□ 劉海英 烏蘭察布職業(yè)學(xué)院 俎愛忠 烏蘭察布市產(chǎn)品質(zhì)量計(jì)量檢測(cè)所 陳建保 烏蘭察布職業(yè)學(xué)院 張 浩 烏蘭察布市產(chǎn)品質(zhì)量計(jì)量檢測(cè)所 康 俊 烏蘭察布職業(yè)學(xué)院 景思遠(yuǎn) 烏蘭察布市產(chǎn)品質(zhì)量計(jì)量檢測(cè)所

HRP-H2O2-OPDA化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)馬鈴薯重花葉病毒

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基于酶聯(lián)免疫分析法，利用生物標(biāo)記物辣根過氧化物（HRP）標(biāo)記馬鈴薯重花葉病毒抗原，結(jié)合H2O2–鄰苯二胺催化氧化反應(yīng)體系，建立了一種高靈敏度的HRP-H2O2-OPDA化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)馬鈴薯重花葉病毒方法。結(jié)果表明：該酶聯(lián)免疫傳感器對(duì)馬鈴薯重花葉病毒檢測(cè)的動(dòng)態(tài)響應(yīng)為0.000 1～0.5 μg/mL，檢測(cè)限為0.030 ng/mL（S/N=3），定量限為0.100 ng/mL（S/N=10），回收率在86.8%～101.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.3%～2.4%；其他馬鈴薯病毒對(duì)該傳感器的干擾較小，表現(xiàn)出良好選擇特異性。該方法簡便、靈敏、選擇性高，可為馬鈴薯重花葉病毒檢測(cè)提供新途徑。

辣根過氧化物酶；化學(xué)發(fā)光；酶聯(lián)免疫；馬鈴薯；重花葉病毒

馬鈴薯病毒病是馬鈴薯生產(chǎn)過程中常見的病害，而被病毒侵染后的馬鈴薯會(huì)種性退化，導(dǎo)致減產(chǎn)或品質(zhì)下降等問題，其危害已成為制約馬鈴薯生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。據(jù)報(bào)道，可侵染馬鈴薯的病毒有20余種[1]，在我國傳播范圍大、侵染力度強(qiáng)的病毒包括馬鈴薯普通花葉病毒（PVX）、馬鈴薯重花葉病毒（PVY）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）、馬鈴薯S病毒（PVS）、馬鈴薯M病毒（PVM）和馬鈴薯A病毒（PVA）等[2]。馬鈴薯生產(chǎn)中病毒病一旦發(fā)生，沒有很好的防治辦法。因此，尋找一種有效的病毒檢測(cè)方法對(duì)控制該病毒至關(guān)重要。

目前，關(guān)于馬鈴薯病毒檢測(cè)方法主要有指示植物法、分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法。其中，指示植物法檢測(cè)準(zhǔn)確、直觀、易于操作，但耗時(shí)長，現(xiàn)已不能適應(yīng)生產(chǎn)需要；分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有靈敏、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但容易出現(xiàn)假陽性、檢測(cè)費(fèi)用較高；而免疫學(xué)檢測(cè)手段對(duì)操作人員水平要求低、檢測(cè)速度快、靈敏高和適用批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，是目前馬鈴薯病毒篩查的主要檢測(cè)手段，尤其是辣根過氧化物（HRP）基型酶聯(lián)免疫分析法為新型分析方法[2]。本文利用HRP作為生物標(biāo)記物可標(biāo)記在病毒抗原的表面，再利用其對(duì)H2O2–鄰苯二胺（OPDA）體系的催化氧化行為，建立了一種高靈敏度的HRP-H2O2-OPDA化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)馬鈴薯重花葉病毒方法，該法具有操作簡單、檢出限低、精密度高等特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器

MPI-A型多功能化學(xué)發(fā)光分析儀（西安瑞邁分析儀器有限公司）、F-4600型熒光分光光度計(jì)（日立高新技術(shù)公司）、ME204型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）、GSP-9160MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、96孔單條可拆化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板（生工生物工程（上海）股份有限公司）和Bio_rad 550型酶標(biāo)儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司）。1.2 試劑

