宋翠翠, 李 昕, 盧 菲, 白仲虎, 楊艷坤

(1. 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室， 無錫 214122； 2. 江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室， 無錫 214122； 3. 江南大學 糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122)

25-羥基維生素D化學發(fā)光檢測試劑盒的研發(fā)

宋翠翠1,2,3, 李 昕1,2,3, 盧 菲1,2,3, 白仲虎1,2,3, 楊艷坤1,2,3

(1. 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室， 無錫 214122； 2. 江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室， 無錫 214122； 3. 江南大學 糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122)

研制了用于定量檢測人血清中25-羥基維生素D(25-OHD)水平的化學發(fā)光法檢測試劑盒，并對試劑盒各項性能指標進行驗證。試劑盒建立的方法為：將25-OHD單克隆抗體包被于微孔板中，將血清樣品與釋放劑同時加入微孔板中進行孵育，使樣品的25-OHD充分釋放出來并與包被板上的25-OHD抗體相結(jié)合。再加入酶結(jié)合物(生物素化25-OHD和鏈霉親和素化過氧化物酶(SA-HRP)的混合物)，使之與25-OHD抗體相結(jié)合，形成競爭免疫復合物，隨后洗滌除去未結(jié)合的物質(zhì)，加入化學發(fā)光底物，使用化學發(fā)光免疫分析儀讀取相對發(fā)光強度(RLU)。制備的25-OHD檢測試劑盒最低檢出限為4.9 ng/mL，準確度相對偏差在±10%以內(nèi)，批內(nèi)變異系數(shù)小于10%，批間變異系數(shù)小于15%，2℃～8℃存放有效期為1年。對200份臨床血清樣本進行檢測，與參比試劑盒檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R=0.9717。試劑盒各項性能指標均符合行業(yè)標準要求，具有靈敏，穩(wěn)定，快速，簡便等特點。

25-羥基維生素D；化學發(fā)光法；試劑盒

AbstractIn this paper, a chemiluminescent immunoassay (CLIA) kit for quantitative assay of 25-hydroxyvitamin D(25-OHD)in serum was developed and evaluated. The kit is established as follows: first, 25-hydroxyvitamin D monoclonal antibodies was coated with the 96 well microplate, then the serum sample and the release reagent were added into the microplate. After incubation, the 25-OHD of the sample was fully released and combined with the 25-OHD antibody coated on the microplate. HRP conjugate (mixture of biotinylated 25-OHD and streptavidin-labeled HRP ) compete with the 25-OHD released from sample to antibodies. After washing and adding the CLLIA substrate, the relative luminous intensity was read with chemiluminescent immunoassay analyzer. The minimum detection limit of the kit is 4.9 ng.mL-1, with the bias of less than 10%. The intra-assay and inter-assay coefficients of variation were less than 10%, and 15%, respectively. Its preserving duration could be as long as 12 months at 2-8℃. Two hundred clinical serum specimens were tested with this kit and a foreign made serum ferritin kit, the correlation coefficient was 0.9717. 25-hydroxy vitamin D (CLIA) quantification detection kit was successfully prepared, and all the technical parameters reached the industrial standards. The developed kit is sensitive, stable, fast and simple.

Keywords25-hydroxyvitamin D; chemiluminescent immunoassay; kit

維生素D(Vitamin D，VD)是一種固醇類衍生物，是人體代謝所必需的營養(yǎng)物質(zhì)[1]。其主要形式有維生素D2和維生素D3。維生素D2是由酵母菌中的麥角固醇經(jīng)陽光或紫外線照射后的產(chǎn)物，維生素D3主要是由高等動物表皮或皮膚組織中7-脫氫膽固醇在紫外線或陽光照射下經(jīng)光化學反應(yīng)生成[2]。人體獲得VD的主要途徑為：食物攝入與經(jīng)陽光照射皮膚合成。人體獲取的維生素D在體內(nèi)經(jīng)血液循環(huán)轉(zhuǎn)運至肝臟，在肝酶的作用下轉(zhuǎn)化為25-OHD，25-OHD再轉(zhuǎn)運到腎臟，經(jīng)第二次羥基化轉(zhuǎn)化為具有活性的1,25-二羥基維生素D(1，25-(OH)2D)[3]，1，25-(OH)2D通過與靶細胞維生素 D受體結(jié)合發(fā)揮其強大的生物學作用[4-5]。人體內(nèi)維生素D、25-OHD和1，25-(OH)2D的半衰期分別為24 h、3周和4 h[6]。其中25-OHD半衰期較長且波動較小，因此血清25-OHD含量是目前國際公認的衡量機體VD營養(yǎng)狀態(tài)的指標[7-8]。

