肖慧杰，王軼卓，于 威，劉銅軍

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院)

二氯乙酸通過減少糖酵解抑制大腸癌細(xì)胞增殖

肖慧杰1，王軼卓2，于 威1，劉銅軍3*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院)

目的探討二氯乙酸對大腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用機(jī)制。方法使用梯度濃度的二氯乙酸作用于大腸癌細(xì)胞，二氯乙酸的濃度分別為1、5、10 mmol/L，另設(shè)陰性對照組(加等體積培養(yǎng)基)。MTT法檢測不同濃度二氯乙酸對大腸癌細(xì)胞增殖抑制情況。Western Blot方法檢測實(shí)驗(yàn)組大腸癌細(xì)胞中HK-Ⅱ、PDH、Kv1.5、Caspase3、Caspase9的表達(dá)情況。使用乳酸試劑盒檢測大腸癌細(xì)胞中乳酸的生成量。結(jié)果二氯乙酸對大腸癌細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，10 mmol/L組的腫瘤細(xì)胞生存率僅為對照組的20%。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)二氯乙酸作用下大腸癌細(xì)胞中Caspase3及Caspase9表達(dá)增加，證實(shí)二氯乙酸誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡。HK-Ⅱ表達(dá)量明顯減少，乳酸生成量減少，證實(shí)減少了大腸癌細(xì)胞的葡萄糖酵解。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)二氯乙酸作用的細(xì)胞中Kv1.5蛋白表達(dá)量明顯高于對照組，可能使電壓門控的鉀離子通道明顯增加并使線粒體膜電位復(fù)極。結(jié)論二氯乙酸通過抑制大腸癌細(xì)胞糖酵解發(fā)揮增殖抑制作用。

二氯乙酸；大腸癌；糖代謝；凋亡

(ChinJLabDiagn,2017,21:1824)

研究顯示通過二氯乙酸(DCA)靶向抑制PDK促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的代謝形式由糖酵解轉(zhuǎn)化為氧化磷酸化并且抑制了腫瘤的生長[1-3]。這一發(fā)現(xiàn)顯示PDK/PDH軸可能對腫瘤細(xì)胞的代謝生長起一定的作用。將酵解轉(zhuǎn)化為有氧代謝，降低線粒體膜電位，增加ROS生成，這種變化可以發(fā)生在腫瘤細(xì)胞內(nèi)[4]。PDH將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，然后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，通過電子傳遞鏈完成電子傳遞，產(chǎn)生能量ATP，PDH是此過程中的關(guān)鍵酶之一，一定程度上決定細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖有氧代謝的量和速度，有試驗(yàn)證實(shí)實(shí)體瘤細(xì)胞中PDH表達(dá)降低[5,6]。DCA可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但其對正常組織細(xì)胞并不表現(xiàn)出上述作用，對人體沒有毒性。本文探討DCA對大腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、小牛血清購于Gibco 公司；DCA購于Sigma 公司；HK-Ⅱ、PHD、Kv1.5、Caspase3、Caspase9抗體及l(fā)actic acid kit、ROS kit購于Dako公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 直腸癌細(xì)胞HT-29常規(guī)培養(yǎng)于含10%的含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于二氧化碳濃度5%，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2MTT 將細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板內(nèi)，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×104，每孔體積約為200 μl，每3孔為一組。DCA的實(shí)驗(yàn)濃度分別為1 mmol/L、5 mmol/L及10 mmol/L，設(shè)陰性對照組，只給予培養(yǎng)基但不添加DCA溶液。作用時間結(jié)束后進(jìn)行MTT檢測，每孔加MTT 10 μl，濃度為5 g/L ，繼續(xù)孵育2小時后終止培養(yǎng)，棄去上清液，每孔加入二甲亞砜200 μl，將96孔板置于微量振蕩器上搖震5 min，搖震過程中避光進(jìn)行。震蕩結(jié)束后采用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，讀取490 nm 波長處吸光度。

