謝 婷，武 培*，韓德全，馬朝安，張?jiān)鲚x，李勝利，趙曉強(qiáng)

（天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000）

林可霉素工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵工藝優(yōu)化

謝 婷，武 培*，韓德全，馬朝安，張?jiān)鲚x，李勝利，趙曉強(qiáng)

（天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000）

為了提高林可霉素工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵效價(jià)，該研究對(duì)林可霉素發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，林可霉素最佳發(fā)酵條件為二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中淀粉和黃豆餅粉添加量分別為0.97%和1.43%、延長(zhǎng)二級(jí)種子移種菌齡至48 h及四級(jí)發(fā)酵罐基礎(chǔ)料計(jì)料體積為8 m3。在此優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下，林可霉素發(fā)酵四級(jí)放罐效價(jià)高達(dá)7 505 U/mL，比原始工藝四級(jí)放罐效價(jià)提高了16%。初步優(yōu)化了林可霉素工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵工藝，提高了林可霉素發(fā)酵效能和產(chǎn)量。

林肯鏈霉菌；林可霉素；工業(yè)生產(chǎn)；發(fā)酵工藝優(yōu)化

林可霉素又稱林肯霉素、潔霉素，是由林肯鏈霉菌（Streptomyces lincolnensis）通過(guò)好氧發(fā)酵產(chǎn)生的一種廣譜抗生素，屬于林可酰胺類素[1-4]。林可霉素及其衍生物是一類通過(guò)抑制菌體中蛋白質(zhì)的合成而起作用的藥物，是一種較有前途的抗生素。臨床上適用于治療革蘭氏陽(yáng)性菌引起的感染，對(duì)革蘭氏陰性菌也有效[5-7]。林可霉素用藥途徑較多，副反應(yīng)較少，適用于青霉素過(guò)敏的病人，己成為臨床應(yīng)用上主要的抗生素之一[8-10]。

目前對(duì)林可霉素的研究主要集中在培養(yǎng)基優(yōu)化、無(wú)機(jī)鹽或前體等物質(zhì)添加、物料研究以及發(fā)酵過(guò)程控制等方面[11-16]。研究發(fā)現(xiàn)，林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基中主要碳源為淀粉和葡萄糖，葡萄糖濃度過(guò)低時(shí)會(huì)明顯影響菌體的生長(zhǎng)，濃度過(guò)高時(shí)又會(huì)產(chǎn)生葡萄糖效應(yīng)，從而會(huì)降低林可霉素的產(chǎn)量，葡萄糖效應(yīng)并不是葡萄糖本身所產(chǎn)生的作用，而是其分解產(chǎn)物所致，所以在發(fā)酵過(guò)程中，選擇緩慢利用的碳源，保持低濃度的葡萄糖，是避開(kāi)葡萄糖效應(yīng)的一種有效的方法；氮源中的黃豆餅粉降解為氨基酸或氨的速率很慢，而不至于會(huì)阻遏抗生素的合成，因此，在林可霉素的發(fā)酵生產(chǎn)中常用其作為氮源；pH影響林可霉素的合成，在弱堿性的環(huán)境中，有利于林可霉素的生物合成；林肯鏈霉菌為好氧菌，轉(zhuǎn)速控制在150～190 r/min時(shí)，不但能提高發(fā)酵體系溶解氧濃度，而且不會(huì)使菌絲體過(guò)分?jǐn)嗔裑17-21]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)林可霉素?fù)u瓶培養(yǎng)階段和發(fā)酵罐發(fā)酵階段研究較多。國(guó)內(nèi)發(fā)酵小試或中試一般以二級(jí)發(fā)酵為主，工業(yè)生產(chǎn)多采用三級(jí)發(fā)酵[22-23]。林可霉素的發(fā)酵過(guò)程可分為初期（0～24 h）、前期（24～48 h）、中期（48～140 h）和發(fā)酵后期（140 h至發(fā)酵終點(diǎn)）[24-25]。國(guó)內(nèi)林可霉素生產(chǎn)工藝普遍采用分批補(bǔ)料，分批補(bǔ)料培養(yǎng)基中通常含葡萄糖、玉米漿、黃豆餅粉及一些金屬離子。這些成分在發(fā)酵過(guò)程中可防止菌絲生長(zhǎng)過(guò)盛或延緩菌體衰老，延長(zhǎng)菌體產(chǎn)生林可霉素的時(shí)間，大幅提高林可霉素的效價(jià)[22]。

