王明 邵元元 黃仁志 龍?zhí)浦?李章寶

(湖南省蠶?？茖W研究所 410127)

桑椹肥大性菌核病病原生長溫度測定及抑菌藥劑篩選

王明 邵元元 黃仁志 龍?zhí)浦?李章寶

(湖南省蠶桑科學研究所 410127)

采用常規(guī)的微生物學實驗方法，研究桑椹肥大性菌核病病原菌生長溫度。結果表明，該病原菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長良好，可形成白色絮狀圓形菌落，并能產(chǎn)生分生孢子梗和分生孢子，菌絲生長溫度范圍為5～37.5℃，適宜溫度為20～30℃，最適溫度為25℃，菌絲和菌核的致死溫度為50℃、10min 。采用菌絲生長速率法，研究殺菌劑對桑椹肥大性菌核病病原菌的抑制作用試驗，結果表明，8種殺菌劑的3個濃度梯度對桑椹肥大性菌核病病原菌均有一定的抑菌效果。根據(jù)最低劑量使用農(nóng)藥原則，并考慮到田間環(huán)境影響防治效果等因素，篩選出40%菌核凈可濕性粉劑1.33g/L 、25%咪鮮胺和10%丙硫唑懸浮劑2.0g/L作為防治桑椹肥大性菌核病的參考藥劑。

桑椹肥大性菌核?。徊≡?；溫度；殺菌劑；相對抑菌率

桑椹肥大性菌核病是桑椹的一種毀滅性病害。該病在我國大部分桑區(qū)均有發(fā)生。桑椹發(fā)病后，病椹膨大，花被腫厚，呈乳白色或灰白色，弄破后散出臭氣，在桑椹中心有一塊黑色干硬的大菌核。該病病原菌〔Ciboriashiraiana(P.Henn) Wketz.〕是桑椹菌核病的優(yōu)勢種，屬子囊菌亞門、盤菌綱、柔膜菌目、核盤菌科、杯盤菌屬[1]。近幾年來，隨著我國果桑產(chǎn)業(yè)的興起與快速發(fā)展，湖南省旅游區(qū)及城市周邊區(qū)果桑采摘體驗園數(shù)量迅速增加，桑椹肥大性菌核病也隨之在果桑區(qū)普遍發(fā)生，特別是油菜種植區(qū)域發(fā)病率達20%～80%，危害十分嚴重。為了弄清該病在湖南的發(fā)生規(guī)律，并為有效控制該病提供科學依據(jù)，筆者開展了實驗研究。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離與純化

2016年5月采集湖南省蠶?？茖W研究所桑園中的桑椹肥大型菌核病病果，剝?nèi)ネ鈱尤〔」芯?，在無菌操作箱中先用75%乙醇表面消毒1min，再用0.1%氯化汞消毒2min，然后用無菌水漂洗3次后置于無菌濾紙上吸去表面多余水分，最后用無菌解剖刀將菌核切成兩半，將切面貼于PDA培養(yǎng)基(瓊脂20g，葡萄糖15g，土豆200g，水1 000mL，0.01%鏈霉素)平板上，于25℃培養(yǎng)48h后挑取單菌落邊緣菌絲進行純化[2]。

1.2 病原菌菌落形態(tài)觀察

將純化的菌株接種到PDA培養(yǎng)基平板中央，置于25℃恒溫箱中，采取12h光照與黑暗交替培養(yǎng)7～10d，觀察菌落形態(tài)、顏色變化情況，5 d后置于顯微鏡下觀察產(chǎn)生分生孢子情況。

1.3 病原菌生長溫度測定

從分離純化的菌落邊緣取直徑5mm菌餅接種到PDA培養(yǎng)基平板中央，分別置于0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的恒溫箱中培養(yǎng)，每24h分別用十字交叉法測量菌落生長直徑，每個處理設3個重復，取平均值，連續(xù)測量5d。

1.4 菌絲和菌核致死溫度測定

挑取培養(yǎng)7d后的成熟菌絲和經(jīng)表面消毒后的菌核分別置于10mL無菌水試管中，分別放在35℃、40℃、45℃、50℃的水浴中，10min后取出，冷卻后分別接種到PDA培養(yǎng)基平板上測定其活性，每個溫度處理設3個重復，25℃下培養(yǎng)，5d后觀察其生長情況。

1.5 抑菌藥劑室內(nèi)篩選試驗

采用菌絲生長速率法對桑椹肥大性菌核病病原菌進行抑菌藥劑室內(nèi)篩選試驗。每種藥劑分別以3種不同濃度的藥液加入PDA培養(yǎng)基中，再將5mm菌絲塊接種到PDA培養(yǎng)基中央，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，以不加藥劑的為對照，每個處理設3個重復，測量其菌落直徑，計算平均值和相對抑菌率。相相對抑菌率=〔(對照菌落直徑-菌落直徑)/對照菌落直徑〕×100%[3]。

