曹 琳，曹 東，陳存坤，何竹筠，邢亞閣，張廣峰*，王寶剛

（1.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心，天津 300384；3.信陽農(nóng)林學(xué)院 食品學(xué)院，河南 信陽 464000）

鮮剝大蒜中腐敗微生物的分離純化及鑒定

曹 琳1，曹 東1，陳存坤2，何竹筠1，邢亞閣1，張廣峰1*，王寶剛3

（1.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心，天津 300384；3.信陽農(nóng)林學(xué)院 食品學(xué)院，河南 信陽 464000）

對(duì)鮮剝大蒜霉變部分的腐敗微生物進(jìn)行分離純化，觀察待測(cè)菌株的菌落形態(tài)特征、菌絲顯微結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行分子生物學(xué)分析。結(jié)果表明，經(jīng)過分離純化后一共得到4株菌，通過對(duì)其菌落形態(tài)特征和菌絲顯微結(jié)構(gòu)觀察，初步判定為青霉、根霉、赤霉及曲霉；通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增、產(chǎn)物測(cè)序和序列分析，最終鑒定4株菌分別為：桔青霉（Penicillium citrinum）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、赤霉（Gibberella intermedia）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）。

鮮剝大蒜；腐敗微生物；分離純化；鑒定

大蒜（garlic）為百合科蔥屬多年生草本植物，原產(chǎn)于西亞和中亞，張騫出使西域?qū)⑵鋷Щ刂袊F(xiàn)在中國的大蒜產(chǎn)量居世界首列。大蒜味辛辣刺激，主要功效成分為大蒜素，具有良好的生物活性、保健作用和藥用價(jià)值[1-3]。

目前，國內(nèi)對(duì)大蒜的功能性成分、大蒜素的抑菌作用及帶皮大蒜的貯藏保鮮研究較多[4-7]，而關(guān)于鮮剝大蒜卻鮮有研究。由于大蒜表面帶有一層薄膜和鱗皮，食用時(shí)較難去除，而鮮剝大蒜則可以直接食用或加工，符合現(xiàn)代社會(huì)方便、快捷的消費(fèi)模式。但鮮剝大蒜在貯藏過程中易發(fā)生色澤發(fā)黃、生根發(fā)芽、霉變等品質(zhì)劣變現(xiàn)象，大大降低經(jīng)濟(jì)價(jià)值[8-9]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)鮮剝大蒜中的腐敗微生物進(jìn)行分離純化，通過觀察待測(cè)菌株的菌落形態(tài)、菌絲顯微結(jié)構(gòu)，并對(duì)其進(jìn)行了分子生物學(xué)分析和鑒定，以期為鮮剝大蒜在貯藏保鮮研究中提供實(shí)驗(yàn)菌株和一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜：市售，剝開后在室溫條件下放置至發(fā)霉；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；真菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒：上海生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱：黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；尼康E100生物顯微鏡：上海光學(xué)儀器五廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離純化

準(zhǔn)確稱取25 g霉變大蒜，用無菌水沖洗2～3次，在無菌條件下破碎，加入裝有225 mL無菌水的錐形瓶中，振蕩20 min，混勻備用[10]。將大蒜懸浮液進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別吸取不同稀釋度的溶液1 mL加入PDA培養(yǎng)基中，用無菌涂布棒涂勻后，放于27℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5 d，每個(gè)稀釋度做3次重復(fù)試驗(yàn)。待平板上長(zhǎng)出各種形態(tài)菌落后，用接種針挑取不同形態(tài)的單菌落分別以平板劃線法接種，并做好標(biāo)記，于27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后觀察菌落形態(tài)，重復(fù)以上操作，直至獲得純培養(yǎng)物[11]。將純化后的菌株制成斜面保存于4℃冰箱中備用。

1.3.2 菌種形態(tài)初步鑒定

（1）形態(tài)特征觀察

將純化后的菌種接種到PDA培養(yǎng)基上，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察菌落形態(tài)特征（菌落生長(zhǎng)速度、顏色、質(zhì)地、表面情況狀態(tài)），參照文獻(xiàn)[12-13]確定病原菌的種類。

