印 璞,喬 璐，楊照微，何成彥，孫景春，鄭 嵐

(1.吉林省臨床檢驗中心，吉林 長春130021;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院；3.吉林大學口腔醫(yī)院)

HSPD1在腎癌中的表達及意義

印 璞1*,喬 璐2，楊照微2，何成彥2，孫景春2，鄭 嵐3*

(1.吉林省臨床檢驗中心，吉林 長春130021;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院；3.吉林大學口腔醫(yī)院)

目的探討HSPD1蛋白在腎癌及癌旁正常腎皮質(zhì)組織的表達及其意義。方法應用二維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術分析18例腎癌患者腫瘤標本，篩選出腎癌組織及癌旁正常腎皮質(zhì)組織差異表達的HSPD1蛋白，并用免疫印跡驗證其準確性。結(jié)果質(zhì)譜鑒定后顯示，HSPD1蛋白在腎癌組織中的表達水平低于癌旁正常腎皮質(zhì)組織，免疫印跡證實其準確性。結(jié)論低表達的HSPD1可能與腎癌的發(fā)生發(fā)展有關。

熱休克蛋白D1；腎癌；二維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術

(ChinJLabDiagn,2017,21:1690)

腎癌，又稱腎細胞癌(RCC)，是一種泌尿系統(tǒng)特有的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于膀胱癌，在泌尿系腫瘤中占據(jù)第二位。世界范圍內(nèi)，腎癌位居常見腫瘤第13位，2012年新發(fā)腎癌約338 000例，占所有腫瘤的2.4%， 死亡人數(shù)為144 000例，占所有腫瘤的1.7%[1]。由于其臨床癥狀無特異性，因此早期診斷和治療具有一定的難度。HSPD1蛋白是由核基因組編碼的線粒體分子伴侶蛋白，對于線粒體內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運、折疊具有重要作用，是線粒體的一個重要標志物。很多研究表明多種腫瘤中HSPD1的表達水平發(fā)生了異常改變，而且HSPD1的表達水平與腫瘤的臨床特點、預后及進展等密切相關，因此本研究采用二維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術以及免疫印跡技術，探討HSPD1在腎癌及癌旁正常腎皮質(zhì)組織中的差異表達及臨床意義。

1 材料與方法

1.1組織標本的來源

本研究所用的組織標本均經(jīng)病理學檢查并證實為腎透明細胞癌，排除了多發(fā)腫瘤患者及術中發(fā)現(xiàn)已發(fā)生轉(zhuǎn)移患者，手術前所有患者均沒有經(jīng)歷過化療、放療或生物治療。18例標本均來源于泌尿外科手術切除的18例新鮮組織標本，經(jīng)過提前預冷的生理鹽水沖洗去除血液、壞死組織，液氮速凍后，凍存于-80℃冰箱。

1.2主要的試劑及儀器

二硫代蘇糖醇(DTT)、TPCK修飾的測序級胰蛋白酶購于美國Promega 公司。TMED、十二烷基苯磺酸鈉(SDS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)購于美國Sigma 公司。碘代乙酰胺(IAM)、蛋白質(zhì)的定量試劑盒(RCDC Protein Assay Kit)、尿素(Urea)購于Bio-Rad 公司。試驗用水為經(jīng)Milli-Q純水儀制備的超純水。LTQ XL型液質(zhì)聯(lián)用儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3實驗方法

(1)組織樣本總蛋白的提取及濃度測定：取出于-80℃保存的腎癌組織及癌旁組織，分別置于液氮中剪碎并研磨成粉末。加入裂解緩沖液(30 mmol/L Tris-HCL,9 mol/L Urea,65 mmol/L DTT,2 mmol/L PMSF),室溫振蕩1 h，使樣本混合物充分的溶解。10 000 g， 4℃離心50 min后，仔細收集上清即為所需的總蛋白質(zhì)。Bradford法(考馬斯亮藍染色法)測定蛋白質(zhì)的濃度，在595 nm處測吸光度值，A595 nm為縱坐標，根據(jù)6個濃度標準蛋白的含量為橫坐標繪制標準曲線，通過樣本的吸光度值測定樣本中蛋白質(zhì)的含量，并分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

