周俊，張卓敏，吳巳蕓，陳磊*，丁重陽

1(江南大學，糖化學與生物技術教育部重點實驗室, 江蘇 無錫, 214122)2(江南大學，糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心, 江蘇 無錫, 214122)3(江南大學 生物工程學院, 江蘇 無錫, 214122)

虎奶菇(Pleurotustuber-regium)，是一種能產(chǎn)生大型菌核和子實體的食藥用真菌，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國江西、云南等地也有發(fā)現(xiàn)和種植?；⒛坦降淖訉嶓w和菌核富含揮發(fā)油、氨基酸以及多糖類物質，在民間被用于治療頭痛、胃痛、哮喘、天花、高血壓等多種疾病[1]?；⒛坦讲煌l(fā)育階段的細胞壁組成及含量差異很大，其中菌核細胞壁含量高達(78.4±0.7)%干重，遠高于菌絲體和子實體[2-4]。菌核細胞壁的主要成分為超支化β-葡聚糖，主要由β-1,4-D-Glcp主鏈和β-1,6-D-Glcp支鏈構成，并有少量β-1,3-D-Glcp殘基存在于支鏈中，其分支位點主要在主鏈葡萄糖的O-6位，分支度從63%～70%不等[5]。作為一類特殊的β-葡聚糖，該多糖不僅有良好的膳食纖維和益生元功能，還具有免疫調節(jié)和直接殺傷腫瘤細胞的活性[6]。菌核良好的藥理活性(如抗癌、免疫調節(jié)、抗炎等)，也被認為與其特有的超支化β-1,4,6-葡聚糖含量高有關[7-8]。

菌核是真菌菌絲在缺乏營養(yǎng)或不利環(huán)境中繼續(xù)分化形成的一種致密堅硬的休眠器官[9]，具有抵御不良環(huán)境并貯存營養(yǎng)的功能。研究表明，食用菌的菌核可以在干旱、低溫、微生物攻擊等惡劣環(huán)境中休眠，并在適宜的環(huán)境下萌發(fā)形成菌絲或子實體[10]。目前，虎奶菇菌核的生成還是通過袋料培養(yǎng)，其具體的形成機制還不明確。由于生長緩慢(菌絲長滿袋料后3個月左右)且對環(huán)境條件要求嚴苛[11]，虎奶菇菌核發(fā)育的基礎研究相對困難，菌核的人工栽培和代謝機制研究也受到了較大限制，這一現(xiàn)狀也嚴重影響了其中超支化β-葡聚糖和糖蛋白等活性成分的研究與開發(fā)。因此，通過更為簡便快捷的培養(yǎng)方式獲得虎奶菇菌核，并解析影響菌核生成的關鍵因素，是深入開發(fā)虎奶菇菌核資源及其超支化β-葡聚糖等高附加值產(chǎn)品的基礎。

本研究采用平板培養(yǎng)的方式，探索影響虎奶菇菌核生成的影響因素。首先，比較溫度、pH等因素對虎奶菇菌核形成的影響，基于活性氧(reactive oxygen species ，ROS)誘發(fā)菌核生成理論測定胞內(nèi)過氧化氫的變化，進而通過在培養(yǎng)基中添加過氧化氫和抗壞血酸探討氧化劑和還原劑對虎奶菇細胞分化形成菌核的影響，結合實時熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)驗證過氧化氫在虎奶菇菌核形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑

虎奶菇(Pleurotustuber-regium)菌種，香港中文大學Cheung, Chi Keung Peter教授贈予。培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯：200、葡萄糖20、瓊脂20；過氧化氫檢測試劑盒(S0038)、過氧化氫酶檢測試劑盒(S0051)，上海碧云天生物技術有限公司；RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa；ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix，Vazyme。

1.1.2 儀器與設備

Enspire 2300型酶標儀，美國PerkinElmer公司；FA1004型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；LDZX-40BI型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；PB-10型pH計，季爾國際貿(mào)易上海有限公司；SPX-252B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司；StepOnePlus型實時熒光定量PCR儀，美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 虎奶菇菌絲體的培養(yǎng)