本研究通過(guò)考察二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源和氮源、二級(jí)種子移種菌齡及四級(jí)發(fā)酵罐基礎(chǔ)料計(jì)料體積對(duì)林肯鏈霉菌四級(jí)發(fā)酵產(chǎn)林可霉素的影響，優(yōu)化林可霉素工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵工藝條件，以期能通過(guò)基礎(chǔ)研究解決林可霉素工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題，提高發(fā)酵效能和產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

林肯鏈霉菌（Streptomyces lincolnensis）：由天方藥業(yè)有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：淀粉2.11%，黃豆粉餅0.50%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，KNO30.09%，K2HPO40.04%，MgSO4·7H2O 0.40%，NaCl 0.07%，瓊脂2.00%，pH值為7.00。

搖瓶培養(yǎng)基：淀粉2.11%，黃豆粉餅1.58%，葡萄糖1.60%，玉米漿3.00%，（NH4）2SO40.15%，CaCO30.40%，pH值為7.00。

一級(jí)種子罐培養(yǎng)基：淀粉0.45%，黃豆粉餅1.00%，葡萄糖3.00%，玉米漿1.45%，（NH4）2SO40.06%，NaNO30.43%，KH2PO40.03%，CaCO30.95%，NaCl 0.65%，片堿0.10%，NH4NO30.30%，泡敵0.08%，消泡劑0.09%，pH值為7.00。

二級(jí)種子罐培養(yǎng)基：淀粉0.87%，黃豆粉餅1.33%，葡萄糖3.80%，玉米漿1.33%，（NH4）2SO40.40%，NaNO30.63%，KH2PO40.03%，CaCO30.75%，NaCl 0.71%，片堿0.10%，NH4NO30.40%，泡敵0.04%，消泡劑0.06%，pH值為7.00。

三級(jí)種子罐培養(yǎng)基：淀粉0.50%，黃豆粉餅1.35%，葡萄糖6.30%，玉米漿1.50%，（NH4）2SO40.45%，NaNO30.50%，KH2PO40.03%，CaCO30.80%，NaCl 0.88%，片堿0.10%，NH4NO30.45%，泡敵0.04%，消泡劑0.03%，pH值為7.00。

四級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)基：淀粉0.44%，黃豆粉餅1.32%，葡萄糖6.50%，玉米漿1.32%，（NH4）2SO40.44%，NaNO30.44%，KH2PO40.03%，CaCO30.74%，NaCl 0.81%，片堿0.10%，NH4NO30.44%，泡敵0.04%，消泡劑0.03%，pH值為7.00。

大稀料培養(yǎng)基：黃豆粉餅10.00%，玉米漿13.00%，CaCO30.40%，泡敵0.08%，消泡劑0.08%，pH值為5.00。

以上培養(yǎng)基滅菌條件：121℃，30 min。

液化糖：淀粉30.00%，淀粉酶0.60%，液化酶0.60%，硫酸銨1.80%，115℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HI2211pH計(jì)：北京哈納儀器廠；TDL-80-2B臺(tái)式低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；GZF-GF101-BS干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；XWW25/450旋轉(zhuǎn)搖瓶機(jī)：樂(lè)山三九長(zhǎng)征藥業(yè)股份有限公司；XG1.X（Y）中型壓力滅菌器：山東新華醫(yī)療器械廠；一級(jí)（2 m3）、二級(jí)（20 m3）、三級(jí)（70 m3）和四級(jí)（100m3）發(fā)酵罐：武漢同創(chuàng)工程設(shè)備有限公司；CX31-12L02顯微鏡：南京庚辰科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 林可霉素四級(jí)發(fā)酵工藝流程

