王雯雯，孫承文，楊剛龍，關(guān) 鋒

(1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室， 無錫 214122； 2. 江南大學(xué) 附屬醫(yī)學(xué)院泌尿科， 無錫 214122)

膀胱癌臨床血清樣本N-連接糖鏈的表達(dá)分析

王雯雯1，孫承文2，楊剛龍1，關(guān) 鋒1

(1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室， 無錫 214122； 2. 江南大學(xué) 附屬醫(yī)學(xué)院泌尿科， 無錫 214122)

膀胱癌是發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，是最常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一。國內(nèi)外研究表明糖鏈表達(dá)的異常改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移緊密關(guān)聯(lián)。分析膀胱癌臨床樣本糖鏈的表達(dá)變化可以為膀胱癌研究提供有效的分析手段，有助于發(fā)現(xiàn)潛在的臨床早期診斷標(biāo)志物。首先利用乙酰肼修飾糖鏈唾液酸，用PNGase F酶將糖蛋白質(zhì)N-連接糖鏈釋放出來，通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)技術(shù)對20例膀胱癌血清，11例正常人血清中糖蛋白N-連接糖鏈進(jìn)行相對定量分析。共鑒定出42種N-連接糖鏈結(jié)構(gòu)，其中15種N-連接糖鏈在兩組樣本中含量差異明顯。此外，通過分析不同類型的糖鏈在兩組臨床樣本中的分布差異，發(fā)現(xiàn)唾液酸化、復(fù)合型的N-連接糖鏈在膀胱癌血清中呈現(xiàn)顯著升高的趨勢，而高甘露糖型、平分型N-連接糖鏈表達(dá)呈下降趨勢，說明這些糖鏈結(jié)構(gòu)的表達(dá)變化與膀胱癌的發(fā)生有關(guān)，從而有助于進(jìn)一步闡明膀胱癌發(fā)生過程中糖鏈相關(guān)的分子機(jī)理，并可為膀胱癌的早期診斷、惡性演進(jìn)和轉(zhuǎn)移預(yù)測提供數(shù)據(jù)支持。

膀胱癌；血清；N-連接糖鏈；生物標(biāo)志物；MALDI-TOF/TOF-MS

AbstractBladder cancer is one of the most common cancers and which occurs in the bladder mucosa.The aberrant changes of glycans have been shown to be associated with tumorigenesis, tumor progression and metastasis. The study focused on structures and functions of tumor-specific glycans was useful for the discovery of new candidate biomarkers of bladder cancer. In this study, N-glycans in glycoproteins in 20 bladder cancer and 11 normal samples were released by PNGase F, and sialic acids were modified by acetohydrazide. A total of 42 N-glycan structures were identified and 15 N-glycans were thought to be candidate biomarkers. It indicated that complex type and sialylation type N-glycans were increased significantly, while the high-mannose type and bisecting N-glycans were decreased significantly in bladder cancer sera. These findings showed the expression of glycan structure is associated with the occurrence of bladder cancer, which is important to reveal the glycan mechanism in the development of bladder cancer. The differential glycans could be useful for the early diagnosis.

Keywordsbladder cancer; serum; N-linked glycan; biomarkers; MALDI-TOF/TOF-MS

膀胱癌(Bladder cancer)指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，它是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一[1]。膀胱癌大多為膀胱尿路上皮癌，膀胱尿路上皮癌根據(jù)不同的分子特征和臨床結(jié)果分為非肌層浸潤性和肌層浸潤性，低級的非肌層浸潤性腫瘤復(fù)發(fā)頻繁，但很少發(fā)展為浸潤性，而肌層浸潤性腫瘤通常需要重新診斷并且經(jīng)常轉(zhuǎn)移[2]。目前，膀胱癌已有的生物標(biāo)志物如尿纖維蛋白原(FB)、纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)、細(xì)胞核基質(zhì)蛋白22(NMP22)、膀胱腫瘤抗原(BTA)等的敏感度不高且易受到泌尿系統(tǒng)良性疾病的影響[3]。膀胱鏡檢能夠靈活的檢查出膀胱腫瘤，特異性高，但這是一項繁重的過程且價格昂貴，對級別低的腫瘤靈敏度低，膀胱癌患者將需要進(jìn)行多年的定期監(jiān)測[4]。因此，膀胱癌的早期診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測以及預(yù)后判斷都急需一種高靈敏度、高特異性的方法。