將虎奶菇菌種接種在PDA平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，4 ℃保藏，定期進行轉接。

1.2.2 菌核生成的影響

1.2.2.1 溫度對虎奶菇菌核形成的影響

將虎奶菇菌種接種于PDA平板上，置于30 ℃培養(yǎng)7 d至菌絲長滿平板，分別放置于15、20、25、30 ℃培養(yǎng)，觀察菌核形成情況。

1.2.2.2 pH對虎奶菇菌核形成的影響

配制PDA培養(yǎng)基，分別用鹽酸和氫氧化鈉調節(jié)pH值為4、5、6、7、8、9。接種虎奶菇菌種，于30 ℃培養(yǎng)至菌絲長滿平板，轉至25 ℃培養(yǎng)，觀察菌核形成情況，取培養(yǎng)30 d的菌絲和菌核測量過氧化氫含量和過氧化氫酶活力。

1.2.2.3 過氧化氫對虎奶菇菌核形成的影響

用無菌水將30%(體積分數(shù))過氧化氫梯度稀釋至1、10-1、10-2、10-3mol/L，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。配制PDA培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至65 ℃添加上述4種濃度的過氧化氫溶液至培養(yǎng)基中，使過氧化氫終濃度分別為10-2、10-3、10-4、10-5mol/L，混合均勻后倒平板，冷卻后接種虎奶菇菌種，于30 ℃培養(yǎng)至菌絲長滿平板，轉至25 ℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)，觀察菌核形成情況，取培養(yǎng)30 d的菌絲和菌核測量過氧化氫含量和過氧化氫酶活力。

1.2.2.4 抗壞血酸對虎奶菇菌核形成的影響

用無菌水溶解抗壞血酸后，將質量濃度梯度稀釋至0.3、0.1、0.01 g/L，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。配制PDA培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至65 ℃添加上述抗壞血酸溶液，使抗壞血酸終質量濃度為0.003、0.001、0.000 1 g/L，混合均勻后倒平板，冷卻后接種虎奶菇菌種，于30 ℃培養(yǎng)至菌絲長滿平板，轉至25 ℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)，觀察菌核形成情況，取培養(yǎng)30 d的菌絲和菌核測量過氧化氫含量和過氧化氫酶活力。

1.2.3 測定指標及方法

1.2.3.1 菌絲生長速度測定

因前3 d菌絲主要處于萌發(fā)階段，生長緩慢，因此從培養(yǎng)4 d后，每天采用十字交叉法測定菌落直徑。根據(jù)公式(1)計算菌絲生長速度：

(1)

1.2.3.2 菌核形成量測定

觀察菌核形成時間，對生長至30 d的培養(yǎng)皿進行拍照記錄，用滅菌后的鑷子挑取出平板上的菌核，并小心剝離去除菌核周圍的菌絲，余下的致密堅硬部分即為菌核，進行稱重測定。

1.2.3.3 過氧化氫含量及過氧化氫酶活力的測定

分別挑取各處理組中正在形成的菌核及其周邊未分化的菌絲，參考過氧化氫檢測試劑盒(S0038)、過氧化氫酶檢測試劑盒(S0051)的使用說明，分別測定過氧化氫含量和過氧化氫酶的活力。

1.2.4 RT-qPCR驗證

挑取培養(yǎng)基中含10-2mol/L過氧化氫培養(yǎng)條件下的菌核和未分化的菌絲，按照RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒提取RNA，采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA，候選基因和內(nèi)參基因的引物采用Beacon Designer V7.9設計(表1)，采用ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix進行試驗。具體條件：95 ℃變性30 s，95 ℃(10 s)，60 ℃(1 min)，循環(huán)40次。以18S基因為內(nèi)參，通過2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 菌核形成的最適溫度

