李 晨，譚 芬，王 兵，鄧櫻花

(湖北第二師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430205)

新型BODIPY熒光探針熒光性質(zhì)的研究

李 晨，譚 芬，王 兵，鄧櫻花

(湖北第二師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430205)

以我們自己合成的BODIPY酯為研究對(duì)象，研究了溶液中有機(jī)溶劑的含量、溶液的pH值、光照以及溫度四種因素對(duì)熒光性質(zhì)的影響，結(jié)果表明：當(dāng)甲醇和乙腈含量分別為80%和70%時(shí)，BODIPY酯熒光強(qiáng)度最強(qiáng)；當(dāng)pH=11.0時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值；在同一溫度下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度基本上沒(méi)有明顯的變化； BODIPY酯具有很好的光穩(wěn)定性。

BODIPY酯；熒光探針；熒光強(qiáng)度；環(huán)境因素；影響

熒光分析法是目前應(yīng)用最為廣泛的一種有效分析檢測(cè)方法，常用于測(cè)定熒光物質(zhì)的靶標(biāo)物的種類(lèi)和濃度等重要參數(shù)。熒光分析方法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，因此在生物分析領(lǐng)域有著不可替代的重要作用。熒光探針作為熒光分析技術(shù)的信息檢測(cè)載體，其性質(zhì)的優(yōu)劣直接影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、靈敏性，因而開(kāi)發(fā)熒光性能優(yōu)越的熒光探針對(duì)生物分析的發(fā)展具有重要意義[1,2]。

傳統(tǒng)的熒光探針的種類(lèi)和數(shù)量較多，但是它們或多或少存在一定的缺陷，例如光穩(wěn)定性差、熒光量子產(chǎn)率低、發(fā)射波長(zhǎng)過(guò)短、溶解性差等，因此限制了它們的廣泛應(yīng)用[3-6]。氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川(Boron-dipyrromethene，簡(jiǎn)稱(chēng)BODIPY)類(lèi)染料是近二十年來(lái)發(fā)展較快、應(yīng)用較為廣泛的一類(lèi)新型的有機(jī)氟硼熒光探針，具有較高的摩爾吸收系數(shù)、較高的熒光量子產(chǎn)率、穩(wěn)定的光譜性質(zhì)、良好的光化學(xué)穩(wěn)定性等特點(diǎn)[7-9]。BODIPY熒光探針被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、化學(xué)分析、臨床醫(yī)學(xué)等痕量分析領(lǐng)域[10]。

物質(zhì)的熒光強(qiáng)度雖然主要決定于化合物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，但是環(huán)境因素對(duì)分子熒光可能產(chǎn)生強(qiáng)烈的影響，例如有機(jī)溶劑的含量、溶液的pH值、溫度、光照、離子表面活性劑等[11-13]。鄧櫻花等[14]研究了有機(jī)溶劑的含量、溶液pH、光照時(shí)間等環(huán)境因素對(duì)熒光素及熒光素衍生物熒光強(qiáng)度的影響。支環(huán)環(huán)[15]根據(jù)香豆素類(lèi)化合物在苯環(huán)和酯環(huán)上取代基的類(lèi)型與位置等結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，研究了多種香豆素類(lèi)化合物的熒光性質(zhì)，考察了環(huán)境因素如pH值、溶劑極性、共存離子、光照時(shí)間等對(duì)熒光波長(zhǎng)和強(qiáng)度的影響。

本文以我們自己合成的BODIPY酯為研究對(duì)象，研究了溶劑含量、溶液pH值、光照時(shí)間以及溫度四種常見(jiàn)環(huán)境因素對(duì)該熒光探針熒光性質(zhì)的影響，這將有助于合成熒光性能優(yōu)良的BODIPY類(lèi)熒光探針，充分發(fā)揮BODIPY類(lèi)探針的優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器及試劑

LS55熒光發(fā)光分光光度計(jì)(美國(guó)Perkin Elmer公司)，梅特勒托利多ME104電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，梅特勒FE28酸度計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，HH-S6恒溫水浴鍋(金壇市華龍實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

甲醇和乙腈(色譜純，Sigma-Aldrich, CO.)，硼酸和乙酸(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，磷酸(分析純，中南化工試劑有限公司)，所用水為超純水。

B-R緩沖溶液的配制：在濃度均為0.04 mol·L-1的三酸混合液(磷酸、乙酸、硼酸)中，加入一定體積的0.2 mol·L-1NaOH溶液，用pH計(jì)調(diào)至所需pH值。

本文所用的BODIPY熒光探針是我們實(shí)驗(yàn)室合成的，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。BODIPY酯儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.06956g的BODIPY酯溶于20 mL乙腈，即得1×10-2mol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