維生素D的經(jīng)典作用是調(diào)節(jié)鈣磷水平，影響骨骼健康。但近來研究發(fā)現(xiàn)，除了傳統(tǒng)的骨骼效應(yīng)，維生素D還與自身免疫疾病[9]、糖尿病[10]、心血管疾病[11-12]、癌癥[13]等疾病相關(guān)。而現(xiàn)今維生素D缺乏現(xiàn)象非常普遍，據(jù)調(diào)查，全球約有10億人處于VD缺乏狀態(tài)[7]。血清中25-OHD最佳水平并沒有明確的定義，但很多文獻報道普遍定義血清25-OHD水平低于20 ng/mL時為維生素D缺乏，21～29 ng/mL時為不足， 大于等于30 ng/mL為充足[7-8]。

現(xiàn)已有的25-OHD檢測方法有放射免疫法(RIA)，酶聯(lián)免疫法(ELISA)，化學發(fā)光法(CLIA)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)。其中化學發(fā)光法以其靈敏度高，線性范圍寬，無污染，操作方便等優(yōu)勢，成為發(fā)展趨勢。本試劑盒的研制采用競爭化學發(fā)光法，以25-羥基維生素D抗體包被微孔板，制成固相抗體，用生物素化25-OHD和SA-HRP的混合物與抗原競爭性結(jié)合到固相抗體上，以魯米諾和過硼酸鈉為化學發(fā)光底物，建立了快速簡便的用于定量檢測人血清中25-羥基維生素D水平的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

空白化學發(fā)光板購于美國Costar公司。25-羥基維生素D、鏈酶親和素、牛血清白蛋白(BSA)購于美國Sigma公司。25-羥基維生素D單克隆抗體定制于鎮(zhèn)江博安特生物技術(shù)有限公司。生物素化25-OHD受贈于江南大學藥物化學與藥物分析研究室。辣根過氧化物酶(HRP)購自于美國Thermo Fisher公司。馬血清購于北京索萊寶公司。200例臨床血清樣本及參比試劑檢測值來自于上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院和復旦大學附屬金山醫(yī)院。

1.2 儀器

廈門天中達化學發(fā)光免疫分析儀，檢測儀器型號為TZD-CL-200S。洗板機購于英國Anthos公司，型號為Fluido2。平板震蕩儀購于上海漢林，型號為Mix-1500。

1.3 方法

1.3.1 包被板的制備

將25-羥基維生素D抗體溶于0.1 mol/L的PB緩沖液(pH 7.0)中，稀釋至最佳濃度，磁力攪拌器攪拌30 min，確保包被液充分混勻。包被板微孔中每孔加入100 μL包被液，2℃～8℃靜置過夜。倒掉包被液，用洗液洗板一次，每孔加入200 μL封閉液(含2%BSA，5%蔗糖的PB緩沖液)，2℃～8℃靜置過夜。倒掉封閉液，吹干，密封。

1.3.2 校準品的制備

將濃度為1 mg/mL的25-羥基維生素D的溶液，添加到馬血清中，配制校準品1～5，理論濃度分別為7.5、15、30、60和120 ng/mL。校準品0為含4% BSA的磷酸鹽緩沖液。將校準品0～5分裝于棕色瓶中，低溫凍干。凍干校準品加入去離子水復溶后，用羅氏的25-OHD檢測體系進行賦值。

1.3.3 質(zhì)控品的制備

取經(jīng)標定的高值校準品，用校準品0配制成濃度為15、30和60 ng/mL的25-羥基維生素D質(zhì)控品。

1.3.4 鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶(SA-HRP)的制備

取5 mg辣根過氧化物酶(HRP)溶于2 mL無菌水中，并加入0.2 mL NaIO4(21 mg/mL)， 0℃冰浴放置15 min; 將反應(yīng)物置于醋酸鈉緩沖液中，4℃透析 12～24 h; 小心吸出混合液，加入0.3 mL乙二醇(0.16 mol/mL)，0℃封閉1 h; 混合液加入10 mg鏈酶親和素，于碳酸緩沖液中4℃透析 12～24 h; 結(jié)合物加0.1 mL NaBH4，混勻，4℃還原3 h; 加入等體積飽和硫酸銨，4℃鹽析24 h; 次日取出混合物6000 r/min離心20 min，棄上清，沉淀用0.5 mL生理鹽水溶解備用; 整個操作步驟注意避光[15]。

