏈連接生物被膜內(nèi)相鄰的細(xì)胞[78]。在液體環(huán)境中，黃色粘球菌對于大腸桿菌的捕食呈現(xiàn)出細(xì)胞接觸的依賴性，捕食者與獵物之間可以共同聚集形成懸浮于液體的特殊生物被膜。如果黃色粘球菌的EPS產(chǎn)生能力下降，無法形成生物被膜，其捕食大腸桿菌的能力也會大大減弱[79]。

5 黃色粘球菌親緣識別與群體感應(yīng)系統(tǒng)

在一般的培養(yǎng)條件下，黃色粘球菌極少與其他類群細(xì)菌形成混合的生物被膜，這可能取決于其扮演的捕食者角色。但是，即使是近緣的不同粘球菌或者黃色粘球菌的不同分離株也很難形成混合的生物被膜或者是復(fù)合的子實(shí)體結(jié)構(gòu)。例如，將黃色粘球菌與變綠粘球菌Myxococcus virescens混合后，它們的細(xì)胞各自發(fā)生聚集并獨(dú)立形成純合的子實(shí)體，并且其中一個菌株的生孢率被一定程度地抑制[80]。隨后的研究表明，在黃色粘球菌中可能存在多個進(jìn)行自我/非我細(xì)胞的識別(Self/non-self recognition)機(jī)制，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)種群的領(lǐng)地化和生殖分割(Reproductive segregation)。對于非同類細(xì)胞，黃色粘球菌通常以抑制或者菌落不融合的策略將它們排除在自己形成的生物被膜之外[81]，但這一過程的具體機(jī)制仍然未知。當(dāng)黃色粘球菌發(fā)生突變喪失形成發(fā)育型生物被膜和粘孢子的能力后，極少數(shù)的突變株可以作為欺騙者(Cheater)坐享野生株間的細(xì)胞通訊和公共資源，獲得接近原始狀況下的生孢率[82]。當(dāng)然，這種欺騙行為一旦蔓延開來有可能導(dǎo)致整個群體的衰退和滅亡。對于同類細(xì)胞，黃色粘球菌可以通過細(xì)胞間的物理性接觸并在TraA/B系統(tǒng)介導(dǎo)下進(jìn)行外膜層交換[83]，實(shí)現(xiàn)各自私有資產(chǎn)的雙向共享[84-85]，這在同類細(xì)胞形成的生物被膜中可能是一個廣泛進(jìn)行的生物過程。

群體感應(yīng)(Quorum sensing)系統(tǒng)在細(xì)菌生物被膜的形成和解聚過程中發(fā)揮了重要作用[86]，但是人們對于黃色粘球菌中的群體感應(yīng)系統(tǒng)知之甚少。在形成發(fā)育型生物被膜過程中，由多種特定濃度混合氨基酸構(gòu)成的A-信號曾被認(rèn)為可以作為群體感應(yīng)的信號，但是后續(xù)的研究更多地證實(shí)了其作為饑餓誘導(dǎo)信號的功能[87]，在細(xì)胞密度感知方面沒有得到有力的證據(jù)支持。高絲氨酸內(nèi)酯類(Acyl-homoserine lactones，AHLs)化合物是革蘭氏陰性細(xì)菌常用的群體感應(yīng)信號分子[88]。黃色粘細(xì)菌自身不合成AHLs，但是卻能對鄰近獵物細(xì)胞所釋放的AHLs進(jìn)行響應(yīng)，刺激細(xì)胞的運(yùn)動并加速向獵物細(xì)胞的入侵，整個群體的捕食能力也隨之提高。同時，黃色粘球菌對 AHLs側(cè)鏈的長度呈現(xiàn)出非線性依賴，說明對 AHLs的響應(yīng)是由自身特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所介導(dǎo)的而與AHLs自身物化性質(zhì)無關(guān)[89]。

