黃召， 黎明， 周宇翔， 肖雅玲

先天性巨結(jié)腸患兒結(jié)腸組織鉀離子通道蛋白表達(dá)的變化

黃召， 黎明， 周宇翔， 肖雅玲

目的觀察先天性巨結(jié)腸患兒結(jié)腸組織鉀離子通道蛋白表達(dá)的變化。方法選擇2012年10月至2016年10月湖南省兒童醫(yī)院收治先天性巨結(jié)腸患兒40例作為觀察組，同期選擇本院腸套疊患兒40例作為對(duì)照組。采用免疫組織化學(xué)法對(duì)患兒結(jié)腸組織鉀離子通道蛋白的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果觀察組HERG1鉀離子通道蛋白表達(dá)陽(yáng)性率、Kv3.4鉀離子通道蛋白陽(yáng)性率分別為85.0%(34/40)、90.0%(36/40)，顯著高于對(duì)照組0%、10.0%(4/40)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論先天性巨結(jié)腸患兒結(jié)腸組織鉀離子通道蛋白呈高表達(dá)特征，可能為先天性巨結(jié)腸重要的發(fā)病機(jī)制之一。

先天性巨結(jié)腸； 結(jié)腸組織； 鉀離子通道； 兒童

先天性巨結(jié)腸又被稱之為無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥，為當(dāng)前兒科臨床較為常見(jiàn)的病癥之一，位居消化道畸形的第二位，若未能夠得到有效治療，將會(huì)誘發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥，例如小腸結(jié)腸炎、結(jié)腸穿孔、巨結(jié)腸危象等[1]。目前先天性巨結(jié)腸的發(fā)病機(jī)制尚不明確，隨著離子通道研究的深入開(kāi)展，離子通道結(jié)構(gòu)功能異常與消化道畸形的發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)聯(lián)性逐漸步入臨床視野[2]。本研究圍繞先天性巨結(jié)腸結(jié)腸組織鉀離子通道的表達(dá)變化展開(kāi)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年10月至2016年10月湖南省兒童醫(yī)院收治先天性巨結(jié)腸患兒40例為研究對(duì)象，設(shè)為觀察組，其中男35例，女5例；年齡0.5～9個(gè)月，平均(3.25±0.10)個(gè)月；病程15～30 d，平均(22.5±0.5)d；病癥類型：普通型30例，全結(jié)腸型2例，長(zhǎng)段型3例，短段型5例；腹瀉伴腸梗阻27例，進(jìn)行性便秘及腹脹13例。同期選擇本院腸套疊患兒40例作為對(duì)照組，其中男33例，女7例；年齡1～10個(gè)月，平均(3.30±0.08)個(gè)月；病程20～45 d，平均(25.0±1.0)d；陣發(fā)性腹痛25例，血便37例，腹內(nèi)腫塊四聯(lián)征40例。兩組患兒在性別、年齡、病程方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《臨床診療指南·小兒外科學(xué)分冊(cè)》中先天性巨結(jié)腸和結(jié)腸部腸套疊的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合先天性巨結(jié)腸和結(jié)腸部腸套疊的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡0.5～10個(gè)月；(3)患兒家屬知情同意。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)先天性肛門(mén)直腸畸形、先天性腸閉鎖或狹窄、功能性腸梗阻、胎糞性腸梗阻、繼發(fā)性巨結(jié)腸者；(2)有其他全身嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者；(3)對(duì)照組患兒腸道組織壞死者。

1.5 方法 采用免疫組織化學(xué)法對(duì)患兒結(jié)腸組織鈣離子通道表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。首先采集升結(jié)腸與橫結(jié)腸的交接處2 cm長(zhǎng)度腸道組織。利用常規(guī)石蠟包埋并制備成為5 μm切片標(biāo)本，在撈片之后烤干并置于60 ℃烤箱之中過(guò)夜。蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)處理[3]。隨后進(jìn)行HERG1(human ether-a-go-go related gene1，HERG1)鉀離子通道蛋白、Kv3.4鉀離子通道蛋白免疫組織化學(xué)染色，所有步驟均嚴(yán)格按照SP免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行[4]。

1.6 觀察指標(biāo) 將HERG1、Kv3.4表達(dá)作為觀察指標(biāo),結(jié)合染色強(qiáng)度以及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分級(jí)評(píng)定：陰性(-)：鉀離子通道蛋白無(wú)著色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%；弱陽(yáng)性(+)：鉀離子通道蛋白呈黃色、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～24%；中度陽(yáng)性(++)：鉀離子通道蛋白呈棕黃色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)：鉀離子通道蛋白呈棕褐色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%[5]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HERG1鉀離子通道蛋白表達(dá) 見(jiàn)表1。

表1 兩組HERG1鉀離子通道蛋白表達(dá)的比較[n(%)]