菌核作為虎奶菇應對不良環(huán)境的休眠體，溫度對其形成具有重要影響。通過前期溫度對菌核形成的影響實驗發(fā)現(xiàn)，30 ℃時菌絲長滿平板的時間為7 d，25 ℃時菌絲長滿平板為14 d左右，15 ℃及20 ℃下菌絲生長過于緩慢，需4周及以上。虎奶菇主要生長于熱帶和亞熱帶地區(qū)，其菌絲體適宜生長溫度為 28～32 ℃，在平板培養(yǎng)和液態(tài)發(fā)酵時的最適溫度為30 ℃[12]。因此，選擇在30 ℃時待菌絲鋪滿平板，再分別置于30、25、20、15 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。由圖1可知，30 ℃平板中有明顯菌絲集結，25 ℃培養(yǎng)的平板中可見明顯的小菌核生成，而20 ℃和15 ℃平板無明顯菌絲聚集和菌核形成現(xiàn)象。分別挑取30 ℃和25 ℃培養(yǎng)出的菌核進行稱量和觀測，30 ℃培養(yǎng)的菌核產(chǎn)量[(30.19±3.32) mg]顯著低于25 ℃培養(yǎng)時[(76.03±8.45) mg]，且形成的菌核不如25 ℃時形成的致密。由于30 ℃為虎奶菇菌絲體生長的最適溫度，更多的營養(yǎng)成分用于菌絲體的生長蔓延；而在25 ℃時，適當?shù)牡蜏孛{迫促進了菌絲的分化，更利于菌核的形成。繼續(xù)降低溫度則會顯著減緩菌絲的生長，其原因可能為溫度降低后細胞內(nèi)的各種酶活力也隨之受到抑制，菌體代謝活動減弱，不利于菌核形成。因此，后續(xù)選擇25 ℃作為菌核的培養(yǎng)條件，這與袋料培養(yǎng)階段菌核最適宜的溫度為23～28 ℃相吻合[11]。

表1 RT-qPCR的候選基因及內(nèi)參基因Table 1 Candidate genes and reference genes of RT-qPCR

a-15 ℃；b-20 ℃；c-25 ℃；d-30 ℃圖1 溫度對菌核形成的影響Fig.1 The impact of temperature on sclerotia formation

2.2 pH對虎奶菇菌核形成的影響

由圖2-a可知，中性及偏堿性的pH值(pH 7～9)對菌絲生長無明顯影響，酸性環(huán)境則會顯著抑制菌絲的生長(pH 4～6)。如圖2-b及圖2-c所示，在pH值為5時，菌核形成最多，隨著pH的升高(pH值為7除外)，菌核形成量減少，而pH值為4時，菌核形成量最低。因此，弱酸性環(huán)境(pH值為5)更利于菌核的形成，而過度的外界酸堿脅迫則不利于菌核的形成。這可能是因為pH過低會導致細胞內(nèi)酶活力受到抑制，因此代謝活動減弱，不利于菌絲的生長和分化。

ROLLINS等[13]研究表明環(huán)境pH值在核盤菌菌核發(fā)育中起著重要的調節(jié)作用，且發(fā)現(xiàn)存在一個保守的pH值依賴信號通路在真菌中起作用，酸性環(huán)境有利于菌核發(fā)育，中堿性環(huán)境則抑制菌核發(fā)育，但是具體機制仍不明確。ROS誘發(fā)菌核生成理論認為菌核的分化是由氧化脅迫造成，即外界不良環(huán)境會引起絲狀真菌細胞內(nèi)氧化應激反應的發(fā)生，導致過氧化氫、超氧陰離子等活性氧物質的爆發(fā)及脂質過氧化濃度的升高，從而誘導細胞分化形成菌核[14]。過氧化氫是氧化應激的直接信號分子，還參與細胞的增殖與分化過程[15]。過氧化氫酶則是一種典型的ROS清除劑，在生物體內(nèi)參與防御反應并控制細胞內(nèi)的氧化還原平衡[16]。因此，通過測定未分化的菌絲和分化的菌核中過氧化氫含量以及過氧化氫酶活力，有助于分析pH值在菌核分化中對細胞的影響。

