甘雨1 趙晶鳳2 馬杰1* 劉小虎1

論著·實(shí)驗(yàn)研究

醫(yī)用可降解 Mg-Zn-Sr合金材料體內(nèi)外生物安全性評(píng)價(jià)*

甘雨1 趙晶鳳2 馬杰1* 劉小虎1

目的評(píng)價(jià)醫(yī)用可降解Mg-Zn-Sr合金材料的體內(nèi)外生物安全性，初步探討其作為骨科植入材料的可行性。方法參照國(guó)際ISO10993標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)內(nèi)GB/T16886標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)Mg-Zn-Sr合金進(jìn)行小鼠體內(nèi)急性全身毒性試驗(yàn)和體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)研究，記為合金組，對(duì)照組自小鼠尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液。結(jié)果Mg-Zn-Sr合金浸提液經(jīng)靜脈注射后，在即時(shí)、4、24、48、72 h后動(dòng)物一般狀態(tài)均良好，未見(jiàn)毒性反應(yīng)及死亡情況，合金組和對(duì)照組體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各濃度浸提液組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)與陰性對(duì)照組相似，各濃度浸提液組A值與陰性對(duì)照組A值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），細(xì)胞相對(duì)增值率（RGR值）介于（90.98%～107.15%）之間，毒性評(píng)價(jià)為0～1級(jí)。結(jié)論Mg-Zn-Sr合金無(wú)急性全身毒性反應(yīng)，無(wú)細(xì)胞毒性作用，符合醫(yī)用生物材料安全性要求，有望成為新型骨科植入材料。

Mg-Zn-Sr合金；生物材料；急性全身毒性；細(xì)胞毒性

目前，臨床上廣泛應(yīng)用的不銹鋼、鈦合金等骨科內(nèi)固定材料普遍存在應(yīng)力遮擋效應(yīng)和二次手術(shù)取出的問(wèn)題，增加了患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān) [1]。鎂作為一種新型可降解金屬材料，具有良好的生物相容性和力學(xué)特性，彈性模量接近人骨，能有效降低應(yīng)力遮擋效應(yīng)，成為具有潛在優(yōu)勢(shì)的新型骨科植入材料 [2]。但由于鎂在人體環(huán)境中降解太快，無(wú)法滿(mǎn)足骨科治療需求，限制了其在臨床上的應(yīng)用。本課題組在鎂金屬中加入鋅（Zn）、鍶（Sr）組成Mg-Zn-Sr合金，提高了其抗腐蝕性和力學(xué)性能，使其有望應(yīng)用于骨科治療領(lǐng)域。為初步評(píng)價(jià)該材料的生物安全性，本研究對(duì)其體內(nèi)急性全身毒性和體外細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究，旨在為其進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

合金材料：Mg-3.06Zn-0.253Sr（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），由東北大學(xué)材料與冶金學(xué)院提供，材料加工成直徑16.00mm，厚2.60 mm的圓片狀；KM小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量18g～22g，雌雄各半，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001；大鼠成骨MC3T3-E1細(xì)胞，購(gòu)自江蘇齊氏生物科技有限公司。

1.2 試劑及儀器

DME/F-12培養(yǎng)基（批號(hào)：AB216498，美國(guó)Hyclone公司），PBS（批號(hào)：NAH1449，美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（批號(hào)：20151118，浙江天杭 生物科技股份有限公司），胰蛋白酶-EDTA消化液（批號(hào)：20131105，北京索萊寶科技有限公司），青霉素/鏈霉素原液（批號(hào)：20150624-273，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所），MTT（批號(hào)：nc0793-250，杭州納川生物科技有限公司）。電熱恒溫培養(yǎng)箱(廈門(mén)醫(yī)療電子儀器廠)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國(guó))，超凈工作臺(tái) (Thermo公司，美國(guó))，酶標(biāo)儀 (Thermo公司，美國(guó))，倒置顯微鏡 (Olympus公司，日本)。