1.3.5 最佳抗體包被濃度、生物素化25-OHD工作濃度的確定

以棋盤滴定法通過檢測校準品0和校準品5的光子數(shù)來確定最佳抗體包被濃度和生物素化25-OHD工作濃度。包被抗體稀釋到1、2、3和4 μg/mL；生物素化25-OHD濃度選用: 100、50和25 ng/mL；根據(jù)實驗室已有基礎(chǔ)，選擇的SA-HRP稀釋倍數(shù)為1∶10 000(1 W)。

1.3.6 最佳SA-HRP工作濃度的確定

以單因素實驗通過檢測校準品0和校準品5的光子數(shù)來確定SA-HRP最佳工作濃度。選用最佳抗體包被濃度，最佳生物素化25-OHD工作濃度；SA-HRP稀釋倍數(shù)選用：1∶10 000(1W)、1∶20 000(2W)、1∶40 000(4W)。

1.3.7 樣本前處理方法

由于血清中幾乎所有循環(huán)的25-羥基維生素D都是與維生素D結(jié)合蛋白(DBP)和白蛋白結(jié)合存在的。想要測定血清中25-羥基維生素D的濃度，首先需要將其從DBP和白蛋白上釋放出來。本實驗采用的樣本前處理方法為：30 μL血清中加入100 μL釋放劑震蕩(500 bp)反應(yīng)120 min，能夠使血清中的25-羥基維生素D完全釋放。

1.3.8 試劑盒原理

本試劑盒采用競爭化學發(fā)光法體外定量檢測血清中的25-羥基維生素D的濃度。在預包被了25-OHD單克隆抗體的微孔板中，加入校準品、血清樣品及釋放劑后，樣品中釋放出來的25-OHD與包被板上的25-OHD抗體相結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)，再加入酶結(jié)合物(生物素化25-OHD和SA-HRP的混合物)，使之與25-OHD抗體相結(jié)合，形成競爭免疫復合物，隨后洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)，加入化學發(fā)光底物后，使用化學發(fā)光免疫分析儀讀取相對發(fā)光強度(RLU)。

1.3.9 試劑盒操作步驟

首先在預包被了25-OHD抗體的微孔板中，加入30 μL校準品、血清樣品和100 μL釋放劑，在平板震蕩儀上(500 bp)震蕩反應(yīng)120 min。加樣完成后的10 min之內(nèi)完成酶結(jié)合物工作液的配制(生物素化25-OHD和SA-HRP混合物工作液)，避光放置。然后洗板5次，去除未結(jié)合的物質(zhì)，再每孔加入200 μL酶結(jié)合物工作液，平板震蕩儀上(500 bp)反應(yīng)30 min。洗板5次后，加入100 μL底物(50 μL底物A與50 μL底物B)，使用化學發(fā)光免疫分析儀讀取相對發(fā)光強度(RLU)。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用四參數(shù)曲線模型對結(jié)果進行分析，根據(jù)已知不同濃度的25-OHD校準品的RLU值繪制校準曲線，通過曲線計算血清樣品中的25-羥基維生素D濃度。

1.3.11 試劑盒性能

1)最低檢出限

平行測定10孔0 ng/mL 25-羥基維生素D校準品的相對發(fā)光強度(RLU)，計算RLU的平均值(M)與RLU標準差(SD)。利用劑量-反應(yīng)曲線計算出(M-2SD)對應(yīng)的濃度值為最低檢出限。

2)準確度

使用濃度為15 ng/mL和30 ng/mL的25-OHD質(zhì)控品作為樣本按照上述實驗步驟進行檢測，各重復測定3次，測量濃度結(jié)果的平均值記為(Mi)，根據(jù)公式(1)分別計算相對偏差(Bi)。

Bi(%)=(Mi-T)/T×100%

(1)