圖1 BODIPY酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 熒光光譜的測(cè)定

將BODIPY酯儲(chǔ)備液用乙腈稀釋到1×10-5mol· L-1，用此溶液確定激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)。固定激發(fā)波長(zhǎng)值，設(shè)置激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)狹縫寬度分別為10 nm，10 nm , 掃描速度為1200 nm/min，掃描波長(zhǎng)在400～600 nm范圍內(nèi)BODIPY酯試劑的發(fā)射光譜峰，確定其最大發(fā)射波長(zhǎng)。同理，固定其最大發(fā)射波長(zhǎng)，同樣條件下掃描波長(zhǎng)在400～600 nm范圍內(nèi)的激發(fā)峰，確定最大激發(fā)波長(zhǎng)值。

2.2 不同有機(jī)溶劑對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

將上述BODIPY酯儲(chǔ)備液分別用不同含量的甲醇、乙腈稀釋為1×10-5mol· L-1，用LS55熒光光譜儀測(cè)定(1 cm×1 cm比色皿)，根據(jù)測(cè)定對(duì)象分別調(diào)節(jié)相應(yīng)的熒光光度計(jì)狹縫。

2.3 pH值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

將BODIPY酯儲(chǔ)備液用不同pH值的緩沖溶液稀釋至1×10-5mol· L-1, 分別測(cè)定pH值為2.0-12.0的條件下的熒光強(qiáng)度。

2.4 溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

將濃度為1×10-5mol·L-1的BODIPY酯溶液置于恒溫水浴槽，測(cè)定不同溫度下的熒光強(qiáng)度，恒溫水浴槽的溫度依次設(shè)定為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，10 min后，測(cè)量其熒光值。

2.5 熒光穩(wěn)定性的測(cè)定

在上述確定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，將三支濃度相同(均為1×10-5mol·L-1)的BODIPY酯溶液分別置于-20℃、4℃、25℃，每隔兩個(gè)小時(shí)分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

2.6 光照時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

在上述確定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，按文獻(xiàn)[16]方法測(cè)定BODIPY酯溶液(濃度為1×10-5mol·L-1)的光穩(wěn)定性。用200 W的白熾燈泡在10 cm處照射裝有樣品的比色管，照射一定時(shí)間后，用自來(lái)水進(jìn)行冷卻，再進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 BODIPY酯熒光光譜圖

圖2為實(shí)驗(yàn)測(cè)定的BODIPY酯熒光探針的激發(fā)和發(fā)射光譜圖。

圖2 BODIPY酯熒光探針的激發(fā)和發(fā)射光譜圖

從圖2可以確定BODIPY酯熒光探針的最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為500 nm和510 nm,因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將500 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定510 nm處熒光強(qiáng)度的變化，探討環(huán)境因素對(duì)BODIPY酯熒光強(qiáng)度的變化。

3.2 不同有機(jī)溶劑對(duì)BODIPY酯熒光性質(zhì)的影響

甲醇-水和乙腈-水體系是反相高效液相色譜中廣泛使用的兩種流動(dòng)相，在這里，我們主要研究了甲醇和乙腈含量對(duì)BODIPY酯熒光性質(zhì)的影響。

3.2.1 甲醇含量對(duì)BODIPY酯熒光性質(zhì)的影響

圖3顯示了甲醇含量對(duì)BODIPY酯熒光探針熒光強(qiáng)度的影響。

圖3 甲醇含量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

從圖3得知：隨著甲醇含量的增加，BODIPY酯的熒光強(qiáng)度呈先增加后下降趨勢(shì)。在甲醇含量小于80%時(shí)，熒光強(qiáng)度一直呈增強(qiáng)趨勢(shì)；在甲醇含量大于80%時(shí)，熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)；甲醇含量為80%時(shí)，BODIPY酯的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。

3.2.2 乙腈含量對(duì)BODIPY酯熒光性質(zhì)的影響

圖4顯示了乙腈含量對(duì)BODIPY酯熒光探針熒光強(qiáng)度的影響。

圖4 乙腈含量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

從圖4得知：隨著乙腈含量的增加，物質(zhì)的熒光強(qiáng)度先增加后下降，當(dāng)乙腈含量在70%時(shí)，BODIPY酯的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。

上述甲醇和乙腈對(duì)BODIPY酯熒光探針熒光強(qiáng)度的影響是由于溶劑的極性效應(yīng)造成的，不同溶劑的極性對(duì)熒光探針的熒光強(qiáng)度都會(huì)發(fā)生顯著的影響。甲醇、乙腈是極性很強(qiáng)的溶劑，向BODIPY酯溶液中加入溶劑，熒光探針與溶劑分子之間相互作用形成激發(fā)態(tài)氫鍵配合物，使激發(fā)態(tài)與基態(tài)的能極差減小，使熒光強(qiáng)度逐漸增大[17]。但隨著溶劑含量的不斷增加，溶劑效應(yīng)也增強(qiáng)，折射率也增大，介電常數(shù)的減小促使熒光光譜的Stokes位移減小，從而使熒光效率降低[18]。