1.2.3Western Blot 取對數(shù)生長HT-29細(xì)胞分別接種于直徑3 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)約90%時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)皿中加入DCA溶液，濃度分別為1 mmol/L，5 mmol/L和10 mmol/L，對照組加入等體積的培養(yǎng)液，放回孵箱內(nèi)繼續(xù)孵育4小時。去上清用PBS沖洗3次，使用細(xì)胞裂解液于冰上裂解細(xì)胞，作用時間為30 min。收集細(xì)胞于EP管內(nèi)，取少量上清進(jìn)行蛋白定量(BCA 蛋白定量法具體參照試劑盒說明書)，用細(xì)胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度。將細(xì)胞裂解液與上樣緩沖液等體積混合，置標(biāo)本于100℃水浴中煮沸5 min，取蛋白30 μg上樣后進(jìn)行凝膠電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜電壓為50V，轉(zhuǎn)膜時間為90 min。于4℃冰箱內(nèi)使用5% 脫脂牛奶封閉過夜，加入濃度為1∶500的一抗于4℃冰箱孵育過夜，后使用TPBS潤洗3次，加入濃度為1∶5 000的二抗于室溫孵育2小時，后使用TPBS潤洗3次，使用PBS洗滌1次，后使用ECL發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光、顯影、定影。

1.2.4乳酸測定 取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞用胰酶消化后接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×104，每3孔為一組，DCA的實(shí)驗(yàn)濃度分別為1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L，設(shè)對照組加等體積培養(yǎng)基。將96孔板放回孵箱內(nèi)繼續(xù)孵育4小時。使用96孔板檢測乳酸生成量，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl加入孔內(nèi)，樣本孔先后加入細(xì)胞培養(yǎng)基10 μl及樣本稀釋液40 μl，空白孔不加。然后于標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔內(nèi)分別加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100 μl，空白孔不加。后使用封板膜封閉96孔板，并將其放回37℃孵箱內(nèi)孵育60 min。取出96孔板，棄去上清在吸水紙上拍干，分別于每個孔內(nèi)加滿洗滌液，靜置1 min后甩去洗滌液，在吸水紙上拍干，重復(fù)上述操作5 次。然后于每孔內(nèi)加入底物A和底物B 各50 μl，使用鋁箔覆蓋96孔板，達(dá)到避光的目的，并將其放回37℃孵箱內(nèi)孵育15分鐘。孵育完成后每孔加入終止液50 μl，在450 nm波長處測定各孔的OD值，測量讀數(shù)經(jīng)細(xì)胞總蛋白平衡后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1DCA抑制大腸癌細(xì)胞增殖

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液DCA濃度為1、5、10 mmol/L，對照組不加DCA，培養(yǎng)4小時，使用MTT法檢測細(xì)胞數(shù)，設(shè)定對照組細(xì)胞數(shù)為100%，實(shí)驗(yàn)組結(jié)果與對照組結(jié)果的比值為實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)，以百分?jǐn)?shù)的形式呈現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組，此現(xiàn)象于3個梯度濃度的DCA作用組被觀察到，其中最高濃度實(shí)驗(yàn)組HT-29細(xì)胞的生存率僅為對照組的20%。隨著DCA溶液濃度的升高各組細(xì)胞的生存率逐漸降低，并呈現(xiàn)出濃度依賴趨勢(圖1)。

圖1 DCA對HT-29細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2DCA增加HT-29細(xì)胞Caspase9、Caspase3表達(dá)，通過誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗增殖作用

DCA的抗增殖作用已經(jīng)在MTT實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，為了判斷DCA抗大腸癌細(xì)胞增殖作用是否通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，通過Western Blot方法檢測實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中凋亡特異蛋白Caspase9和Caspase3。DCA實(shí)驗(yàn)組大腸癌細(xì)胞中Caspase蛋白表達(dá)均高于對照組。說明DCA通過誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗增殖作用(圖2A、圖2B)。