林可霉素的發(fā)酵工藝為四級(jí)發(fā)酵，其發(fā)酵工藝流程如下：

操作要點(diǎn)：

種子搖瓶培養(yǎng)：挖取斜面培養(yǎng)基上1 cm2左右的菌塊，接種于裝有100mL種子培養(yǎng)基的1000mL三角瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)40～50 h，接種pH為7.00～7.40。

一級(jí)種子罐：0.10%的接種量，30℃，培養(yǎng)40～50 h，移種pH值為7.00～7.40。

二級(jí)種子罐：10～15%的接種量，30℃，培養(yǎng)20～50 h，移種pH值為7.00～7.40。

三級(jí)種子罐：15～30%的接種量，30℃，培養(yǎng)45～70 h，移種pH值為7.00～7.40。

四級(jí)發(fā)酵罐：30～40%的接種量，30℃，培養(yǎng)150～180h；稀料：30 h后每8 h補(bǔ)一次，每次1～3 m3；補(bǔ)糖：接種后至放罐整個(gè)發(fā)酵體系中還原糖控制在0.20～1.80%；調(diào)節(jié)pH值為6.40～7.00。1.3.2培養(yǎng)方法

（1）二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的優(yōu)化

在原二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基碳源基礎(chǔ)上優(yōu)化淀粉的濃度，比較二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中淀粉含量分別為0.77%、0.87%、0.97%和1.07%時(shí)后續(xù)四級(jí)放罐效價(jià)，以原二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉含量0.87%為對(duì)照，確定林肯鏈霉菌產(chǎn)林可霉素的二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中淀粉的最優(yōu)濃度。

（2）二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的優(yōu)化

在已優(yōu)化淀粉濃度以及原二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的基礎(chǔ)上優(yōu)化黃豆餅粉的濃度，比較二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中黃豆餅粉含量分別為1.23%、1.33%、1.43%和1.53%時(shí)后續(xù)四級(jí)放罐效價(jià)，以原二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基黃豆餅粉濃度1.33%為對(duì)照，確定林肯鏈霉菌產(chǎn)林可霉素的二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中黃豆餅粉的最優(yōu)濃度。

（3）二級(jí)種子移種菌齡的確定

采用管道壓差法對(duì)二級(jí)種子罐接種后，考慮到工業(yè)生產(chǎn)四級(jí)發(fā)酵各階段時(shí)間銜接以及生產(chǎn)成本，將二級(jí)種子移種菌齡由26 h延長(zhǎng)至48 h。通過(guò)比較二級(jí)種子移種時(shí)發(fā)酵液菌濃和四級(jí)放罐效價(jià)，確定林肯鏈霉菌產(chǎn)林可霉素的二級(jí)種子移種菌齡。

（4）發(fā)酵罐基礎(chǔ)料計(jì)料體積的優(yōu)化

在已優(yōu)化工藝的基礎(chǔ)上，比較發(fā)酵罐基礎(chǔ)料計(jì)料體積分別為6 m3、8 m3和10 m3時(shí)四級(jí)發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的效價(jià)，確定較優(yōu)的四級(jí)發(fā)酵罐基礎(chǔ)料計(jì)料體積。

1.3.3 測(cè)定方法

（1）菌體生長(zhǎng)量—菌濃的測(cè)定

取10 mL發(fā)酵液倒入10 mL離心試管中，2 500 r/min離心5 min，取上清液的體積，記作A，計(jì)算菌體的濕菌濃（簡(jiǎn)稱菌濃），菌濃計(jì)算公式如下：

（2）發(fā)酵液效價(jià)的測(cè)定

發(fā)酵液效價(jià)的測(cè)定：采用管碟法[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的優(yōu)化

圖1 不同的淀粉添加量對(duì)林肯鏈霉菌產(chǎn)林可霉素的影響Fig.1 Effects of different starch addition on lincomycin production byS.lincolnensis