如圖2-d所示，所有pH值下未分化的菌絲中過氧化氫含量均顯著高于菌核，且pH值為5時菌核中過氧化氫含量最低(0.046 mol/g)。此外，所有pH值下菌核中過氧化氫酶活力均顯著高于菌絲體(圖2-e)，且酶活力的變化趨勢與菌核產(chǎn)量較為一致(圖2-b)。產(chǎn)生菌核較多的pH 5、pH 7和對照組(CK)中過氧化氫酶活力與菌絲中差異更大，而pH值為4時其過氧化氫酶活力均偏低。由此可以推斷，pH值的變化會引起菌絲細胞內(nèi)過氧化氫的變化，當積累的過氧化氫含量超過其所能降解的量時，細胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應激，促進菌絲分化形成菌核，一方面分泌更多的過氧化氫酶，用以分解過氧化氫，減少其對細胞的損害；另一方面使細胞壁增厚以抵御外界不良環(huán)境。

a-菌絲生長速度；b-菌核的質量；c-菌核表型觀察；d-過氧化氫含量；e-過氧化氫酶活力圖2 pH對菌核形成的影響Fig.2 Effect of pH on sclerotia formation

2.3 過氧化氫對虎奶菇菌核形成的影響

由于過氧化氫在虎奶菇菌絲分化形成菌核的過程中起著重要作用，因此，通過外源添加不同濃度的過氧化氫以測定其對菌核形成的影響。如圖3-a所示，當培養(yǎng)基中添加的過氧化氫濃度達到10-3mol/L時，開始對菌絲的生長產(chǎn)生輕微的抑制作用；濃度為10-2mol/L時，則能夠顯著抑制菌絲的生長。由圖3-b可知，過氧化氫濃度為10-2mol/L時，形成菌核的質量最高，隨著過氧化氫濃度的降低，形成菌核的質量隨之降低。PAPAPOSTOLOU等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在Sclerotiumrolfsii和Sclerotiniasclerotiorum中，較高濃度的過氧化氫會促進其菌核的分化，這與本研究的結果一致。

與pH值對菌核生成影響的試驗中測定的結果一致，菌絲中的過氧化氫含量均顯著高于菌核，而菌核中的過氧化氫酶活力均明顯高于菌絲(圖3-d和圖3-e)。當添加的過氧化氫濃度為10-2mol/L時，其菌核產(chǎn)量最高，菌絲細胞內(nèi)過氧化氫含量最高，菌核及菌絲的過氧化氫酶活力相對偏高，且發(fā)現(xiàn)添加過氧化氫的菌核中過氧化氫酶活力均略高于未添加組。這表明，細胞的分化與胞內(nèi)過氧化氫含量和過氧化氫酶活力的變化密切相關，外界添加的過氧化氫亦是通過刺激生物體內(nèi)的氧化應激反應進而觸發(fā)菌絲細胞的分化和菌核的形成。

2.4 抗壞血酸對虎奶菇菌核形成的影響

抗壞血酸又名維生素C，是一種在代謝中能夠有效清除生物體內(nèi)ROS的抗氧化劑。在PDA培養(yǎng)基中添加抗壞血酸進行虎奶菇培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸非常不利于菌絲分化形成菌核。如圖4-a所示，當抗壞血酸質量濃度為10-4g/L時，對菌絲的生長影響較小，隨著質量濃度的增高，對菌絲的生長抑制越大。對菌核的分化亦如此，當抗壞血酸質量濃度為10-4g/L時，細胞分化情況與對照組相比明顯減少，當抗壞血酸質量濃度為10-3g/L和3×10-3g/L時，則完全抑制菌核的分化(圖4-b)。GEORGIOU等[17]發(fā)現(xiàn)菌核分化可能受到真菌自身抗氧化反應的調節(jié)，而外源添加的抗壞血酸可以通過降低胞內(nèi)ROS和脂質過氧化物濃度從而抑制菌核分化。由較高濃度的過氧化氫促進菌核形成和抗壞血酸抑制菌核形成的結果，可推斷氧化應激是虎奶菇菌核分化的觸發(fā)機制。由于抗壞血酸基本抑制菌核的分化，無法收集菌核稱重比較和測定相關參數(shù)，故只能測定菌絲的過氧化氫濃度和過氧化氫酶活力。由圖4-c和圖4-d所示，菌絲的過氧化氫含量隨著抗壞血酸含量的升高略有降低，而過氧化氫酶活力并無顯著性差別，這是由于添加的抗壞血酸起到了外加抗氧化劑的作用，可降低胞內(nèi)過氧化氫濃度，但對胞內(nèi)過氧化物酶則無影響。

a-菌絲生長速度；b-菌核的質量；c-菌核表型觀察；d-過氧化氫含量；e-過氧化氫酶活力圖3 過氧化氫對菌核形成的影響Fig.3 Effect of hydrogen peroxide concentration on sclerotia formation