6 黃色粘球菌的分化發(fā)育

在持續(xù)性饑餓誘導(dǎo)并存在充足的外源性鈣離子條件下，黃色粘球菌的非發(fā)育型生物被膜開始進(jìn)入分化發(fā)育階段，并最終形成發(fā)育型的子實(shí)體結(jié)構(gòu)[33]。細(xì)胞進(jìn)一步從四周開始向中央發(fā)生不可逆的聚集和互相堆積，形成圓頂狀凸起；原始未分化的細(xì)胞堆中細(xì)胞有序地重排或成串排列，由ECM介導(dǎo)形成特定形狀的子實(shí)體；柄和孢子囊壁等特殊結(jié)構(gòu)組分逐漸形成；子實(shí)體內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生分化，大部分細(xì)胞在堆積過程中會進(jìn)入 PCD過程，只有約5%的桿狀營養(yǎng)細(xì)胞會完成分化形成的球形粘孢子；同時，大約占總數(shù)15%的細(xì)胞依然以桿狀的形式圍繞在子實(shí)體周圍，這或許是黃色粘球菌為了在營養(yǎng)恢復(fù)時能夠快速地利用營養(yǎng)和解聚生物被膜而進(jìn)化出的應(yīng)對策略[35]。在這一復(fù)雜的形態(tài)轉(zhuǎn)變過程中，涉及多個信號調(diào)控系統(tǒng)。

從目前的結(jié)果來看，至少有A(asg)、B(bsg)、C(csg)、D(dsg)和E(esg)五類信號分子在黃色粘球菌分化發(fā)育過程中起到了核心作用[32]。A信號作為營養(yǎng)條件的感應(yīng)信號，在細(xì)胞饑餓2 h后(發(fā)育早期)開始感知饑餓狀態(tài)并可能調(diào)控細(xì)胞密度的感應(yīng)。在A信號通路中，asgA基因編碼的雜交傳感激酶N端具有RR結(jié)構(gòu)域，C端具有能夠自磷酸化的HK結(jié)構(gòu)域；asgB基因編碼DNA結(jié)合蛋白；asgC基因編碼的σ70(RpoD)同系物能夠與(p)ppGpp互相作用。B信號通路的bsgA基因編碼ATP依賴的蛋白酶，參與熱激、營養(yǎng)枯竭等脅迫條件的應(yīng)答，其突變體在細(xì)胞聚集和孢子形成方面存在缺陷，在饑餓后約2 h表現(xiàn)出早期發(fā)育的停滯。雖然 B信號的生化特征和受體蛋白目前尚不清楚，但是可以確定的是當(dāng)B信號產(chǎn)生之后，A信號便開始在胞內(nèi)累積，B信號同時參與了下游 C信號調(diào)控的多個過程。C信號在細(xì)胞饑餓6 h后開始應(yīng)答，以劑量依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞聚集、發(fā)育基因的表達(dá)和子實(shí)體的形成。與A信號類似，C信號需要嚴(yán)謹(jǐn)型反應(yīng)的調(diào)控，并依賴于csgA基因編碼的短鏈乙醇脫氫酶同源蛋白發(fā)揮功能。關(guān)于D信號的研究相對較少，但是dsg基因編碼的翻譯起始因子在發(fā)育過程中至關(guān)重要，其突變體在饑餓后5 h表現(xiàn)出發(fā)育的停滯。E信號的esg基因則編碼支鏈酮酸脫氫酶，參與黃色粘球菌脂質(zhì)/膜等多種不同代謝途徑，相關(guān)突變體同樣表現(xiàn)出早期發(fā)育的停滯[32]。

黃色粘球菌對于饑餓信號的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)可導(dǎo)致(p)ppGpp的累積[35]并激活特定的雙鳥苷酸環(huán)化酶，使得細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平顯著提升，這對后續(xù)的發(fā)育過程至關(guān)重要。降低c-di-GMP的濃度會引起發(fā)育過程中的非自主性EPS累積缺陷，影響最終的子實(shí)體構(gòu)建[90]。這些第二信使類分子可以進(jìn)一步起始后續(xù)的由一系列相互關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄激活因子構(gòu)建的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(Gene regulatory networks，GRNs)[35]。在這一網(wǎng)絡(luò)中，存在一個信號應(yīng)答增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(Signal-responsive enhancer-binding proteins，EBPs)級聯(lián)系統(tǒng)和一個由轉(zhuǎn)錄因子 MrpC與FruA主導(dǎo)的對饑餓及短程C信號進(jìn)行響應(yīng)的級聯(lián)系統(tǒng)。這兩個系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平上相互交聯(lián)，并且通過MrpC與FruA蛋白協(xié)同結(jié)合在多個啟動子區(qū)域而實(shí)現(xiàn)信息集成(Signal integration)。為了保證多細(xì)胞分化發(fā)育過程的實(shí)現(xiàn)，黃色粘球菌進(jìn)化出了一套獨(dú)特的GRNs，比芽孢桿菌Bacillus和鏈霉菌Streptomyces生孢過程的GRNs更為復(fù)雜和高等。