圖2A DCA增加HT-29細(xì)胞中Caspase9表達(dá)量

圖2B DCA增加HT-29細(xì)胞中Caspase3表達(dá)量

2.3DCA減少乳酸生成，減少葡萄糖酵解

為了觀察DCA對大腸癌細(xì)胞葡萄糖代謝的作用，明確其是否改變了大腸癌細(xì)胞葡萄糖代謝模式，檢測了不同濃度作用下及對照組大腸癌細(xì)胞中乳酸生成量，同時用細(xì)胞數(shù)進(jìn)行平衡。分別設(shè)立3個DCA梯度濃度1、5、10mmol/L，作用時間為4小時，孵育完成后于鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，然后使用乳酸檢測試劑盒測定各組乳酸生成量并除以相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行平衡，以對照組數(shù)值為100%，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)比較對照組得出相應(yīng)的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示單位細(xì)胞數(shù)中乳酸生成量隨著DCA濃度的增加而減少，10 mmol/L組的實(shí)驗(yàn)數(shù)值最低，僅為43.3%。說明在DCA作用下大腸癌細(xì)胞葡萄糖酵解的比例減少(圖3)。

圖3 DCA減少HT-29細(xì)胞乳酸生成量

2.4DCA影響葡萄糖代謝相關(guān)蛋白表達(dá)

HK-Ⅱ是葡萄糖酵解第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中該酶均高表達(dá)，與較高的葡萄糖酵解率相吻合，DCA可以降低大腸癌細(xì)胞的葡萄糖酵解率，本實(shí)驗(yàn)通過Western Blot方法檢測實(shí)驗(yàn)組及對照組大腸癌細(xì)胞中HK-Ⅱ表達(dá)量變化，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組中HK-Ⅱ表達(dá)明顯減少同時呈現(xiàn)出濃度依賴性。PDH可以催化丙酮酸不可逆的氧化脫羧轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)，實(shí)驗(yàn)組與對照組中PDH表達(dá)量的比較發(fā)現(xiàn)DCA實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中PDH表達(dá)增加，可以進(jìn)一步解釋DCA增加大腸癌細(xì)胞葡萄糖有氧代謝同時減少葡萄糖酵解(圖4A,圖4B)。

圖4A DCA降低HT-29細(xì)胞中HK-Ⅱ表達(dá)量

圖4B DCA增加HT-29細(xì)胞中PDH表達(dá)量

2.5DCA增加Kv1.5表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)中用梯度濃度的DCA作用大腸癌細(xì)胞HT-29，用Western Blot方法檢測Kv1.5的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Kv1.5蛋白表達(dá)量明顯高于對照組。由于電壓門控的鉀離子通道明顯增加，線粒體膜電位差變小，大腸癌細(xì)胞中明顯超極化的線粒體膜發(fā)生了復(fù)極反應(yīng)，這樣線粒體的功能可能得到恢復(fù)，可以正常的進(jìn)行葡萄糖有氧代謝，而不僅僅是葡萄糖酵解(圖5)。

圖5 DCA增加HT-29細(xì)胞中Kv1.5的表達(dá)量

3 討論

多種腫瘤細(xì)胞的能量代謝都表現(xiàn)出一個相似的現(xiàn)象，那就是線粒體超極化同時降低電壓門控通道蛋白的表達(dá)量，進(jìn)而表現(xiàn)出抗凋亡特性。DCA是一種小分子無機(jī)物，它可以作用于線粒體使其去極化，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出了誘導(dǎo)凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用[7,8]。DCA可以明顯的增加葡萄糖有氧代謝而降低糖酵解的比例，DCA通過恢復(fù)線粒體膜電位和增加電壓門控通道蛋白表達(dá)這兩種方法來發(fā)揮上述作用。

“有氧糖酵解”這個詞于1930年首先被瓦伯格提出，用來描述腫瘤細(xì)胞的一種代謝特征，即使在氧氣供應(yīng)充足的情況下仍然選擇通過葡萄糖酵解的代謝方式提供能量，這種具有普遍性現(xiàn)象在多種腫瘤細(xì)胞中被觀察到，可以稱為腫瘤細(xì)胞的一大特征。人們尚且不清楚有氧糖酵解與腫瘤細(xì)胞的抗凋亡現(xiàn)象之間的關(guān)系，究竟是有氧糖酵解導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的不死狀態(tài)還是腫瘤細(xì)胞的不死性導(dǎo)致了有氧糖酵解。但是多數(shù)學(xué)者認(rèn)為[9,10]，腫瘤細(xì)胞的這種代謝特征可能成為抗腫瘤治療的一個有效靶點(diǎn)，針對這一現(xiàn)象的研究工作也大量開展。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DCA作用下大腸癌細(xì)胞中乳酸生成量明顯減少，表明DCA作用下的大腸癌細(xì)胞的葡萄糖酵解率明顯降低(圖3)。同時我們觀察到DCA有效抑制了大腸癌細(xì)胞增殖，隨著DCA濃度的增加腫瘤細(xì)胞生存率逐漸降低(圖1)。這個結(jié)果提示了通過改變大腸癌細(xì)胞葡萄糖代謝模式可以發(fā)揮抗增殖作用，而且DCA具有上述作用。