(2)組織樣品蛋白分離及制備水解多肽混合物：從冰箱中取出-80℃保存的總蛋白樣品，加入上樣緩沖液后，煮沸5 min，進行電泳蛋白分離，切膠后用25 mmol/L NH4HCO3充分清洗。室溫干燥后加入0.5 mM的DTT，在56℃條件下避光放置1小時。室溫下加入0.5 mM的IAM，置于暗處反應40分鐘。被分析蛋白和測序級胰酶分別按50∶1的比例加入反應體系中，放置在37℃水浴箱中孵育過夜。約20小時后酶切產(chǎn)物真空抽干，-80℃?zhèn)溆帽４妗?/p>

(3)二維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分離鑒定多肽混合物：將上述的樣本用0.1%FA溶解后，每次取50 μg樣本上樣，通過串聯(lián)的強陽離子交換柱和反相柱分離樣品。強陽離子柱用9個不同濃度乙酸氨采用階段洗脫的方法，將肽段洗脫至反相柱，再進行反相的分離；泵流速為200 μl/min，分流后的流速為2 μl/min。RPLC洗脫的多肽使用LTQXL離子肼質(zhì)譜儀檢測，應用數(shù)據(jù)依賴的采集模式進行次二級掃描。

(4)免疫印跡試驗：對選定的目標蛋白HSPD1，采用免疫印跡試驗對其在腎癌及癌旁組織的表達情況進一步驗證。通過HSPD1蛋白條帶與內(nèi)參條帶計算出相對灰度比值，從而間接反映各樣本中HSPD1的表達水平。內(nèi)參抗體β-Actin ，HSPD1單克隆抗體購于Thermo Fisher公司。

1.4統(tǒng)計學分析

通過主成分分析、t檢驗、聚類分析等統(tǒng)計方法分析二維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用所得的數(shù)據(jù)，找到腎癌組織和癌旁組織之間的差異表達蛋白。

2 結(jié)果

2.1二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析腎癌組織與癌旁組織的蛋白酶解混合產(chǎn)物

應用二維液相色譜及質(zhì)譜聯(lián)用，對膠內(nèi)酶解后的腎癌組織及癌旁組織的總蛋白進行分析，得到多個多肽序列及蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)。

2.2腎癌組織及癌旁組織差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析

差異蛋白鑒定時，以以下標準界定蛋白豐度的變化：兩個樣品中蛋白譜圖數(shù)的差值≥72同時比值≥1，每種樣品均行兩次實驗以避免假陽性的發(fā)生。本文主要將顯著差異蛋白中下調(diào)表達的HSPD1作為目標蛋白進行研究，HSPD1的質(zhì)譜結(jié)果見圖1。

圖1 HSPD1質(zhì)譜圖

2.3蛋白印跡分析

通過Western blot檢測腎癌組織及癌旁組織中的HSPD1蛋白的表達情況。結(jié)果可見腎癌組織中HSPD1的表達水平顯著低于配對的癌旁組織，見圖2。

圖2 HSPD1免疫印跡圖

3 討論

腎癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的腫瘤之一，因其早期癥狀比較隱蔽，通常沒有特異性的癥狀，到目前為止，還沒有一種公認的腎細胞癌篩選、診斷、分層治療和檢測療效的分子標志物出現(xiàn)，因此對腎癌的早期診斷仍是研究的熱點[2,3]。蛋白質(zhì)組學技術通?？梢岳貌町惖鞍踪|(zhì)的組學分析，從而發(fā)現(xiàn)疾病早期靈敏度高而且特異性強的腫瘤標志物，因此對于腫瘤的早期診斷、治療以及預后的預測等方面具有非常重要的臨床意義，已逐漸成為比較復雜生物樣品中大量蛋白質(zhì)的一種廣受歡迎的方法[4-6]。

