羅亞男 楊永剛 王道平

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校； 2.湄潭銀柜山茶業(yè)有限公司 ； 3.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

黔產(chǎn)綠茶中多酚類物質(zhì)的含量分析

羅亞男1楊永剛2王道平3*

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校； 2.湄潭銀柜山茶業(yè)有限公司 ； 3.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

用高效液相色譜法建立一種成品綠茶中多酚類物質(zhì)含量的分析方法。采用C18型色譜分析柱，流動(dòng)相0.1%磷酸-甲醇梯度洗脫，流速1.0mL/min，檢測波長278nm。結(jié)果表明：茶葉中多酚類物質(zhì)與其它組分的分離效果好，穩(wěn)定性和靈敏度高，各組分回歸方程的相關(guān)系數(shù)均在0.9999以上。

綠茶；茶多酚；高效液相色譜法

貴州湄潭是重要的有機(jī)茶葉之鄉(xiāng)，種茶歷史悠久，環(huán)境條件優(yōu)越，茶葉口感醇爽、濃厚。湄潭茶葉品質(zhì)優(yōu)良，品牌眾多，當(dāng)?shù)匾凿靥洞溲繛殇靥恫枞~代表，著手建立茶葉標(biāo)準(zhǔn)體系。茶葉中多酚類物質(zhì)總稱茶多酚(Tea-Polyphnenols)，主要包括表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)等。茶多酚的檢測就是該標(biāo)準(zhǔn)體系內(nèi)容之一，文獻(xiàn)記載其含量測定常用方法有高效液相色譜法、紫外分光光度法、近紅外光譜法等[1～6]，其中高效液相色譜法因分離效果較好、定量準(zhǔn)確而廣泛應(yīng)用于多酚類化合物的檢測。由于茶多酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老以及降血壓、調(diào)血脂、降血糖等顯著生物活性[7]，也是當(dāng)前食品、醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

采用高效液相色譜儀對茶多酚測定方法進(jìn)行穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性及回收率實(shí)驗(yàn)，建立了黔產(chǎn)茶葉中多酚類物質(zhì)含量的分析方法，該方法靈敏度高，重復(fù)性好，檢測快速準(zhǔn)確，對茶葉產(chǎn)品的生產(chǎn)加工及質(zhì)量保證提供技術(shù)支持，也是建立湄潭茶葉標(biāo)準(zhǔn)體系內(nèi)容之一。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國安捷倫公司1260高效液相色譜儀；梅特勒-托利多十萬分之一電子分析天平(AG285型)；江蘇昆山超聲波提取器(BRANSON200型)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物及試劑

標(biāo)準(zhǔn)品表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)購自中國生物藥品檢定所；甲醇色譜級；EDTA、抗壞血酸為分析純；無水乙醇；分析級磷酸；水為雙蒸超純水。

穩(wěn)定溶液：分別將500 mL無水乙醇、50 mL抗壞血酸(10.0mg/mL)和50 mLEDTA(10.0mg/mL)混合，添加雙蒸超純水至1 000.0 mL，搖勻，備用。

1.3 供試樣品

由湄潭銀柜山茶業(yè)有限公司提供，包括銀柜湄潭翠芽(特級)、銀柜湄潭翠芽(一級)、銀柜毛尖。

2 方法與結(jié)果

2.1 流動(dòng)相

以甲醇和0.1%磷酸作流動(dòng)相，采用梯度洗脫程序，可在45min內(nèi)完成多酚類物質(zhì)的分離。

2.2 對照品溶液的制備

分別稱取4種對照品適量，置于容量瓶中，加穩(wěn)定液溶解、定容，制成濃度分別為56.02μg/mL、75.11μg/mL、371.25μg/mL、392.75μg/mL的表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的混合對照品溶液。4種對照品的PHLC色譜圖如圖1。

2.3 供試品溶液的制備

試驗(yàn)過程中比較了不同提取方法(超聲、回流及索氏提取)和不同提取時(shí)間(0.5h、1.0h、1.5h)對提取效果的影響，結(jié)果顯示采用水浴提取1h即可得到最高提取率。由于茶多酚不穩(wěn)定，極易氧化，所以試驗(yàn)中添加了EDTA和抗壞血酸作抗氧化劑。