形成富含抗逆性粘孢子的子實(shí)體是黃色粘球菌分化發(fā)育的終極目標(biāo)，也是黃色粘球菌適應(yīng)自然環(huán)境的一種生存策略。子實(shí)體的形成保證了黃色粘球菌在陸地環(huán)境中起始一個新的生命周期時所需的高細(xì)胞密度。但是，只有少數(shù)營養(yǎng)細(xì)胞能夠最后分化形成粘孢子，大量的細(xì)胞在發(fā)育型生物被膜的形成后期發(fā)生了自溶現(xiàn)象，其實(shí)質(zhì)是進(jìn)行了PCD過程。據(jù)報(bào)道，在黃色粘球菌 DZF1菌株中，PCD過程是由MazF/MrpC毒素-抗毒素系統(tǒng)所介導(dǎo)。mazF基因編碼的mRNA干擾酶能夠特異性識別 ACA序列并對胞內(nèi)mRNA進(jìn)行切割，從而有效抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白的合成和細(xì)胞生長[26]。但是后續(xù)的研究表明，mazF基因并非參與了所有黃色粘球菌的PCD過程。例如，將mazF基因敲除后，黃色粘球菌DK1622菌株的PCD現(xiàn)象并沒有消失，并且MazF只作為mRNA轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控因子發(fā)揮功能[91]。

7 小結(jié)與展望

黃色粘球菌能夠形成復(fù)雜的單種群細(xì)菌生物被膜以適應(yīng)不同的外界環(huán)境條件，其復(fù)雜性不僅表現(xiàn)在生物被膜的結(jié)構(gòu)、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和不同途徑的選擇等方面，更體現(xiàn)在驅(qū)動形成過程的各種細(xì)胞行為方面。細(xì)胞在群體水平上實(shí)現(xiàn)了親緣識別、相互協(xié)作、分工分化以及異類競爭等不同功能，使得黃色粘球菌的細(xì)胞行為大多具備了多細(xì)胞水平的社會性特征，并與真核生物顯示出很多相似性，成為一類“高等”的原核生物。將黃色粘球菌作為一個研究模式系統(tǒng)，不僅有利于進(jìn)一步揭示細(xì)菌生物被膜所涉及的復(fù)雜分子機(jī)制，更有可能在進(jìn)化水平深刻理解多細(xì)胞真核生物中協(xié)作性結(jié)構(gòu)的發(fā)生與分化過程。