注：與對(duì)照組比較，Z=-6.85，P<0.05；aχ2=59.13，P<0.05。

表1結(jié)果表明，觀察組HERG1鉀離子通道蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 兩組Kv3.4鉀離子通道蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 兩組Kv3.4鉀離子通道蛋白表達(dá)的比較[n(%)]

注：與對(duì)照組比較，Z=-5.86，P<0.05；aχ2=51.20，P<0.05。

表2結(jié)果表明，觀察組Kv3.4鉀離子通道蛋白陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

先天性巨結(jié)腸是指因直腸或結(jié)腸遠(yuǎn)端的腸管出現(xiàn)持續(xù)性痙攣，導(dǎo)致糞便無(wú)法順利通過(guò)，近端結(jié)腸而淤滯于此，造成腸管持續(xù)性擴(kuò)張、肥厚，為小兒常見(jiàn)病癥類型[6]。由于該病癥是由于在腸壁肌間和黏膜下神經(jīng)叢內(nèi)缺乏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，無(wú)髓鞘性的副交感神經(jīng)纖維數(shù)量增加以及增粗所致，又被稱之為“無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥”[7]。雖然先天性巨結(jié)腸的病理變化已經(jīng)被臨床所熟知，但是在發(fā)病機(jī)制方面卻仍然未形成一致共識(shí)，使得研究領(lǐng)域尚存在著較大的空白之處。

現(xiàn)有研究證實(shí)，所有的活細(xì)胞均由一層膜所包圍，將細(xì)胞內(nèi)的液態(tài)世界與外部環(huán)境相隔離[8]。在病理狀態(tài)下細(xì)胞的鉀離子濃度發(fā)生急劇變化，瞬時(shí)刺激膜上的離子通道，影響神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)[9]。鉀離子通道為當(dāng)前已知的種類最多、分布范圍最廣的離子超級(jí)家族，廣泛分布于骨骼肌、神經(jīng)、心臟、胃腸道等細(xì)胞之中，肩負(fù)著神經(jīng)遞質(zhì)釋放、維持靜息電位和神經(jīng)元興奮性、電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等重任[10]。而先天性巨結(jié)腸正是由于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺乏所致的病癥類型，因而鉀離子通道與其發(fā)生可能存在著某種關(guān)聯(lián)性[11]。

小兒腸套疊在我國(guó)發(fā)病率較高，占嬰兒腸梗阻的首位，臨床上常見(jiàn)的是急性腸套疊，常見(jiàn)病因?yàn)轱嬍掣淖冊(cè)斐蓩雰耗c道不能立即適應(yīng)食物的改變或嬰幼兒期回盲部游動(dòng)性大，且易受刺激發(fā)生回盲瓣向前推移造成腸套疊[12]。發(fā)病迅速，且發(fā)病原因與患兒腸部發(fā)生病理性病變關(guān)系較小，因此選擇腸套疊患兒結(jié)腸組織與健康同齡人差異較小，作為先天性巨結(jié)腸患兒的對(duì)照組干擾因素較少[13]。本研究通過(guò)選取先天性巨結(jié)腸患兒結(jié)腸組織以及正常結(jié)腸組織鉀離子通道蛋白表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定和比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組HERG1陽(yáng)性率、Kv3.4陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組，提示呈高表達(dá)的鉀離子通道蛋白可能阻斷了神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，使神經(jīng)節(jié)細(xì)胞傳導(dǎo)受阻，繼而誘發(fā)先天性巨結(jié)腸。原因在于Kv3.4為電壓-門(mén)控型鉀通道蛋白，構(gòu)成了鉀離子通道的干道，當(dāng)其表達(dá)水平升高時(shí)細(xì)胞膜去極化速率增加，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，傳遞功能區(qū)發(fā)生異常，一旦細(xì)胞骨架發(fā)生結(jié)構(gòu)性改變后將會(huì)直接影響結(jié)腸組織中病變細(xì)胞的增殖以及遷移[14]。患兒發(fā)病后HERG1表達(dá)水平急劇升高，使得非電壓敏感性通道被激活，抑制細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)，繼而提高了病變細(xì)胞的增殖速率，離子通道蛋白的高表達(dá)的情況下。導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細(xì)胞失去神經(jīng)傳導(dǎo)功能，進(jìn)而誘發(fā)了疾病。所以，本研究認(rèn)為結(jié)腸組織鉀離子通道表達(dá)的異常改變?yōu)檎T發(fā)先天性巨結(jié)腸的重要機(jī)制，通過(guò)調(diào)控鉀離子通道表達(dá)水平將有助于臨床治療取得理想的療效[15]。然而，由于目前醫(yī)學(xué)界形成的文獻(xiàn)報(bào)道鮮少涉及二者之間關(guān)系的研究，因而本研究所得論斷的科學(xué)性尚有待于大樣本數(shù)據(jù)研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，先天性巨結(jié)腸結(jié)腸組織鉀離子通道蛋白呈高表達(dá)特征，可能為先天性巨結(jié)腸的重要發(fā)病機(jī)制之一。

[1] 禹振華,黃忠誠(chéng).Connexin43介導(dǎo)胃腸神經(jīng)-Cajal間質(zhì)細(xì)胞-平滑肌網(wǎng)絡(luò)縫隙連接通訊的研究進(jìn)展[J].結(jié)直腸肛門(mén)外科,2015,21(6):475-478.