過氧化草酸酯（TCPO），3-(4-羥苯基)丙酸（PHPPA）購買于百靈威（美國）。胎牛血清（FBS）來自Hyclone（美國）。3,3′,5,5′－四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、吐溫-20、過氧化尿（CH4N2O?H2O2）和辣根過氧化物酶（HRP），均采購于Sigma公司。咪唑，購自武漢康隆世紀(jì)科技發(fā)展有限公司。乙醇、乙腈、乙醇、H2O2、NaCl、KCl、Na2B4O7·10H2O、Na-2CO3、CH3COONa、NaHCO3、KH-2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、H3BO3、C6H4(COO)2HK、NaH-2PO4·2H2O、C6H8O7·H2O 和三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷（Tris），均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）。1.3 酶催化

取96孔微型酶標(biāo)儀板，每孔中定量加入 25 μg/mL 抗體 20 μL，37 ℃孵育0.5 h，使用PBST溶液洗去酶標(biāo)儀板未鍵合的抗體；每孔加入0.1% BSA 80 μL進(jìn)行封閉，37 ℃孵育30 min后，PBST溶液洗去未鍵合的BSA。每孔加入50 μL一定濃度的馬鈴薯重花葉病毒（PVY），37 ℃孵育30 min，PBST溶液洗去未鍵合的馬鈴薯重花葉病毒（PVY），然后酶標(biāo)儀板每孔中加入0.5 mg/mL HRP 10 μL，室溫靜止吸附30 min，使用PBST溶液洗去酶標(biāo)儀板上未鍵合的HRP，晾干備用。

1.4 光化學(xué)反應(yīng)

將過氧化尿和PHPPA混合使其終濃度為5.0 mmol/L，加入到96孔微型酶標(biāo)儀板中，每孔50 μL，渦旋混勻，37 ℃孵育10 min，標(biāo)記的HRP分子與H2O2–OPDA體系發(fā)生催化氧化，使其發(fā)生顯色反應(yīng)，呈現(xiàn)出顏色變化和熒光反應(yīng)，再利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其檢測(cè)熒光強(qiáng)度，從而測(cè)定馬鈴薯重花葉病毒含量。具體實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶聯(lián)免疫光化學(xué)傳感器原理

從圖1中可知，本文建立的HRP-H2O2-OPDA化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)馬鈴薯重花葉病毒方法是基于H2O2–鄰苯二胺（OPDA）體系的催化氧化行為，利用HRP作為生物標(biāo)記物可標(biāo)記在馬鈴薯重花葉病毒抗原的表面，且HRP能增大H2O2–OPDA體系的顯色反應(yīng)和熒光效應(yīng)，具有較高的選擇特異性和靈敏度。

2.2 pH值對(duì)HRP酶催化反應(yīng)的影響

在HRP酶催化反應(yīng)中，緩沖溶液的pH值對(duì)HRP-H2O2-OPDA化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)馬鈴薯重花葉病毒影響較大，尤其是磷酸鹽緩沖溶液影響H2O2–鄰苯二胺（OPDA）體系的催化氧化反應(yīng)，當(dāng)磷酸鹽緩沖溶液pH在4.0～6.0時(shí)，隨著緩沖溶液pH值的增大，生產(chǎn)的熒光強(qiáng)度逐漸增加；當(dāng)pH值為6.0時(shí)，熒光強(qiáng)度最大；當(dāng)pH在6.0～11.0時(shí)，熒光強(qiáng)度隨著pH增加而減少。因此，為了獲得較高的熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性，酶催化反應(yīng)pH值應(yīng)選擇pH值為6.0的磷酸鹽緩沖溶液。

2.3 孵育溫度和孵育時(shí)間對(duì)HRP酶催化反應(yīng)的影響

考察了不同的孵育時(shí)間和孵育溫度對(duì)HRP酶催化反應(yīng)的影響。研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)孵育溫度為37 ℃時(shí)，HRP酶催化反應(yīng)效果最佳；但當(dāng)溫度高于37 ℃或低于37 ℃時(shí)，HRP酶催化反應(yīng)效果不佳，且HRP催化H2O2–OPDA體系的顯色反應(yīng)和熒光效應(yīng)較差，熒光強(qiáng)度較低。當(dāng)以孵育溫度為37 ℃時(shí)，隨著孵育時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增大；當(dāng)孵育時(shí)間為30 min，熒光強(qiáng)度最大；當(dāng)孵育時(shí)間超過30 min后，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)漸弱趨勢(shì)。因此，選擇孵育溫度為37 ℃，孵育時(shí)間選擇10 min。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