1.3 方法

參照ISO10993-12:2002和GB/T16886:2003標(biāo)準(zhǔn)[3]，取消毒后合金材料計(jì)算表面積，按1.25 cm2/mL的比例加入0.9%氯化鈉溶液，在電熱恒溫培養(yǎng)箱中以37℃浸泡72 h。分組及給藥

取健康KM小鼠20只，隨機(jī)分為合金組和對(duì)照組，每組10只，雌雄各半。合金組自小鼠尾靜脈注射合金浸提液，對(duì)照組自小鼠尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液，給藥劑量均為50 mL/kg，以低于0.1 mL/s的恒定速度注射。觀察指標(biāo)

于注射后即時(shí)、4、24、48、72 h觀察和記錄兩組動(dòng)物的一般狀態(tài)，毒性反應(yīng)及死亡情況。并于72 h稱(chēng)量動(dòng)物體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率，體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率=(72h體質(zhì)量－實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量)/實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量×100%。若合金組中有≥2只動(dòng)物出現(xiàn)毒性反應(yīng)（明顯的腹部刺激癥狀、抽搐、震顫、發(fā)紺、呼吸困難等）或死亡，≥3只動(dòng)物出現(xiàn)體質(zhì)量下降超過(guò)10%，則可判定合金材料有急性全身毒性。

將Mg-Zn-Sr合金材料依次置于90%乙醇、蒸餾水中超聲清洗各10分鐘，再經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。參照ISO10993-5:2009標(biāo)準(zhǔn)，取消毒后合金材料計(jì)算表面積，按1.25 cm2/mL的比例加入含10%胎牛血清的DME/F-12培養(yǎng)液，在恒溫培養(yǎng)箱中以37℃浸泡24h。浸提原液為100%濃度，再用DME/F-12培養(yǎng)液分別稀釋成50%、25%和12.5%三個(gè)濃度的材料浸提液，最后用0.22 m微孔濾膜過(guò)濾除菌備用。

取傳代生長(zhǎng)旺盛的大鼠成骨細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL。以每孔100 L接種于96孔培養(yǎng)板中，共接種3板。置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄去原培養(yǎng)液，PBS沖洗。分別加入100%、50%、25%和12.5%的材料浸提液，以含10%胎牛血清的 DME/F-12培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，每孔100 L，每組設(shè)6個(gè)平行孔，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

分別于24、48、72 h各取出1塊細(xì)胞培養(yǎng)板，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。然后每孔加入10 L濃度為5%的四甲基偶氮噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]溶液，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4h后棄去孔內(nèi)液體，每孔加入100 L二甲基亞砜，在搖床上低速振蕩3 min，采用Thermo酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值 (A值)。按下式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增值率 (RGR):RGR值=浸提液組A值/陰性對(duì)照組A值×100%。并參照GB/T16886.5-2005標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定細(xì)胞毒性：RGR值≥100%為0級(jí)，RGR值介于75%～99%為1級(jí)，50%～74%為2級(jí)，25%～49%為3級(jí)，1%～24%為4級(jí)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有研究數(shù)據(jù)均采用DAS2.1.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)急性全身毒性試驗(yàn)

注射后在各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物一般狀態(tài)均良好（見(jiàn)圖1），未見(jiàn)毒性反應(yīng)及死亡情況，72 h內(nèi)動(dòng)物體質(zhì)量無(wú)1只下降，兩組體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表 1）。

圖1 體內(nèi)急性全身毒性試驗(yàn)小鼠一般狀態(tài)。A：對(duì)照組(72h)，B：合金組(72 h)。

表1 兩組動(dòng)物體質(zhì)量變化情況比較（,g）

表1 兩組動(dòng)物體質(zhì)量變化情況比較（,g）

組別10 n 實(shí)驗(yàn)前 72小時(shí) 相對(duì)增長(zhǎng)率(%)合金組 20.50±1.18 23.50±1.51 14.69±5.16對(duì)照組 10 20.70±1.25 24.10±1.97 16.42±5.87 t值 0.368 0.764 0.700 P值 0.717 0.454 0.494

