李金娟，陶自為，陶海霞，李 婷

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州大學(xué)通信網(wǎng)絡(luò)中心，甘肅 蘭州 730050）

外源激素對桃兒七愈傷組織誘導(dǎo)的影響

李金娟1，陶自為2，陶海霞1，李 婷1

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州大學(xué)通信網(wǎng)絡(luò)中心，甘肅 蘭州 730050）

為了探討外源激素對桃兒七愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以桃兒七的胚及無菌苗的子葉和胚軸為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，研究了3種不同激素配比對不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，以胚為外植體，在3.0 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L KT和0.5 mg/L IAA組合處理的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)率達到39.5%；誘導(dǎo)子葉和胚軸形成愈傷組織的最佳激素配比為4.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT+0.2 mg/L IAA；成熟胚比子葉和胚軸更易誘導(dǎo)愈傷組織的形成，誘導(dǎo)率分別提高了43.64%和315.79%，誘導(dǎo)效果最顯著（P＜0.001）；在接種前，用5mg/L 2,4-D溶液浸蘸子葉和胚軸可有效提高其出愈率。

外源激素；桃兒七；愈傷組織

桃兒七（sinopodophy）為小檗科桃兒七屬，是一種多年生草本植物，主要分布于中國的甘肅、陜西、青海、四川、云南以及西藏等地的山區(qū)林地[1-3]，是我國著名的珍稀瀕危藥用植物，其根和根莖中含有大量具有抗癌、抗病毒等多種藥用價值的木脂素類活性物質(zhì)，其中鬼臼毒素（podophyllo toxin）是合成V P216（etopo side）、VM 226（tenipo side）和 GP7 等抗癌藥物的原始物質(zhì)，其所具有的抗癌活性最為顯著[4-8]。此外，它還具有對一些重要病毒的抗病毒活性[9-10]。然而，由于近年來人們的過度采挖，使原本稀少的野生桃兒七植物資源遭到了嚴(yán)重的破壞，再加上人工合成、分離并純化鬼臼毒素在技術(shù)上較難實現(xiàn)，因而，國內(nèi)外利用細胞懸浮培養(yǎng)方法獲得鬼臼毒素已成為獲得鬼臼毒素最有效的途徑之一[11-14]。Kadkade等研究證明，從美屬足葉草（podophyllumpoltatum）、印足葉草（podophyllumhexandrumRoyle）的愈傷組織和懸浮培養(yǎng)體系中可以獲得鬼臼毒素，但含量很低，并且含鬼臼毒素的愈傷組織培養(yǎng)非常困難[15-17]；近年來，Uden和Chattopadhyay報道了他們在桃兒七的組織培養(yǎng)，愈傷誘導(dǎo)及其鬼臼毒素的生產(chǎn)等方面的研究進展，但均未獲得長勢與穩(wěn)定性均好的細胞系[18-21]；國內(nèi)則僅有漆燕玲、景寧、楊暉等發(fā)表過有關(guān)利用桃兒七成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織的報道[22-24]。

試驗以桃兒七種子成熟胚及其無菌苗的不同部位為外植體，通過2,4-D、KT和IAA的不同組合處理，進行桃兒七愈傷組織誘導(dǎo)，探索桃兒七愈傷組織形成的有效誘導(dǎo)條件，為高產(chǎn)細胞系的篩選、大規(guī)模細胞培養(yǎng)生產(chǎn)鬼臼毒素的研究奠定良好的基礎(chǔ)，并為解決桃兒七資源保護和開發(fā)利用之間的矛盾提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以桃兒七當(dāng)年種子的成熟胚為試驗材料，種子采自于甘肅渭原縣會川鎮(zhèn)海拔2 100 m的山區(qū)林地自然生長的桃兒七植株，千粒重34.45±0.10 g。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料的消毒與處理將桃兒七種子用溫水浸泡沖洗干凈，無菌條件下，用無菌水沖洗3次，用70%酒精消毒20 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞滅菌20 min，無菌水沖洗4次，最后用已作滅菌處理的500 mg/L GA3浸泡36 h。在無菌條件下，用無菌水漂洗3～4次，再用70%酒精消毒20 s，0.1%升汞滅菌20 min，無菌水沖洗4～5次。

1.2.2 外植體的選擇與處理無菌條件下將消毒、浸泡處理過的種子剝?nèi)》N胚，直接接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后，再截取0.4 cm2或0.4 cm的小塊或小段無菌苗子葉和胚軸分別在5 mg/L或10 mg/L兩種處理的2,4-D中浸蘸1～2 min后接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo)將培養(yǎng)30 d的無菌苗子葉和胚軸分別接種于不同激素（2,4-D、KT和IAA）組合處理的MS培養(yǎng)基中，置于pH值為5.0～6.0、溫度25±1℃、光照強度 38～40 μmol/m2·s的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織。