精密稱取經(jīng)干燥磨成細(xì)粉的銀柜湄潭翠芽(特級)0.50 g，置于錐形瓶中，加入50mL 穩(wěn)定液，稱重，水浴加熱回流提取1h，冷卻，補(bǔ)重。過濾后，吸取5 mL濾液稀釋至10 mL容量瓶中，穩(wěn)定液定容，過0.45μm微孔濾膜，進(jìn)樣分析。樣品的HPLC色譜如圖2。

2.4 方法與結(jié)論

2.4.1 線性關(guān)系

精密吸取一定量的茶多酚混合對照品溶液，用穩(wěn)定液梯度稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。取5 μL注入液相色譜儀中，測定其峰面積，以峰面積值(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)作圖，得到一條不經(jīng)過原點(diǎn)的直線，四個(gè)指標(biāo)的回歸方程見表1，結(jié)果表明，幾種多酚物質(zhì)進(jìn)樣量在設(shè)定范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 4種兒茶素混合對照品的HPLC色譜圖

圖2 樣品的HPLC色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)物回歸方程R2表沒食子兒茶素(EGC)y=242.06x-0.9758R2=0.9998表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)y=1389.9x-19.105R2=0.9999表兒茶素(EC)y=585.71x-1.50R2=0.9996表兒茶素沒食子酸酯(ECG)y=1789.1x-12.205R2=1.0000

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取銀柜湄潭翠芽(特級)作供樣品，按前述樣品處理方法制備供試液，分別在0h、2h、4h、8h、12h、24h測定4種兒茶素峰面積，RSD值分別為1.27%、1.98%、0.54%、1.03%，說明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。其峰面積變化情況見表2。

2.4.3 精密度試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液作供試樣品，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次5μL，4種兒茶素峰面積的RSD值(n=5)為1.01%、0.32%、2.03%、0.45 %，說明設(shè)備精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取銀柜湄潭翠芽(特級)細(xì)粉6份，按前述樣品處理方法制備供試液，測定4種兒茶素含量，RSD值分別為0.11%、0.98%、1.36%、0.52%，說明方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 回收率試驗(yàn)

根據(jù)重復(fù)性試驗(yàn)的結(jié)果，回收率試驗(yàn)分兩組進(jìn)行，每組各6份，按樣品處理方法制成供試溶液，EC、EGC回收率平均值為102.31%、103.52%， RSD值(n=6)分別為2.89%、3.24%。ECG、EGCG回收率平均值為101.36%、98.39%， RSD值(n=6)分別為2.85%、1.78%，所得回收率RSD值符合要求，表明該處理方法有效可行。

2.5 數(shù)據(jù)驗(yàn)證

按樣品制備項(xiàng)下方法，分別制備三種茶葉樣品的供試液，精密吸取10μL注入液相色譜儀，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中兒茶素的含量，結(jié)果顯示試驗(yàn)重現(xiàn)性良好、結(jié)果準(zhǔn)確、實(shí)驗(yàn)操作便捷可行，結(jié)果見表3。

表2 4種兒茶素穩(wěn)定性試驗(yàn)

表3 茶葉樣品中4種兒茶素含量

3 討論

根據(jù)檢測結(jié)果可知，采用該試驗(yàn)的高效液相色譜測定方法，主要檢測指標(biāo)具有良好的分離度和線性關(guān)系，該法簡單快速準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測快速準(zhǔn)確，可用于茶葉的質(zhì)量控制研究。

由于原料、生產(chǎn)工藝及儲存條件的不同均會引起茶葉中兒茶素含量的變化，因此，論文中的檢測結(jié)果僅是體現(xiàn)對該試驗(yàn)方法的論證和探討，而茶葉等級評定還需結(jié)合香氣、滋味、氨基酸、咖啡因、微量元素等指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)。

[1] 呂生，滿紅平，姜東華，等．兩種方法測定普洱茶中茶多酚含量的比較[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2011,S2:461～463.

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貴州省衛(wèi)生廳科技基金項(xiàng)目gzwkj2010-1-069；黔南州科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010)22號；黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?？蒲谢痦?xiàng)目黔南醫(yī)專校字(2009)80號；中藥、民族藥創(chuàng)新研究平臺及能力建設(shè): 黔科中引地(2016)4004號。

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