腫瘤細(xì)胞的抗凋亡現(xiàn)象包括多種機(jī)制。目前的研究結(jié)果逐漸聚焦于由于線粒體功能受損導(dǎo)致的電壓依賴通道的低表達(dá)是腫瘤細(xì)胞抗凋亡的原因。關(guān)閉鉀離子通道并降低鉀離子通道表達(dá)量導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)高鉀導(dǎo)致了毒性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是有些研究結(jié)果證明鉀離子通道過度打開也可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[11,12]，這是完全相反的現(xiàn)象，這可能與不同的腫瘤類型有關(guān)。在我們此次實(shí)驗(yàn)中觀察到Kv1.5表達(dá)增加后腫瘤細(xì)胞凋亡增加了(圖5)，提示在大腸癌細(xì)胞中，DCA可以增加Kv1.5表達(dá)量可能誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡。

腫瘤細(xì)胞特異的葡萄糖代謝模式可能成為抗腫瘤治療的新的靶點(diǎn)，在單獨(dú)使用此類藥物或聯(lián)合其余藥物使用時都表現(xiàn)出良好的抗腫瘤增殖的作用。DCA是這樣一種理想的藥物，可以恢復(fù)腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位，恢復(fù)其正常的生理功能，改變葡萄糖代謝模式，減少糖酵解比例，增加葡萄糖有氧代謝即進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行充分代謝獲取能量。此次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在DCA作用下糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)明顯降低， PDH表達(dá)明顯增加，這樣可以使更多的丙酮酸經(jīng)過轉(zhuǎn)化后進(jìn)入三羧酸循環(huán)并供能。值得關(guān)注的現(xiàn)象是DCA降低糖酵解比例時降低了乳酸生成量，這樣腫瘤細(xì)胞生長環(huán)境的pH值發(fā)生了變化，而且單位質(zhì)量的葡萄糖生成的ATP量明顯增加，上述兩種變化是否能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響仍然需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Dichloroaceticacidinhibitstheproliferationofcolorectalcancercellsbyreducingglycolysis

XIAOHui-jie,WANGYi-zhuo,YUWei,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of DCA on the proliferation of colorectal cancer cells.MethodsThe gradient concentration of DCA was used to treat colorectal cancer cells,and the gradient concentration of DCA was 1,5,10mmol/L,and the other was the negative control group (with equal volume medium).MTT method was used to detect the proliferation inhibition of colorectal cancer cells with different concentrations of DCA.Western Blot method was used to detect the expression of HK-Ⅱ,PDH and Kv1.5 in colorectal cancer cells.Lactic acid kit was used to detect the production of lactic acid in colorectal cancer cells with different concentrations of DCA.ResultsDCA significantly inhibited the proliferation of colorectal cancer cells,and the survival rate of tumor cells in 10mmol/L group was only 20%.Western Blot showed that the expression of Caspase3 and Caspase9 in colorectal cancer cells was increased by DCA,which confirmed that DCA could induce the apoptosis of colorectal cancer cells.The expression of HK-Ⅱ was significantly reduced,and the amount of lactic acid production was reduced,and glycolysis was reduced.The amount was significantly higher than the control group the expression of Kv1.5 protein in DCA cells,because the voltage gated potassium channels increased significantly,the mitochondrial membrane hyperpolarization repolarization response significantly in colorectal cancer cells.ConclusionDCA can inhibit the proliferation of glucose in colorectal cancer cells by inhibiting glucose metabolism.

dichloroacetic acid;colorectal cancer;glucose metabolism;apoptosis

R735.3+4

A

2017-03-29)

吉林省科學(xué)技術(shù)廳計(jì)劃處青年科研基金項(xiàng)目(20140520029JH)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1824-04