（2）顯微結(jié)構(gòu)觀察

將上述純化的菌種在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，待其長(zhǎng)出孢子。用鑷子夾取事先浸泡在酒精中的載玻片和蓋玻片于酒精燈上輕輕灼燒，去除酒精后放置在無菌操作臺(tái)上的濾紙片上冷卻。在載玻片中央滴加一滴無菌生理鹽水，用解剖針從培養(yǎng)霉菌的平板中挑取少許菌絲，依次用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液和蒸餾水快速浸潤清洗后，放入滴有無菌生理鹽水的載玻片上，并用解剖針小心將菌絲分散，蓋上蓋玻片，并注意排除氣泡，在顯微鏡下進(jìn)行微觀形態(tài)觀察[14-15]。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定

（1）霉菌DNA提取

待測(cè)菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基上，27℃培養(yǎng)3～5 d后，用接種環(huán)挑取菌絲接種于裝有100 mL PDB的錐形瓶中，27℃、150 r/min搖床培養(yǎng)3～5 d后，用無菌濾紙過濾得菌絲，再用無菌水沖洗后待用。將上述菌體加入事先裝有100 mg滅菌的石英砂的預(yù)冷研缽中，迅速充分研磨，加入蛋白酶K，用3 mL溴化十六烷基三甲銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）裂解液將粉末轉(zhuǎn)移至10 mL滅菌離心管中，混合均勻。將離心管放入65℃水浴中保溫30min，冷卻后加入相同體積的氯仿和異戊醇混合液（混合體積比=24∶1），搖勻后在室溫條件下12000r/min離心20min。將上述上清液轉(zhuǎn)移到另一支10mL無菌離心管中，同時(shí)加入等體積預(yù)冷后的異丙醇，混勻，于-20℃冰箱中靜置2～3 h。將上述靜置后的離心管4℃、10000r/min條件下離心20min，棄去上清液，用冰冷的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗滌沉淀，相同條件下進(jìn)行離心，重復(fù)操作2～3次。棄去上清液，室溫條件下晾干DNA，待離心管中沉淀呈透明狀后，加入0.2 mL TE（含20 μL/mL核糖核酸酶）溶解DNA，放于37℃水浴30 min除去RNA，于-20℃保藏[16]。

（2）PCR擴(kuò)增與測(cè)序

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min，依次循環(huán)：94℃變性40s，48℃退火45 s，72℃延伸1 min，總共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，之后在72℃延伸10 min，最后在4℃停止反應(yīng)[17]。PCR反應(yīng)結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，檢查是否有適當(dāng)大小的條帶。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。

（3）產(chǎn)物序列分析

將測(cè)得的各菌株序列上傳到美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站的BLAST上，進(jìn)行序列比對(duì)分析，篩選并下載相似性較高的序列，確定最終菌株種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果

通過平板梯度稀釋和劃線法，從霉變鮮剝大蒜中分離得到4株不同菌落特征的霉菌菌株，通過點(diǎn)值法分離純化培養(yǎng)后，依次編號(hào)為DM1、DM4、DM5和DM6，進(jìn)行菌落形態(tài)鑒定和分子生物學(xué)鑒定。

2.2 菌種形態(tài)特征觀察結(jié)果

2.2.1 形態(tài)特征觀察結(jié)果

菌株DM1、DM4、DM5、DM6在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)特征如圖1所示。

圖1 菌株DM1（A）、DM4（B）、DM5（C）及DM6（D）在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征Fig.1 Colony morphological characteristics of strain DM1(A),DM4(B),DM5(C),DM6(D)on PDA medium

由圖1A可知，菌株DM1在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度中等，菌落從中心由白色逐漸變?yōu)榛揖G色，邊緣為一圈白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其菌落顏色基本保持不變，菌落表面平坦干燥，質(zhì)地呈粉狀。

由圖1B可知，菌株DM4在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度極快，2～3 d即可長(zhǎng)滿整個(gè)平板，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落由白色逐漸變?yōu)榛野咨囵B(yǎng)14 d后則呈黑褐色，其菌落呈疏松絨毛狀，表面干燥。菌落背面開始為白色，后來變?yōu)榛野咨?/p>