2.2 體外細(xì)胞毒性MTT試驗(yàn)

各濃度浸提液組細(xì)胞鏡下觀察呈長(zhǎng)梭形或多角形，貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀況良好，細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)與陰性對(duì)照組相似（見(jiàn)圖2）。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，各濃度浸提液組A值與陰性對(duì)照組A值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表2）。通過(guò)計(jì)算得出RGR值介于 (90.98%～107.15%)之間，毒性評(píng)價(jià)為0～1級(jí)（見(jiàn)表3），符合醫(yī)用生物材料毒性要求，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)毒性級(jí)別并無(wú)增長(zhǎng)，提示Mg-Zn-Sr合金對(duì)大鼠成骨細(xì)胞生長(zhǎng)增殖無(wú)顯著影響，呈現(xiàn)出良好的生物相容性。

表2 各濃度Mg-Zn-Sr合金浸提液不同培養(yǎng)時(shí)間A值比較（s）

表2 各濃度Mg-Zn-Sr合金浸提液不同培養(yǎng)時(shí)間A值比較（s）

0.147±0.030 0.212±0.029 0.198±0.052 12.5%浸提液 6 0.232±0.071 0.215±0.085組別 n 24小時(shí) 48小時(shí) 72小時(shí)6 0.141±0.021 0.181±0.051 0.200±0.063 100%浸提液 6 0.144±0.022 0.215±0.055 0.213±0.080 50%浸提液 6 0.128±0.015 0.193±0.028 0.192±0.057 25%浸提液 6 0.134±0.016陰性對(duì)照

表3 各濃度Mg-Zn-Sr合金浸提液RGR值及毒性評(píng)價(jià)

圖2 大鼠成骨細(xì)胞在不同濃度Mg-Zn-Sr合金浸提液中的細(xì)胞形態(tài)（×100）。A：陰性對(duì)照組(72 h)，B：100%浸提液組(72 h)，C：50%浸提液組(72 h)，D：25%浸提液組(72 h)，E：12.5%浸提液組(72 h)。

3 討論

理想的骨科植入材料需滿(mǎn)足降解速度與組織再生速度相匹配的要求，金屬鎂雖具有較好的可降解性及生物相容性，但降解速度過(guò)快，在組織愈合前就過(guò)早的失去機(jī)械完整性，無(wú)法滿(mǎn)足骨科治療需求，因此，延緩鎂的降解速率一直是醫(yī)用鎂金屬材料研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn) [4]。金屬 Zn、Sr是人體必需的微量元素，對(duì)人體生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用，有研究發(fā)現(xiàn)，這兩種金屬元素還能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，增強(qiáng)組織再生 [5]。更重要的是，在鎂金屬中以一定比例加入Zn、Sr組成Mg-Zn-Sr合金材料，其降解速度大幅減緩，強(qiáng)度和塑韌性大幅提升，使其有希望成為新一代的骨科植入材料。

本課題組前期已對(duì)Mg-Zn-Sr合金材料的機(jī)械性能、物理性能和化學(xué)性能進(jìn)行了大量的研究 [6,7]，本文將重點(diǎn)探討其生物學(xué)性能。參照國(guó)際ISO10993標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)內(nèi)GB/T16886標(biāo)準(zhǔn)，本研究選擇體內(nèi)急性全身毒性試驗(yàn)和體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)，以初步評(píng)價(jià)Mg-Zn-Sr合金的生物學(xué)性能。體內(nèi)急性全身毒性試驗(yàn)是一種非特異性急性毒性試驗(yàn)，將材料浸提液經(jīng)靜脈、腹腔或灌胃給予動(dòng)物，通過(guò)觀察其生物學(xué)反應(yīng)，判斷材料是否有毒以及毒性的大小 [9]。本實(shí)驗(yàn)采用鼠尾靜脈注射途徑給予材料浸提液，使其直接進(jìn)入血液循環(huán)，這是一種最直接和最快速暴露毒性的方法。結(jié)果顯示，Mg-Zn-Sr合金浸提液靜脈注射后，在即時(shí)、4、24、48、72 h動(dòng)物一般狀態(tài)均良好，未見(jiàn)毒性反應(yīng)及死亡情況，72h內(nèi)動(dòng)物體質(zhì)量無(wú)1例下降，兩組體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示Mg-Zn-Sr合金具有良好的生物安全性。