根據(jù)ROS誘發(fā)菌核形成理論，真菌受到溫度、pH值、ROS等外界環(huán)境的刺激，造成氧化脅迫，引起細胞內(nèi)氧化應激進而分化形成菌核[9]。在該過程中，過氧化氫等ROS會大量沉積在菌絲細胞壁上和細胞器膜周圍[18]，產(chǎn)生的氧化應激信號可通過多種信號通路從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎薣19]，進而觸發(fā)菌絲細胞的分化和菌核的形成。此外，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路參與氧化應激信號的傳遞，調節(jié)細胞壁蛋白的糖基化，從而促進菌絲形態(tài)的改變，形成菌核[20-21]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，菌核的細胞壁含量顯著高于子實體以及菌絲體的細胞壁含量[2-4]。因此，篩選過氧化氫酶、MAPK通路以及細胞壁合成相關基因(表1)進行RT-qPCR驗證。如圖5所示，參與細胞壁合成的基因GME1020_g、GME9903_g以及與過氧化氫酶相關的基因GME2693_g、GME4097_g表達量均顯著上調(Log2FC>1.4)，且菌核中GME1020_g、GME9903_g表達量的Log2FC>5，影響更為顯著，該結果與菌核細胞壁增厚和上述過氧化氫酶活力增加的結果相符。但是，涉及MAPK通路的基因GME11266_g和GME7057_g分別有所上調和下調，表明MAPK通路在菌核分化中有所作用，但具體的作用方式還有待深入研究。

a-菌絲的生長速度；b-菌核表型觀察；c-過氧化氫含量；d-過氧化氫酶活力圖4 抗壞血酸濃度對菌核形成的影響Fig.4 Effect of ascorbic acid concentrations on sclerotia formation

圖5 菌核相對菌絲的目的基因表達量Fig.5 Target gene expression of sclerotia relative to mycelia

3 結論

該研究采用PDA培養(yǎng)基平板恒溫培養(yǎng)的方法實現(xiàn)了虎奶菇菌核的簡便快捷培養(yǎng)，具體條件為調節(jié)培養(yǎng)基pH值為5，接種后30 ℃預培養(yǎng)至菌絲長滿平板，然后轉移至25 ℃恒溫培養(yǎng)30 d，可產(chǎn)生明顯的菌核。在25 ℃條件下更有利于虎奶菇菌核形成，而溫度過高(30 ℃)更適于菌絲生長，溫度過低則會顯著抑制菌核形成。通過測定培養(yǎng)基pH對菌核形成的影響發(fā)現(xiàn)，弱酸性環(huán)境(pH 5)會輕微抑制菌絲生長，但有利于菌核形成。不同pH培養(yǎng)條件下菌絲中的過氧化氫含量均顯著高于菌核，但過氧化氫酶活力則顯著低于菌核，后者的變化趨勢與菌核形成較為一致。在培養(yǎng)基中添加不同濃度的過氧化氫和抗壞血酸后發(fā)現(xiàn)，適當濃度的過氧化氫(10-2mol/L)有利于菌核形成，但抗壞血酸則會抑制菌絲細胞分化形成菌核。RT-qPCR結果顯示，在菌核形成過程中，過氧化氫酶和細胞壁合成相關基因的表達量均顯著上調，而MAPK途徑也參與了氧化還原信號的轉導。結合前期研究結果和文獻報道可知，外界的溫度、pH和氧化還原環(huán)境等變化會產(chǎn)生氧化應激信號或引起菌絲細胞內(nèi)ROS濃度的升高，當升高至一定量時，胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應激，細胞核做出反應，觸發(fā)菌絲細胞的分化和菌核的形成，一方面分泌更多的過氧化氫酶等抗氧化酶，用以分解ROS，減少其對細胞的損害；另一方面使細胞壁增厚以抵御外界不良環(huán)境。