[2] 中華醫(yī)學(xué)會(huì).臨床治療指南:小兒外科學(xué)分冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.

[3] 黃海霞,侯東燕,辛方,等.肌動(dòng)蛋白對(duì)結(jié)腸平滑肌大電導(dǎo)鈣激活鉀通道機(jī)械敏感性的影響[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,36(11):1245-1249.

[4] 劉邦,劉鈞,蹇順海,等.Eag1鉀離子通道、HIF-1α以及VEGF在子宮頸癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014,29(1):57-62.

[5] 徐靖宇,涂平,丘成楷,等.嗎啡依賴小鼠十二指腸P2Y_2受體表達(dá)及其對(duì)十二指腸碳酸氫鹽分泌的影響[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,38(5):465-469.

[6] 孫洪良,馬蕓,張寶和，等.hERG鉀通道在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及靶向治療中的作用研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2013,53(27):91-94.

[7] 郝增輝,許芝林,梁冰雪,等.結(jié)直腸離子通道與先天性巨結(jié)腸關(guān)系的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,15(26):5193-5196.

[8] 趙麗,趙林勝,趙緒穩(wěn),等.新生兒先天性巨結(jié)腸活檢標(biāo)本中Calretinin的診斷作用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2017,33(1):96-98.

[9] 張秀英,王雪峰,王思源,等.雙表法對(duì)流感病毒感染小鼠肺組織TLR4-MyD88-NF-κB P65蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué),2013,5(6):511-513.

[10]吳捷.兒童幽門(mén)螺桿菌感染的流行病學(xué)及診治現(xiàn)狀[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué),2014,6(5):387-391.

[11]胡星,王昕,鄔四明.血清TNF-α、IL-6和IL-8炎癥因子表達(dá)對(duì)先天性巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎的臨床意義[J].中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展,2017,20(3):211-212.

[12]姜茜,李頎,張震,等.基于RNA-Seq技術(shù)的先天性巨結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組學(xué)[J].世界華人消化雜志,2017,25(24):2200-2208.

[13]鄒麗莉,葉東,呂瑞玲,等.敲低IK1鉀通道抑制ClC-3氯通道的表達(dá)和功能[J].中國(guó)病理生理雜志,2015,31(12):2113-2119.

[14]吳敏,吳江.先天性巨結(jié)腸遺傳分子學(xué)研究新進(jìn)展[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2016,36(2):326-328.

[15]張曉露,王穎,戴儉宇,等.電針內(nèi)關(guān)對(duì)心肌缺血ASIC3-/-小鼠內(nèi)向整流鉀離子通道蛋白表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2016,27(8):2037-2040.

Changesofpotassiumchannelproteinexpressionincolontissueofchildrenwithcongenitalmegacolon

HUANGZhao，LIMing，ZHOUYuxiang，XIAOYaling.

NormalSurgicalDepartment,HunanChildren'sHospital,Changsha410007,China

ObjectiveTo observe the changes of potassium channel protein expression in colon tissue of children with congenital megacolon.MethodsForty patients with congenital megacolon treated in Hunan Children's Hospital from October 2010 to October 2016 were enrolled as the observation group. The 40 patients with intussusception were selected as the control group. The expression of potassium channel protein in colon tissue was measured by immunohistochemistry.ResultsThe positive rate of HERG1 potassium channel protein expression and Kv3.4 potassium channel protein was 85.0%(34/40) and 90.0%(36/40) respectively, which were significantly higher than those of control group[0%, 10.0% (4/40)], the difference being statistically significant(P<0.05).ConclusionThe potassium channel protein of colonic tissue in children with congenital megacolon is characterized by high expression, which may be one important pathogenesis of congenital megacolon.

Congenital megacolon; Colon tissue; Potassium channel; Children

R725.7

A

1674-3865(2017)05-0413-03

2017-03-01)

(本文編輯：吳迪)

410007 長(zhǎng)沙，湖南省兒童醫(yī)院普外二科

黃召(1986-)，男，醫(yī)學(xué)碩士，醫(yī)師。研究方向：小兒消化系統(tǒng)及腫瘤疾病的診治

肖雅玲，E-mail:etyypwk@sina.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2017.05.015