式中：Bi—相對偏差；

Mi—測量濃度的平均值；

T—標定濃度。

3)精密度

選用高、中、低(60、30和15 ng/mL)3個水平的質(zhì)控品，在同一次試驗中各重復檢測10次，計算各質(zhì)控品的變異系數(shù)(CV)，即為批內(nèi)精密度。選用3個不同批次的試劑盒，測定同一質(zhì)控品(30 ng/mL)的濃度，各重復檢測10次，計算30次測量濃度結(jié)果的平均值和標準差，可得3批試劑盒間的變異系數(shù)，即為批間精密度。

4)熱穩(wěn)定性

選用同一批試劑盒在37℃分別放置5 d和10 d，與在4℃放置的試劑盒進行比較，分別檢測試劑盒的最低檢出限、準確度和精密度。

5)臨床應(yīng)用

取200份臨床血清分別用參比試劑盒和本試劑盒進行檢測。以參比試劑(羅氏)檢測值作為X軸，以本試劑盒檢測值作為Y軸，計算本試劑盒與參比試劑盒檢測值的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 校準品的賦值及校準曲線的繪制

25-OHD凍干校準品復溶后，用羅氏的25-OHD檢測體系進行賦值。校準品理論值與實測值見表1。以實測值為準，所以定義25-OHD校準品0～5的濃度分別為0、7.53、14.32、28.42、58.48和115.3 ng/mL。以校準品濃度為X軸，測得光子數(shù)為Y軸，繪制25-OHD校準曲線，見圖1，校準曲線線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。

表1 校準品賦值結(jié)果

2.2 最佳抗體包被濃度、生物素化25-OHD工作濃度的確定

用棋盤滴定法，篩選包被抗體和生物素化25-OHD的最佳濃度，結(jié)果見表2。當 RLU(115.3 ng/mL)/RLU(0 ng/L)的比值在 0.1～0.2時，選擇生物素化25-OHD的最小濃度作為最佳工作濃度。從表2看出，當抗體包被濃度為3 μg/mL，生物素化25-OHD濃度為25 ng/mL 時，RLU(115.3 ng/mL)/RLU (0 ng/mL)=2 107 565/133 750=0.157，因此生物素化維生素D衍生物最佳工作濃度為25 ng/mL。 從圖2看出，當抗體包被濃度為3 μg/mL時，包被基本達到飽和，所以確定抗體的最佳包被濃度為3 μg/mL。

圖1 25-羥基維生素D校準曲線

生物素化25-OHD濃度(ng/mL)1005025校準品濃度ng/mL0115.30115.30115.3抗體包被濃度(μg/mL)12341203925204657025476502609465129345215630226715279801086712518171652230075243204012273518250019122522869091716517060052107565219849585080138605133750180775

圖2抗體包被量對0值校準品光子數(shù)的影響

Fig 2 The influence of antibody coating concentration on zero standard RLU

2.3 SA-HRP最佳工作濃度的確定

選擇最優(yōu)的抗體包被量3 μg/mL及生物素化25-OHD工作濃度25 ng/mL。SA-HRP稀釋倍數(shù)選擇：1W、2W和4W。測定校準品0和校準品5的RLU，結(jié)果見表3。

當RLU( 115.3 ng/mL) /RLU ( 0 ng/mL) 的比值在 0.1～0.2時，SA-HRP稀釋倍數(shù)最大時為最佳工作濃度。由表3可知，SA-HRP稀釋倍數(shù)為4W時， RLU(115.3 ng/mL)/RLU(0 ng/mL)=835 430/56 370=0.148，符合要求，故確定鏈酶親和素標記HRP工作濃度為1:4W。

表3 SA-HRP稀釋倍數(shù)檢測結(jié)果

2.4 試劑盒的驗證

2.4.1 最低檢出限

經(jīng)檢驗，本試劑盒的靈敏度為4.90 ng/mL，符合行業(yè)要求。

2.4.2 準確度

用已知濃度為15 ng/mL和30 ng/mL的質(zhì)控品作為樣本進行檢測，其檢測結(jié)果見表4，理論值與實測值的相對偏差均在±10%范圍內(nèi)。證明本試劑盒準確度符合行業(yè)標準要求。