藥劑名稱及添加濃度設置：A. 80%多菌靈可濕性粉劑(一帆生物科技集團有限公司)配制濃度為2.0 g/L、1.33 g/L、1.0g/L 藥液； B. 70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(江蘇龍燈化學有限公司)配制濃度為2.0 g/L、1.33g/L、1.0g/L藥液；C. 50%腐霉利可濕性粉劑(興農(nóng)藥業(yè)(中國)有限公司)配制濃度為2.0 g/L、1.33 g/L、1.0g/L藥液；D. 唑醚·代林聯(lián)水分散粒劑(巴斯夫植物保護(江蘇)有限公司)配制濃度為2.0 g/L、1.33 g/L、1.0g/L 藥液；E. 40%菌核凈可濕性粉劑(山東科大創(chuàng)業(yè)生物有限公司)配制濃度為2.0 g/L、1.33 g/L、1.0g/L 藥液；F. 20%苯甲·嘧菌酯懸浮劑(安徽春暉植物農(nóng)藥廠)配制濃度為4.0 g/L、2.0 g/L、1.33g/L 藥液；J. 25%咪鮮胺(江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司)，配制濃度為4.0 g/L、2.0 g/L、1.33g/L 藥液；H. 10%丙硫唑懸浮劑(貴州道元生物技術有限公司)配制濃度為4.0 g/L、2.0 g/L、1.33g/L 藥液。

2 結果與分析

2.1 病原菌菌落形態(tài)觀察

純化的菌株接種到PDA培養(yǎng)基中央，在25℃、12h光照與黑暗交替下培養(yǎng)，可產(chǎn)生白色絮狀圓形菌落。菌絲緊貼培養(yǎng)基生長，7d菌絲長滿8cm培養(yǎng)皿，開始形成菌絲團，8d在顯微鏡下可觀察到叢生的分生孢子梗和卵形的分生孢子，10d菌絲團開始變成褐色。

2.2 病原菌生長溫度測定

該病原菌在不同的溫度、不同的時間下生長速率均有差異，其菌落直徑見表1和圖1。從表1和圖1結果可以得知，該病原菌在25℃時生長速率最快，為1.24cm/d,其最適溫度為25℃，20℃和30℃生長速率較快，且無顯著差異，其適宜溫度為20～30℃，5℃和37.5℃時生長速率最慢，其生長溫度范圍為5～37.5℃。

表1 溫度與時間對菌絲生長速率的影響

圖1 溫度對桑椹肥大性病原菌生長的影響(培養(yǎng)5d)

2.3 菌絲和菌核致死溫度測定

該病原菌絲和菌核分別放在35℃、40℃、45℃、50℃水浴10min后，均能在PDA培養(yǎng)基上生長形成菌落，而50℃的則不能生長形成菌落，表明該病原菌的菌絲和菌核的致死溫度為50℃、10min。

2.4 抑菌藥劑室內(nèi)篩選試驗

8種常用殺菌劑的各濃度梯度對桑椹肥大性菌核病病原菌的抑菌效果實驗結果見表2。從表2結果得知，8種殺菌劑的3個濃度梯度對桑椹肥大性菌核病病原菌均有一定的抑菌效果，其中，80%多菌靈可濕性粉劑、40%菌核凈可濕性粉劑、25%咪鮮胺和10%丙硫唑懸浮劑3個濃度梯度、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑2.0g/L、1.33g/L 及唑醚·代林聯(lián)水分散粒劑2.0g/L 和20%苯甲·嘧菌酯懸浮劑4.0 g/L 的相對抑菌率均為100%，效果最好，50%腐霉利可濕性粉劑效果較差。

表2 藥劑與濃度對菌絲生長速率的影響

3 討論

桑椹肥大性菌核病是桑椹菌核病的優(yōu)勢種，對桑椹具有毀滅性危害。采用菌核組織分離法等常規(guī)的微生物學實驗方法，研究桑椹肥大性菌核病病原菌生長溫度條件。結果表明，該病原菌菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長良好，可形成白色絮狀圓形菌落，并能產(chǎn)生分生孢子梗和分生孢子。該菌絲生長溫度范圍為5～37.5℃，適宜溫度為20～30℃，最適溫度為25℃。該病原菌的菌絲和菌核的致死溫度為50℃、10min。這些結果為研究該病提供了生物學基礎信息。

采用菌絲生長速率法，研究8種殺菌劑對桑椹肥大性菌核病病原菌的抑制作用試驗，結果表明，8種殺菌劑的3個濃度梯度對桑椹肥大性菌核病病原菌均有一定的抑菌效果，其中，有3種殺菌劑的3個濃度梯度、1種殺菌劑的 2個濃度梯度及2種殺菌劑的 1個濃度梯度抑菌效果最好，其相對抑菌率均為100%。根據(jù)最低劑量使用農(nóng)藥原則，并考慮到田間環(huán)境會影響防治效果等因素，篩選出40%菌核凈可濕性粉劑1.33g/L 、25%咪鮮胺和10%丙硫唑懸浮劑2.0g/L作為防治桑椹肥大性菌核病的參考藥劑。

[1]余茂德，樓程富.桑樹學[M].北京：高等教育出版社，2016：375～378.

[2]方中達.植病研究法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1998：110～155.

[3]呂蕊花，趙愛春，王茜齡，等.桑椹縮小性菌核病病原菌的分類和生物學特性及抑菌藥劑篩選[J].蠶業(yè)科學，2012,38(4)：603～609

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(編號 CARS-22)。