HSP是高度保守的蛋白質(zhì)，作為分子伴侶參與廣泛的生物過程。熱激蛋白不僅在正常細胞條件下表達，大部分的熱激蛋白在接觸不同的環(huán)境脅迫時，其表達量也會顯著增加[7]。熱激蛋白的主要功能是負責維持細胞完整性，尤其當外界環(huán)境發(fā)生改變時，它們便會立即做出反應，根據(jù)分子量的不同，被分為小分子量熱激蛋白，HSP40，HSP60(也稱為HSPD1)，HSP70，HSP90和HSP100[8]。HSPD1參與熱應激反應，熱激反應是一個體內(nèi)的平衡機制，它可以通過上調(diào)HSPD1的表達量從而保護細胞免受外界傷害[9]。除了參與熱應激反應，HSPD1還參與多肽的折疊，研究表明HSPD1能幫助15%～30%的蛋白質(zhì)進行折疊和構(gòu)象[10]，此外HSPD1還參與蛋白質(zhì)的運輸和DNA代謝，HSPD1與線粒體轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而對線粒體DNA進行傳播和復制[11]。近年來HSP家族在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用愈受重視，本研究通過差異蛋白質(zhì)組學篩選出的HSPD1，其分子量為60 kDa，也被報道與多種不同類型癌癥發(fā)生相關[12,13]。HSPD1在胃癌組織中表達明顯高于正常胃黏膜組織，而且還與某些臨床病理參數(shù)有關，檢測胃癌中的HSPD1的表達有助于預測胃癌細胞分化程度[14]。HSPD1在胰腺癌是高表達蛋白，細胞內(nèi)表達增加與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關，并有可能是胰腺癌發(fā)展惡化的重要標志，是判斷胰腺癌預后的重要指標[15]。一些前人的研究還表明，HSPD1在肺腺癌、宮頸癌及大腸癌等一些腫瘤疾病中表達水平顯著升高，但在舌鱗狀上皮細胞癌、膀胱移形細胞癌和肝癌等腫瘤中表達顯著下降。雖然HSPD1的表達情況在多種腫瘤中存在著明顯的差異，但是同時也表明HSPD1可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中具有一定的提示作用。本研究利用蛋白質(zhì)組學技術中的二維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術分別檢測了腎癌與癌旁組織中HSPD1的表達情況，發(fā)現(xiàn)腎癌組織中的HSPD1表達明顯降低，證明腎癌組織中的HSPD1含量明顯低于癌旁組織，提示HSPD1可能與腎癌的發(fā)生發(fā)展有關，但其具體機制以及其與腫瘤的臨床特點、預后及進展等的相關性還需進一步研究。

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ExpressionandSignificanceofHSPD1inRenalcellcarcinoma

YINPu,QIAOLu,YANGZhao-wei,etal.

(ClinicalTestingCenterofJilinProvince,Changchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the expression and significance of HSPD1 in renal cell carcinoma and adjacent normal tissues.MethodsTwo-dimensional chromatography and mass spectrometry method were applied to identifying the difference of HSPD1 expressed in renal cell carcinoma and adjacent normal tissues of 10 patients with renal cell carcinoma.ResultsIdentifications by mass spectrometer showed that HSPD1 expressed significantly lower in renal cell carcinoma than that in the tissue adjacent to carcinoma,and then confirmed the accuracy by western blot.Conclusionthe decrease of HSPD1 expression may have a closely relationship with renal cell carcinoma.

HSPD1 protein;Renal cell carcinoma;LC-MS

R737.11

A

2017-01-14)

國家自然科學基金(81572082)；吉林省科學技術廳項目(2011713,20150414015GH)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1690-03