表4 試劑盒準確度檢測

2.4.3 精密度

經(jīng)檢驗，本試劑盒批內(nèi)和批間的變異系數(shù)分別為6.5%和8.9%。批內(nèi)精密度小于10%，批間精密度小于15%，表明本試劑盒精密度良好，符合行業(yè)標準要求。

2.4.4 熱穩(wěn)定性

在37℃放置5 d和10 d的試劑盒與在4℃放置的試劑盒比較，各項指標均符合行業(yè)標準要求，檢測內(nèi)部質(zhì)控品結(jié)果均穩(wěn)定，結(jié)果見表5。

表5 熱穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.4.5 試劑盒的臨床應(yīng)用

200份血清樣本的檢測結(jié)果如圖3，本試劑盒與參比試劑盒檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R=0.9717，說明兩者的測定結(jié)果有良好的一致性。

圖3 本試劑盒與參比試劑盒檢測血清樣本測定結(jié)果

3 討論

25-羥基維生素D(25-OHD)是維生素D(VD)的一種代謝中間產(chǎn)物，由于其在血液中含量相對較高且半衰期長、波動較小，因此血清25-OHD含量是目前國際公認的衡量機體維生素D營養(yǎng)狀態(tài)的指標。維生素D是人體代謝不可或缺的重要營養(yǎng)物質(zhì)，主要生理作用是調(diào)節(jié)鈣磷代謝。近年來研究發(fā)現(xiàn)，維生素D還參與人體炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、脂質(zhì)代謝等生理過程，維生素D的缺乏與多種疾病相關(guān)。但調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)全球范圍內(nèi)維生素D缺乏癥狀普遍存在，據(jù)估計全球約有10億人處于維生素D缺乏或不足狀態(tài)。所以維生素D的檢測在臨床的地位顯得日益重要。目前國內(nèi)臨床應(yīng)用的25-OHD檢測試劑盒主要來源于國外供應(yīng)商，價格昂貴。所以開發(fā)國產(chǎn)化質(zhì)量合格的25-OHD檢測試劑盒替代進口試劑盒，可降低檢測成本，減輕病患負擔，具有一定的社會和經(jīng)濟學意義。

本試劑盒采用競爭化學發(fā)光法，用25-OHD抗體包被微孔板，制成固相抗體，酶結(jié)合物(生物素化25-OHD與SA-HRP的混合物)與樣本中的25-OHD競爭性結(jié)合到固相抗體上，以魯米諾和過硼酸鈉為發(fā)光底物，實現(xiàn)對25-OHD的定量檢測。采用將樣本與釋放劑同時加入微孔板中的方法，使樣本、釋放劑與微孔板中的抗體同時孵育，以便于樣本中的25-OHD釋放出來后直接與固相抗體結(jié)合，省去了樣本單獨處理的過程，節(jié)約了時間，簡化了實驗操作。本研究還對試劑盒的各項性能指標進行了驗證，經(jīng)驗證試劑盒最低檢出限為4.90 ng/mL，準確度相對偏差在±10%以內(nèi)，批內(nèi)變異系數(shù)為6.5%，批間變異系數(shù)為8.9%，有效期為1 年，各項指標均符合行業(yè)標準要求。同時臨床實驗結(jié)果證實本試劑盒與參比試劑盒(羅氏)的檢測結(jié)果呈高度相關(guān)性。此研究為本試劑盒的臨床應(yīng)用提供了理論支持。

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The development of chemiluminescent immunoassay detection kit for 25-hydroxy vitamin D

SONG Cui-cui1,2,3, LI Xin1,2,3, LU Fei1,2,3, BAI Zhong-hu1,2,3, YANG Yan-kun1,2,3

(1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology; 2. The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology; 3. The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

R446.6

B

2095-1736(2017)05-108-05

2016-10-11；

2016-10-24

江蘇省政策引導類計劃(產(chǎn)學研合作)——前瞻性聯(lián)合研究項目(BY2015019-17)

宋翠翠，碩士研究生，主要從事體外診斷試劑研發(fā)工作，E-mail: 906861617@qq.com

楊艷坤，副教授，碩士生導師，主要從事微生物學、基因工程、分子遺傳、蛋白質(zhì)的分離純化及特性研究等相關(guān)領(lǐng)域科研工作，E-mail：yangyankun@jiangnan.edu.cn

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.05.108