由圖1可知，四級(jí)放罐效價(jià)隨著二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中淀粉添加量的增加而增加，當(dāng)培養(yǎng)基中淀粉添加量為0.97%時(shí)，林可霉素四級(jí)放罐效價(jià)達(dá)到最大值6 593 U/mL，比原二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中淀粉添加量為0.87%（對(duì)照）時(shí)的四級(jí)放罐效價(jià)（6477U/mL）提高了116 U/mL；當(dāng)培養(yǎng)基中淀粉濃度為1.07%時(shí)，林可霉素四級(jí)放罐效價(jià)反而降低，僅為6 405 U/mL，比對(duì)照組效價(jià)低了72 U/mL。可見(jiàn)，當(dāng)二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中淀粉濃度較低時(shí)，不能給菌體提供足夠的碳源，影響菌體生長(zhǎng)；當(dāng)培養(yǎng)基中淀粉濃度高時(shí)，淀粉將大量轉(zhuǎn)化成葡萄糖后產(chǎn)生了葡萄糖效應(yīng)，限制了菌體生長(zhǎng)，二者皆會(huì)導(dǎo)致后續(xù)發(fā)酵四級(jí)放罐效價(jià)降低。因此，二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中淀粉添加量為0.97%時(shí)較優(yōu)。

2.2 二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的優(yōu)化

圖2 不同的黃豆餅粉添加量對(duì)林肯鏈霉菌產(chǎn)林可霉素的影響Fig.2 Effects of different soybean cake powder addition on lincomycin production byS.lincolnensis

由圖2可知，四級(jí)放罐效價(jià)隨著二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中黃豆餅粉添加量的增加而增加，當(dāng)培養(yǎng)基中黃豆餅粉添加量為1.43%時(shí)，林可霉素四級(jí)放罐效價(jià)達(dá)到最大值6725U/mL，比原二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中黃豆餅粉添加量為1.33%（對(duì)照）時(shí)的四級(jí)放罐效價(jià)（6 587 U/mL）提高了132 U/mL；當(dāng)培養(yǎng)基中黃豆餅粉添加量為1.53%時(shí)，林可霉素四級(jí)放罐效價(jià)反而降低，僅為6 605 U/mL?？梢?jiàn)，當(dāng)二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中黃豆餅粉添加量較低時(shí)，不能提供給菌體足夠的氮源，影響了菌體生長(zhǎng)；當(dāng)培養(yǎng)基中黃豆餅粉添加量高時(shí)，黃豆餅粉大量降解成為氨基酸或氨，使得營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，高滲透壓限制了菌體的生長(zhǎng)，二者皆會(huì)導(dǎo)致后續(xù)發(fā)酵四級(jí)放罐效價(jià)降低。因此，二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中黃豆餅粉添加量為1.43%時(shí)較優(yōu)。

2.3 二級(jí)種子移種菌齡對(duì)林肯鏈霉菌產(chǎn)林可霉素的影響

圖3 移種菌齡對(duì)林肯鏈霉菌產(chǎn)林可霉素的影響Fig.3 Effect of transplanting cell age on lincomycin production by S.lincolnensis

由圖3A可知，二級(jí)種子移種菌齡由26 h延長(zhǎng)至48 h，移種時(shí)發(fā)酵液菌濃由38%提高至46%，提高了21%。由圖3B可知，四級(jí)放罐效價(jià)也明顯提高，從6 720 U/mL提高至7 117 U/mL，提高了397 U/mL?？梢?jiàn)，二級(jí)種子移種菌齡由26 h延長(zhǎng)至48 h，提高了二級(jí)種子移種時(shí)發(fā)酵液菌濃，同時(shí)無(wú)菌檢驗(yàn)批次增加，降低了種子液帶菌的風(fēng)險(xiǎn)；較高的種子菌體濃度，縮短了種子在發(fā)酵罐中的適應(yīng)期，促進(jìn)了后續(xù)發(fā)酵效價(jià)的提高。因此，二級(jí)種子移種菌齡48 h時(shí)較優(yōu)。

2.4 發(fā)酵罐基礎(chǔ)料計(jì)料體積對(duì)林肯鏈霉菌產(chǎn)林可霉素的影響

圖4 計(jì)料體積對(duì)林肯鏈霉菌產(chǎn)林可霉素的影響Fig.4 Effect of material volume on lincomycin production by S.lincolnensis