2.4 溶劑對(duì)HRP酶催化反應(yīng)的影響

考察了甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、正丁醇、叔丁醇、乙酸乙酯和四氫呋喃等不同有機(jī)溶劑對(duì)HRP酶催化反應(yīng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，馬鈴薯重花葉病毒在非極性溶劑中溶解度較小，HRP催化H2O2–OPDA體系的顯色反應(yīng)和熒光效應(yīng)較差。但當(dāng)反應(yīng)體系中有水存在時(shí)，顯色反應(yīng)和熒光效應(yīng)較強(qiáng)，尤其是當(dāng)使用體積比為90%的乙腈作為溶劑時(shí)，顯色反應(yīng)和熒光效應(yīng)最強(qiáng)。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取馬鈴薯重花葉病毒空白樣品，按照1.3節(jié)和1.4節(jié)操作步驟，建立馬鈴薯重花葉病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)結(jié)果表明：在 0.000 1～ 0.5 μg/mL，馬鈴薯重花葉病毒含量與熒光去昂度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y=3 506.1x+320.4，相關(guān)系數(shù)r為0.999 1，這表明該曲線線性關(guān)系良好；根據(jù)3倍信噪比計(jì)算馬鈴薯重花葉病毒方法檢出限（S/N=3）為0.030 ng/mL；根據(jù)10倍信噪比計(jì)算馬鈴薯重花葉病毒方法定量限（S/N=10）為0.100 ng/mL，滿足馬鈴薯重花葉病毒的檢測(cè)要求。

2.6 精密度和回收率

采用馬鈴薯重花葉病毒空白樣品，進(jìn) 行 0.100、250.0、500.0 ng/mL三 種濃度加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)，按照上述所建方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)6次。結(jié)果表明：加標(biāo)回收率在86.8%～101.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.3%～2.4%，這說明該方法符合方法學(xué)的要求，且準(zhǔn)確度高、精密度好。2.7 實(shí)際樣品分析

采集市售馬鈴薯30份，按照本文所建方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：30份測(cè)試樣中，均未檢出馬鈴薯重花葉病毒，這表明所抽檢30份馬鈴薯樣品質(zhì)量較好。

3 結(jié)論

基于酶聯(lián)免疫分析法，利用生物標(biāo)記物辣根過氧化物（HRP）標(biāo)記馬鈴薯重花葉病毒抗原，結(jié)合H2O2–鄰苯二胺催化氧化反應(yīng)體系，建立了一種高靈敏度的HRP-H2O2-OPDA化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)馬鈴薯重花葉病毒方法。結(jié)果表明：該酶聯(lián)免疫傳感器對(duì)馬鈴薯重花葉病毒檢測(cè)的動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍為0.0001～0.5 μg/mL，檢測(cè)限為0.030 ng/mL（S/N=3），定量限為0.100 ng/mL（S/N=10），回收率在86.8%～101.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.3%～2.4%；其他馬鈴薯病毒對(duì)該傳感器的干擾較小，表現(xiàn)出良好選擇特異性。該方法簡便、靈敏、選擇性高，可為馬鈴薯重花葉病毒檢測(cè)提供新途徑。

[1]董代幸.烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯病毒和類病毒的分子鑒定及檢測(cè)技術(shù)研究[D].烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[2]吳興泉,時(shí)妍,楊慶東,等.我國馬鈴薯病毒的種類及脫毒種薯生產(chǎn)過程中病毒的檢測(cè)[J].中國馬鈴薯,2011(6):363-366.

內(nèi)蒙古質(zhì)監(jiān)系統(tǒng)科研項(xiàng)目（編號(hào)：2015006）。

劉海英（1975—），女，