由圖1C可知，菌株DM5在培養(yǎng)上的生長(zhǎng)速度中等，從培養(yǎng)開始到結(jié)束，其菌落顏色一直保持白色，菌落質(zhì)地為稠密的絮狀，菌落表面褶皺，邊緣不整齊，呈放射狀，并且表面濕潤。培養(yǎng)兩周以后，菌落背面由白色變?yōu)楹诤稚史派錉睢?/p>

由圖1D可知，菌株DM6在培養(yǎng)上的生長(zhǎng)速度緩慢，培養(yǎng)初期，菌落顏色呈現(xiàn)淡黃色，并且菌落直徑較小，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌落中心的顏色為淺黃色，菌落邊緣為白色，菌落質(zhì)地為疏松絮狀，表面凸起，呈同心環(huán)狀，邊緣整齊，表面干燥。在菌落培養(yǎng)期間，菌落背面始終為淺黃色。

2.2.2 顯微觀察結(jié)果

（1）菌株DM1菌絲形態(tài)特征

圖2 菌株DM1在顯微鏡下的菌絲形態(tài)特征Fig.2 Mycelial morphology of strain DM1 under microscope

由圖2可知，菌株DM1的孢子呈藍(lán)綠色，大部分為圓球形，且其疏松分散，孢子梗頂端無膨大的孢子囊，孢子穗與掃帚形狀類似。根據(jù)菌株DM1菌落形態(tài)特征和菌絲顯微結(jié)構(gòu)，通過查閱參考文獻(xiàn)[18-19]，其形態(tài)特征與青霉類似。

（2）菌株DM4菌絲形態(tài)特征

圖3 菌株DM4在顯微鏡下的菌絲形態(tài)特征Fig.3 Mycelial morphology of strain DM4 under microscope

由圖3可知，菌株DM4具有細(xì)長(zhǎng)的菌絲，菌絲下端生出假根，其頂端膨大的部分為孢子囊，假根與孢子囊之間為細(xì)長(zhǎng)的孢子囊梗。假根分枝較多，生長(zhǎng)迅速且雜亂無章，表面光滑；孢子囊呈圓形，其顏色逐漸由白色變?yōu)楹诤稚?，其外壁平滑，成熟時(shí)半徑為80～110 μm；孢子囊梗起初為白色，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸變?yōu)槿鐖D所示的黑褐色，其呈細(xì)長(zhǎng)、無分枝狀，表面光滑，無分隔。根據(jù)菌株DM4菌落形態(tài)特征和菌絲顯微結(jié)構(gòu)，通過查閱參考文獻(xiàn)[18-19]，其形態(tài)特征與根霉類似。

（3）菌株DM5菌絲形態(tài)特征

圖4 菌株DM5在顯微鏡下的菌絲形態(tài)特征Fig.4 Mycelial morphology of strain DM5 under microscope

由圖4可知，菌株DM5的菌絲細(xì)長(zhǎng)、稠密，并且分枝較多，從主干菌絲逐漸長(zhǎng)出分枝菌絲，再繼續(xù)分枝，看上去雜亂無章，呈現(xiàn)灰白色，外壁粗糙；菌株DM5的孢子呈白色，大多呈球形，數(shù)量較少。根據(jù)菌株DM5菌落形態(tài)特征和菌絲顯微結(jié)構(gòu)，通過查閱參考文獻(xiàn)[18-19]，其形態(tài)特征與赤霉類似。

（4）菌株DM6菌絲形態(tài)特征

圖5 菌株DM6在顯微鏡下的菌絲形態(tài)特征Fig.5 Mycelial morphology of strain DM6 under microscope