1.3 數(shù)據(jù)觀察、記錄與處理

不同外植體在不同激素組合處理的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上20 d后，通過目測法觀測愈傷組織的生長狀況和生長勢，記錄結(jié)果，并按公式（1）計算愈傷組織的誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=（誘導(dǎo)獲得的愈傷組織外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)）×100 （1）

數(shù)據(jù)通過Excel和SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.1.1 不同激素配比對成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響從表1中可以看出，不同濃度的2,4-D與KT組合，2,4-D、KT與IAA三者的組合能不同程度的誘導(dǎo)成熟胚的愈傷組織的發(fā)生。在M6培養(yǎng)基（3.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT）上，成熟胚的愈傷組織誘導(dǎo)率達到了24.5%，愈傷組織呈淡黃綠色，形態(tài)呈顆?；蛐鯛睿浣Y(jié)構(gòu)較疏松，生長較好。2,4-D與KT組合的培養(yǎng)基中添加一定濃度的IAA，可在其基礎(chǔ)上顯著提高誘導(dǎo)率：M7、M8均顯著高于其他未添加的試驗組，其中M8（圖1）誘導(dǎo)率達到39.5%，顯著優(yōu)于其他激素組合培養(yǎng)基（P ＜0.05）。

表1 不同激素配比對桃兒七成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖1 種子胚誘導(dǎo)的愈傷組織

2.1.2 不同激素配比對桃兒七無菌苗子葉和胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響適宜濃度的激素組合對桃兒七無菌苗子葉和胚軸愈傷組織的發(fā)生能產(chǎn)生一定的誘導(dǎo)效應(yīng)。由表2可知，在培養(yǎng)基L2和L5中，子葉的誘導(dǎo)率分別達到了12%和16%，對愈傷組織的產(chǎn)生有較好的誘導(dǎo)效應(yīng)；添加了IAA的L7和L8中，其出愈率均有較大提高，分別比L5提高了71.88%和28.13%，誘導(dǎo)效應(yīng)顯著高于其他激素組合處理（P＜0.05）；并且L7中，愈傷組織呈淡黃綠色，顆粒狀，生長勢好（圖2A）。由表3可知，不同激素組合處理下，胚軸的誘導(dǎo)率均較低，但與子葉誘導(dǎo)愈傷組織的效應(yīng)相同的是，L7的誘導(dǎo)效應(yīng)較其他組合處理顯著增強（P＜ 0.05），且愈傷組織生長勢相對較好（圖2B）。

2.2 不同外植體對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

如表4可知，桃兒七的種子成熟胚及無菌苗的胚軸、子葉均可誘導(dǎo)形成愈傷組織，但其誘導(dǎo)率有一定差異。其中，成熟胚、胚軸和子葉的誘導(dǎo)率分別為39.5%、9.5%和27.5%，與胚軸和子葉相比，成熟胚可顯著提高愈傷組織的誘導(dǎo)率，極顯著優(yōu)于胚軸和子葉（P＜0.01）。接種20 d后，觀察愈傷組織的生理形態(tài)發(fā)現(xiàn)：成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織呈黃綠色的顆粒狀；胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織呈翠綠或黃綠色，形態(tài)為絮狀或顆粒狀；子葉誘導(dǎo)的愈傷組織為綠色或黃綠色的致密顆粒。與子葉和胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織相比，由成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織的質(zhì)量和生長勢均較好。

表2 不同激素配比對桃兒七無菌苗子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖2 子葉和胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織

表3 不同激素配比對桃兒七無菌苗胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 不同濃度2,4-D處理對胚軸和子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表5可知，在接種前，胚軸和子葉不進行2,4-D溶液浸蘸處理，則二者均不產(chǎn)生愈傷組織，用5 mg/L和10 mg/L 2,4-D浸蘸外植體，均可誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生，其中以前者的誘導(dǎo)效應(yīng)最顯著。