對于黃色粘球菌的生物被膜，尚有大量的具備重要科學(xué)意義的問題有待回答。在其生物被膜形成過程中，作為控制系統(tǒng)的GRNs需要進(jìn)一步闡明，了解其中的一些關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和調(diào)控分子的作用機(jī)制，回答細(xì)胞怎樣感知饑餓信號并進(jìn)行放大、細(xì)胞如何決定其最終命運(yùn)以及分化細(xì)胞如何進(jìn)行行為協(xié)調(diào)等基礎(chǔ)問題，從而將單細(xì)胞行為與多細(xì)胞的分化模式建立可靠的理論聯(lián)系。同時，黃色粘球菌的眾多細(xì)胞行為都呈現(xiàn)出接觸依賴性(Contact-dependent manner)，既包括細(xì)胞-細(xì)胞接觸類行為，例如親緣細(xì)胞識別、捕食行為和C信號傳遞等過程，又包括細(xì)胞-基質(zhì)接觸類行為，例如A-運(yùn)動和細(xì)胞粘附等過程。因此，對于黃色粘球菌細(xì)胞外膜層及其附屬結(jié)構(gòu)的詳細(xì)表征將有利于深入了解其生物被膜中發(fā)生的細(xì)胞溝通和社會性行為協(xié)調(diào)機(jī)制。最后，黃色粘球菌能夠產(chǎn)生復(fù)合型的多功能性ECM，其中生物大分子之間的相互作用機(jī)理對于研究生物被膜形成尤為重要。例如：eDNA可能以一種物理有序的方式與 EPS緊密交織并相互作用，從而在ECM中遵循類似的構(gòu)建和分布模式，但我們對這一作用的化學(xué)機(jī)制和兩種大分子的結(jié)構(gòu)構(gòu)建過程了解不多；通過TFP-EPS相互作用引導(dǎo)的S-運(yùn)動，黃色粘球菌可以實(shí)現(xiàn)生物被膜中的細(xì)胞聚集和定位，然而保證這一識別過程中的特異性分子基礎(chǔ)依然未知。由于 EPS、eDNA和 TFP在多個能夠形成生物被膜的病原細(xì)菌類群中廣泛存在，相關(guān)的結(jié)果還可以為生物被膜感染的防治提供有價(jià)值的線索。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Biofilm formation dominated by sophisticated social behaviors inMyxococcus xanthus

Chuandong Wang1, Yan Wang1, Yue Zheng1, Kunmei Zhang1, Wei Hu1, Wenyuan Shi2,and Yuezhong Li1
1State Key Laboratory of Microbial Technology,School of Life Sciences,Shandong University,Jinan250100,Shandong,China
2School of Dentistry,University of California,Los Angeles,CA90095,USA

Myxococcus xanthusis a Gram-negative soil bacterium capable of performing sophisticated cellular behaviors and growing one of the most intricate bacterial single-species biofilms in nature.During the process of biofilm formation,social behaviors ofM.xanthuscells dominate key steps of the biofilm establishment,e.g., cellular motility on solid surface,predatory behavior by the grouped cells, kin recognition in the community, fruiting body development, myxospore differentiation, and programmed cell death.This review introduces the recent research progress about theM.xanthusbiofilms.

Myxococcus xanthus, biofilm, cellular behavior, sociality

May15,2017;Accepted:June27,2017

Wei Hu.Tel/Fax: +86-531-88364288; E-mail: hw_1@sdu.edu.cn

王川東, 王艷, 鄭悅, 等.黃色粘球菌基于復(fù)雜社會性細(xì)胞行為的生物被膜.生物工程學(xué)報(bào),2017,33(9):1582–1595.

Wang CD, Wang Y, Zheng Y, et al.Biofilm formation dominated by sophisticated social behaviors inMyxococcus xanthus.Chin J Biotech,2017,33(9):1582–1595.

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.31570065,31370110), China Postdoctoral Science Foundation Grant(No.2016M592177), Shandong Innovation and Transformation of Achievements Grant(No.2014ZZCX02601).

國家自然科學(xué)基金(Nos.31570065,31370110)，中國博士后科學(xué)基金(No.2016M592177)，山東省科技重大專項(xiàng)(No.2014ZZCX02601)資助。

時間：2017-08-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170804.1028.002.html

胡瑋 山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師，微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任助理，中國微生物學(xué)會基礎(chǔ)微生物學(xué)專業(yè)委員會委員。主要研究領(lǐng)域包括粘細(xì)菌細(xì)胞行為過程、生物膜構(gòu)建、次級代謝產(chǎn)物和微生物肥料研發(fā)等。迄今已發(fā)表論文50余篇，其中SCI收錄30多篇；參與撰寫學(xué)術(shù)專著4部；申請專利28項(xiàng)，其中已有11項(xiàng)獲得授權(quán)；多次受邀在本領(lǐng)域國際學(xué)術(shù)年會上作大會報(bào)告。主持國家863計(jì)劃、國家自然基金面上項(xiàng)目以及山東省重大科技專項(xiàng)等科研課題8項(xiàng)，并與國內(nèi)外的多個企業(yè)合作進(jìn)行項(xiàng)目研究。