由圖5可知，菌株DM6具有細(xì)長(zhǎng)的菌絲，整體來看與金針菇形狀相似。分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)，外壁粗糙，有懸浮毛狀物，呈淺黃色；分生孢子梗頂端膨大，呈球形或橢球型，孢子囊中心為環(huán)狀，環(huán)狀外側(cè)為疏松絨毛狀且外壁粗糙不平。根據(jù)菌株DM6菌落形態(tài)特征和菌絲顯微結(jié)構(gòu)，通過查閱參考文獻(xiàn)[18-19]，其形態(tài)特征與曲霉類似。

2.3 菌種分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.3.1 PCR電泳擴(kuò)增結(jié)果

實(shí)驗(yàn)分別擴(kuò)增了菌株DM1、DM4、DM5和DM6這4株霉菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列，采用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，其PCR電泳擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示。

圖6 菌株的PCR電泳擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 PCR amplification results of strains

由圖6可知，4株霉菌的ITS序列擴(kuò)增后，所檢測(cè)出的條帶均無雜帶，并且條帶大小大致在500～750 bp長(zhǎng)度范圍內(nèi)，符合ITS序列預(yù)期的長(zhǎng)度，因此可以用于下一步對(duì)基因的鑒定。

2.3.2 產(chǎn)物測(cè)序與序列分析結(jié)果

將測(cè)序所得的基因序列通過NCBI網(wǎng)站，提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行Blast分析對(duì)比，對(duì)4株分離霉菌菌株進(jìn)行鑒定分析，其ITS序列對(duì)比鑒定結(jié)果如表1所示。

表1 待鑒定霉菌的ITS序列對(duì)比鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of ITS sequence analysis of moulds

由表1可知，將4株待鑒定的霉菌菌株基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了對(duì)比分析，其相似度達(dá)到了99%。因此，分離霉菌DM1、DM4、DM5和DM6分別被鑒定為桔青霉（Penicillium citrinum）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、赤霉（Gibberellaintermedia）、赭曲霉（Aspergillusochraceus）。將這4株霉菌的純培養(yǎng)物分別做成菌種斜面后，在四川省微生物資源平臺(tái)菌種保藏中心進(jìn)行系統(tǒng)保藏，其注冊(cè)保藏編號(hào)分別為SICC3.977、SICC3.978、SICC3.976、SICC3.975。

3 結(jié)論

本研究分離純化了霉變大蒜中的霉菌，通過對(duì)待鑒定的霉菌菌株進(jìn)行形態(tài)特征描述、菌絲顯微鏡特征觀察和分子生物學(xué)分析，得到4株待測(cè)霉菌的準(zhǔn)確鑒定結(jié)果分別為桔青霉（Penicillium citrinum）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、赤霉（Gibberella intermedia）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）。為后續(xù)鮮剝大蒜的腐敗原因研究提供實(shí)驗(yàn)菌種以及貯藏保鮮提供一定的參考。

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Isolation,purification and identification of spoilage microorganisms in fresh garlic

CAO Lin1,CAO Dong1,CHEN Cunkun2,HE Zhujun1,XING Yage1,ZHANG Guangfeng1*,WANG Baogang3
(1.School of Food and Biotechnology,Xihua University,Chengdu 610039,China;2.National Engineering Technology Research Center For Preservation of Agriculture Product,Tianjin 300384,China;3.Xinyang College of Agriculture and Forestry,Xinyang 464000,China)

Spoilage microorganisms derived from the moldy part of fresh garlic were isolated and purified,and the morphological characters,the mycelial microstructure and molecular biological analysis of the strains were analyzed.The results indicated that there were 4 strains screened after isolation and purification,and they were preliminarily identified asPenicillium,Rhizopus,GibberellaandAspergillusby observing the morphological characters and mycelial microstructure.After PCR amplification,product sequencing and sequence analysis,the strains were identified asPenicillium citrinum,Rhizopus stolonifer,Gibberella intermediaandAspergillus ochraceus.

fresh garlic;spoilage microorganisms;isolation and purification;identification

TS201.3

0254-5071（2017）09-0123-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.027

2017-06-16

四川省科技廳科技扶貧項(xiàng)目（2017NFP0047）

曹 琳（1994-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣弑ｕr與加工。

*通訊作者：張廣峰（1985-），男，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称芳庸ぁ?/p>