3 結(jié)論與討論

表4 不同外植體對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表5 不同濃度2,4-D處理對胚軸和子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在植物的組織培養(yǎng)過程中，影響其愈傷組織形成的因素主要有兩個方面，一是所用的外植體類型，另一個是培養(yǎng)基中所使用的激素種類和濃度配比[25]。Gautheret[26]認(rèn)為，一個分化了的植物細胞向分生狀態(tài)恢復(fù)的程度，取決于它在自然部位上所具有的生理狀態(tài)和其所處的位置。分化程度越高、離其生長中心越遠的細胞，向分生狀態(tài)恢復(fù)的可能性就越小。徐剛標(biāo)[27]的研究也同樣表明，銀杏分化程度高的莖段和葉片比分化程度低的銀杏子葉和胚軸誘導(dǎo)生成愈傷組織的難度更高。

試驗結(jié)果顯示：與子葉和胚軸相比，成熟胚更易誘導(dǎo)愈傷組織的形成，其誘導(dǎo)率分別比二者提高了43.64%和315.79%，并且愈傷組織生理形態(tài)和生長勢較好，胚的愈傷組織誘導(dǎo)效果顯著優(yōu)于子葉和胚軸（P＜0.01），這與Gautheret等的研究結(jié)果相一致；以胚為外植體，在2,4-D（3.0 mg/L）+KT（0.5 mg/L）+IAA（0.5 mg/L）組合處理的培養(yǎng)基中，其愈傷組織誘導(dǎo)率達到39.5%，愈傷組織呈黃綠色，形態(tài)為顆粒狀，結(jié)構(gòu)致密，生長勢較好，而誘導(dǎo)子葉和胚軸形成愈傷組織的最佳激素配比為2,4-D（4.0 mg/L）+KT（0.5 mg/L）+IAA（0.2 mg/L）。來源不同的桃兒七外植體脫分化和愈傷組織的繼代培養(yǎng)所需要的激素種類和濃度配比具有明顯的差異，這表明所處不同生理階段、不同部位的外植體在激素刺激后的反應(yīng)類型和靈敏度是不同的，可以推斷這可能主要取決于其外植體自身的內(nèi)源激素水平，這是因為外源激素最終仍然需要通過內(nèi)源激素水平的調(diào)整和變化而起作用[28-29]。Yamaday等[30]的研究表明，2,4-D能夠使花粉原本正常的發(fā)育途徑發(fā)生改變，它通過與染色質(zhì)的組蛋白結(jié)合，使其DNA鏈脫離，從而使DNA鏈活化，導(dǎo)致DNA的大量復(fù)制，細胞分裂連續(xù)進行，最終形成愈傷組織。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種前，用不同濃度的2,4-D溶液浸蘸子葉和胚軸可顯著提高愈傷組織誘導(dǎo)率，甚至起到?jīng)Q定性作用，其中以5 mg/L 2,4-D的誘導(dǎo)效果最好。

研究中雖然獲得了一定數(shù)量的愈傷組織，但其生長緩慢，分化能力較弱，繼代培養(yǎng)很不穩(wěn)定，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重。減輕或控制褐變發(fā)生是桃兒七組織培養(yǎng)研究的重要內(nèi)容，需進一步探索建立穩(wěn)定高效的胚性愈傷組織細胞系，實現(xiàn)利用細胞培養(yǎng)的方法來獲得鬼臼毒素的目的，進而為從根本上解決藥用成分鬼臼毒素的社會供給問題，為瀕危野生藥用植物桃兒七自然資源的保護工作奠定堅實的基礎(chǔ)。

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Effects of Hormone on Callus Induction for Podophyllum hexandrum royle

LI Jin-juan1，TAO Zi-wei2，TAO Hai-xia1，LI Ting1
（1. Institute of Quality Standards and Testing Technology, GanSu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, PRC; 2. Information Technology Services of LanZhou University, Lanzhou 730050, PRC）

Embryos and cotyledon and hypocotyl of plantlets from Podophyllum hexandrum royle were used to establish callus cultures with MS medium with various hormones in order to study the effects of hormone on callus induction. The results indicated that the embryos callus induction rate could reach 39.5% under the interactions treatments of 3.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT +0.5 mg/L IAA.4.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT+0.2 mg/L IAA was the optimal hormone ratio selected for the cotyledon and hypocotyl callus induction. Mature embryos were more likely to induce callus formation than cotyledons and hypocotyls, which were 43.64% and 315.79% higher than those of the two. The induction effect was the most significant (P ＜0.001).The dipping of 5 mg/L 2,4-D for cotyledon and hypocotyl before the vaccination was increased the callus induction rate effectively.

Hormone; Podophyllum hexandrum royle; callus

Q943

A

1006-060X（2017）09-0006-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.009.002

2017-06-29

李金娟（1985-），女，甘肅蘭州市人，研究實習(xí)員，主要從事植物發(fā)育生物學(xué)相關(guān)研究。

（責(zé)任編輯：夏亞男）