由圖4可知，四級(jí)發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液效價(jià)的整體趨勢(shì)是隨著發(fā)酵周期的延長(zhǎng)而升高，發(fā)酵液效價(jià)隨著基礎(chǔ)料計(jì)料體積的增加先升高后降低。四級(jí)發(fā)酵罐基礎(chǔ)料計(jì)料體積為8 m3時(shí)，發(fā)酵效價(jià)整體較高，且162 h（放罐）效價(jià)為7 505 U/mL，比計(jì)料體積為6 m3和10 m3時(shí)的放罐效價(jià)（7 236 U/mL和7 361 U/mL）分別提高了269 U/mL和144 U/mL，同時(shí)比原始工藝四級(jí)放罐效價(jià)（6 477 U/mL）提高了16%。由此可見(jiàn)，菌體生長(zhǎng)需要一定的營(yíng)養(yǎng)和能量，若計(jì)料體積低，則提供給林肯鏈霉菌的能量和營(yíng)養(yǎng)會(huì)相對(duì)較少，在一定程度上會(huì)限制菌體生長(zhǎng)，菌絲質(zhì)量差，效價(jià)則會(huì)受到影響；若計(jì)料體積高，則過(guò)剩的碳源分解成大量葡萄糖會(huì)造成葡萄糖效應(yīng)，同時(shí)過(guò)剩的氮源大量降解為氨基酸或氨又會(huì)阻遏抗生素的合成。因此，在現(xiàn)有工藝條件下，四級(jí)發(fā)酵罐基礎(chǔ)料計(jì)料體積為8 m3時(shí)較理想。

3 結(jié)論

林可霉素是一類具有重要臨床意義的高效廣譜抗生素，為了提高林可霉素工業(yè)生產(chǎn)效價(jià)，本研究通過(guò)采取優(yōu)化林可霉素發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵工藝條件為二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中淀粉和黃豆餅粉的添加量分別為0.97%和1.43%、延長(zhǎng)二級(jí)種子移種菌齡至48 h及優(yōu)化四級(jí)發(fā)酵罐基礎(chǔ)料計(jì)料體積為8 m3。優(yōu)化林可霉素工藝生產(chǎn)發(fā)酵工藝后，林可霉素發(fā)酵四級(jí)放罐效價(jià)高達(dá)7 505 U/mL，比原始工藝四級(jí)放罐效價(jià)提高了16%。在林可霉素現(xiàn)有工業(yè)發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝優(yōu)化，不但使二級(jí)種子無(wú)菌檢驗(yàn)批次增加，降低了種子液帶菌的風(fēng)險(xiǎn)，而且較高的種子菌體濃度，縮短了種子在發(fā)酵罐中的適應(yīng)期，促進(jìn)了后續(xù)發(fā)酵效價(jià)的提高，給工廠帶來(lái)了一定的經(jīng)濟(jì)效益。

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Optimization of fermentation process of lincomycin industrial production

XIE Ting,WU Pei*,HAN Dequan,MA Chaoan,ZHANG Zenghui,LI Shengli,ZHAO Xiaoqiang
(Topfond Pharmaceutical Co.,Ltd.,Zhumadian 463000,China)

In order to increase the fermentation potency of lincomycin industrial production,the fermentation process of lincomycin was optimized.The results showed that the optimum fermentation conditions of lincomycin were as follow:the concentrations of starch and soybean cake powder in the fermentation medium of two-stage seeds fermenter were 0.97%and 1.43%,respectively,the transplanting cell age of two-stage seeds was extended to 48 h and the volume of the base material of four-stage fermentation tank was 8 m3.Under the optimum fermentation conditions,the fermentation potency of lincomycin after four-stage fermentation was up to 7 505 U/ml,which was 16%higher than that of the original fermentation process.The fermentation process of lincomycin industrial production was optimized preliminarily,and the fermentation efficiency and yield of lincomycin were improved.

Streptomyces lincolnensis;lincomycin;industrial production;fermentation process optimization

S216.4

0254-5071（2017）09-0060-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.013

2017-01-05

謝 婷（1987-），女，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵工程。*

武 培（1984-），男，工程師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵工程。