3.3 pH值對(duì)BODIPY酯熒光性質(zhì)的影響

本實(shí)驗(yàn)研究了在pH 值在2-12范圍內(nèi)，BODIPY酯熒光探針的熒光強(qiáng)度隨pH值的變化，如圖5 所示。

圖5 pH值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

pH值是影響B(tài)ODIPY酯熒光特性的重要因素。溶液的酸堿性變化，將使熒光探針的弱酸或弱堿分子及其相應(yīng)的離子比例發(fā)生變化，從而對(duì)熒光強(qiáng)度產(chǎn)生很大的影響[19]。由圖5可知：探針的熒光強(qiáng)度隨溶液pH值的升高先增加后減弱，當(dāng)pH值為11.0時(shí)，其熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。

3.4 溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

圖6顯示了在pH值為11.0的緩沖溶液中，不同溫度對(duì)BODIPY酯熒光探針熒光強(qiáng)度的影響。

圖6 溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

由圖6可知：熒光強(qiáng)度隨著溫度的升高而逐漸減弱。二者關(guān)系式表示為：(F0-F)/F=ke-E/RT(其中F0和F是溶液溫度上升前后的熒光強(qiáng)度)[19]。當(dāng)溫度升高時(shí)，分子之間的碰撞頻率增加，使去活化幾率增加，碰撞猝滅增強(qiáng)，使熒光強(qiáng)度下降。

3.5 光照對(duì)BODIPY酯熒光性質(zhì)的影響

圖7反映了在室溫，200 W白熾燈在不同的光照時(shí)間對(duì)BODIPY酯熒光強(qiáng)度的影響。

圖7 光照時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

從圖7可知：隨著光照時(shí)間的增加，在0-6 h內(nèi)BODIPY酯的熒光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有變化，在6-12 h內(nèi)BODIPY酯的熒光強(qiáng)度稍微增強(qiáng)?？傮w來(lái)說(shuō)BODIPY酯熒光探針具有較好的光穩(wěn)定性。

3.6 時(shí)間對(duì)BODIPY酯熒光性質(zhì)的影響

實(shí)驗(yàn)測(cè)得在不同的溫度下(分別為-20℃、4℃和25℃)，不同的時(shí)間對(duì)BODIPY酯熒光強(qiáng)度的影響，如圖8所示。

圖8 時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響， (■) -20℃；(●) 4℃；(▲) 25℃

由圖8可見(jiàn)，在三種溫度下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，BODIPY酯探針的熒光強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定，沒(méi)有明顯的變化。這說(shuō)明BODIPY酯熒光探針具有很好的時(shí)間穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本文以我們自己合成的BODIPY酯為對(duì)象，研究了甲醇的含量、乙腈的含量、溶液的pH值、時(shí)間、溫度、光照等因素對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明BODIPY酯熒光探針在甲醇、乙腈含量分別為80%和70%時(shí)，其熒光強(qiáng)度達(dá)到最大；在pH值為11.0時(shí)，其熒光強(qiáng)度最大；此外，該探針具有很好的光穩(wěn)定性和時(shí)間穩(wěn)定性。本文的研究為后續(xù)合成熒光性能更加優(yōu)越的BODIPY熒光探針，為后續(xù)研究BODIPY熒光染料在生物分析方面的應(yīng)用，提供重要的參考價(jià)值。

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On Fluorescence Feature of New BODIPY Fluorescent Probe

LI Chen, TAN Fen, WANG Bing, DENG Ying-hua
(School of Chemistry and Life Sciences, Hubei University of Education, Wuhan 430205, China)

The effects of content of organic solvent, solution pH, illumination time and temperature on fluorescence features are observed, taking BODIPY ester as the research object. The experimental results show that when the content of methanol and acetonitrile are 80% and 70%, fluorescence intensity is the strongest; when pH is 11.0, the fluorescence intensity is the strongest. In the same temperature, there is little change of fluorescence intensity as time goes by. BODIPY ester has good light stability.

BODIPY ester; fluorescent probe; fluorescence intensity; environmental factor; effect

O657.3

A

1674-344X(2017)8-0011-05

2017-06-27

國(guó)家自然科學(xué)基金(21405036)，湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目(T201718)

鄧櫻花(1979-)，女，湖北荊門(mén)人，副教授，博士，研究方向?yàn)闊晒夥治龌瘜W(xué)。