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是目前醫(yī)用金屬材料生物學(xué)性能評(píng)價(jià)的最常用方法，具有實(shí)驗(yàn)周期短、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn) [10]，可通過(guò)鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的改變以及增殖、凋亡情況，來(lái)判斷金屬材料的毒性。本研究選用合金材料植入部位的主要功能細(xì)胞-成骨細(xì)胞作為研究對(duì)象，與不同濃度Mg-Zn-Sr合金浸提液共同培養(yǎng)24、48、72 h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量及活力。結(jié)果顯示各濃度浸提液組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)與陰性對(duì)照組相似；經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，各濃度浸提液組A值與陰性對(duì)照組A值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；通過(guò)計(jì)算得出 RGR值介于(90.98%～107.15%)之間，毒性評(píng)價(jià)為0～1級(jí)，符合醫(yī)用生物材料毒性要求，提示該合金材料具有良好的生物相容性。

綜上所述，通過(guò)對(duì)Mg-Zn-Sr合金的體內(nèi)急性全身毒性和體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，該材料無(wú)急性全身毒性反應(yīng)，無(wú)細(xì)胞毒性作用，具有良好的生物安全性，在骨科治療領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。

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Biological safety assessment of medical degradable Mg-Zn-Sr alloy in vitro and in vitro

Gan Yu1,Zhao Jingfeng2,Ma Jie1,et al.1 The Second Hospital Affiliated to Liaoning University of Traditional Chinese Medicine;2 Shenyang 242 Hospital,Shenyang Liaoning,110034,China

Objective To evaluate the biological safety of medical degradable Mg-Zn-Sr alloy in vitro and in vivo and explore the possibility of Mg-Zn-Sr alloy as anew type of orthopedic implant material.Methods According to the ISO10993 and GB/T16886,in vivo acute systemic toxicity tests and in vitro cytotoxicity tests were performed,alloy group was injected with Mg-Zn-Sr alloy extract,and negative control group was injected with 0.9% sodium chloride solution.Results When the Mg-Zn-Sr alloy extract was injected intravenously,the animals were in good condition,no toxic reaction and death after 0,4,24,48,72 h,respectively.There was no significant difference in the body mass relative growth rate between the two groups(P＞0.05).The cell growth condition with the addition of extracts of every concentration was good,and the number and morphology of cells were similar to those of the negative control group.There was no significant difference in the A value between the extract of every concentration group and the negative control group(P＞0.05).The value of RGR ranged from 90.98%to 107.15%,and the toxicity was evaluated from grade 0 to grade 1.Conclusion Mg-Zn-Sr alloy has no acute systemic toxicity,no cytotoxic effect.It is the medical biological material safety requirements,is expected to become a new type of orthopedic implant material.

Mg-Zn-Sr alloy;Biological materials;Acute systemic toxicity;Cytotoxicity

10.3969/j.issn.1672-5972.2017.05.001

swgk2017-04-00075

R318.08

A

沈陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(N0：F15-139-9-42）

1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院；2沈陽(yáng)二四二醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)110034

甘雨（1981-）男，碩士，副研究員。研究方向：藥理學(xué)。

*[通訊作者]馬杰（1962-），女，本科，研究員。研究方向：藥理學(xué)。

2017-04-01）