糖基化是最常見的翻譯后修飾反應(yīng)，且比磷酸化更頻繁。大多數(shù)哺乳動物的蛋白質(zhì)都發(fā)生了糖基化且分布廣泛[5]。糖基化導(dǎo)致糖蛋白各種功能的變化，包括細(xì)胞表面受體和黏附分子如鈣黏蛋白、整合蛋白的變化，這些變化賦予腫瘤細(xì)胞獨特的表型特征。糖基化修飾大多由細(xì)胞高爾基體內(nèi)不同的糖基轉(zhuǎn)移酶催化而成，這些酶催化糖復(fù)合物(如糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖)的糖基化。負(fù)責(zé)糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶是在生命的發(fā)育和生理中必不可少的。糖基轉(zhuǎn)移酶的活性和基因表達(dá)受生理環(huán)境的影響，包括癌癥對其表達(dá)水平產(chǎn)生的影響，而糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的高低將會影響糖基化效率[6]。例如，唾液酸化N-連接糖鏈高表達(dá)與唾液酸化糖鏈合成相關(guān)的唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶高表達(dá)有關(guān)，所以研究N-連接的糖型變化也為研究糖基轉(zhuǎn)移酶的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

糖組學(xué)是對糖在生物學(xué)上表達(dá)的綜合研究，是一種簡單而又高度靈敏的診斷疾病的發(fā)生與發(fā)展的新興工具。它為認(rèn)識和有效治療疾病提供信息，現(xiàn)在糖組學(xué)領(lǐng)域主要研究人類健康和疾病的重要性，特別是細(xì)胞膜蛋白N-糖基化和癌癥之間的聯(lián)系[7]。近年來，糖組學(xué)應(yīng)用于多種癌癥機(jī)制及生物標(biāo)志物的研究，利用多種技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)解析糖鏈結(jié)構(gòu)，定量并比較癌癥和對照組之間糖鏈的差異，為研究癌癥的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，并發(fā)現(xiàn)一些特異性生物標(biāo)志物，應(yīng)用于癌癥的早期診斷和治療。Bones等用糖組學(xué)方法分析胃癌病人和正常人血清，發(fā)現(xiàn)sialyl Lewis X (SLex)糖鏈在胃癌中顯著增加，可以作為胃癌的潛在標(biāo)志物[8]。Miyoshi等利用凝集素純化技術(shù)、SDS-PAGE和質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)巖藻糖化的結(jié)合珠蛋白是胰腺癌的生物標(biāo)志物[9]。

利用糖組學(xué)技術(shù)研究膀胱癌已有報道，但大多是利用膀胱癌細(xì)胞株和癌癥標(biāo)本進(jìn)行研究且研究主要集中在mRNA編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平，沒有對于糖鏈的表達(dá)種類和豐度變化進(jìn)行深入研究。例如：Ambrose等利用凝集素親和色譜、LC-MS/MS等方法檢測膀胱癌病人尿液中糖蛋白，但用凝集素富集尿液中糖蛋白的方法不能準(zhǔn)確測定糖基化的變化[10]。Takuechi等利用糖印跡、質(zhì)譜等方法分析了膀胱癌血清中的O-連接糖鏈，發(fā)現(xiàn)膀胱癌中唾液酸化糖鏈增加[11]。本實驗室前期研究已經(jīng)對不同病理狀態(tài)的膀胱上皮細(xì)胞的糖組進(jìn)行了相對定量分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的唾液酸型糖鏈呈顯著上升趨勢[12]。由于在細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞具有去分化、不穩(wěn)定性等缺點，本研究進(jìn)一步采用20個膀胱癌血清樣本和11個正常人血清樣本，用乙酰肼化學(xué)法分離糖蛋白，再用酶解的方法分離糖鏈進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，對膀胱癌血清中糖蛋白N-連接糖鏈變化情況進(jìn)行分析，以期對膀胱癌的診斷或治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

膀胱癌血清臨床樣本由無錫市第四人民醫(yī)院提供，實驗室-80℃保存。膀胱癌血清樣本共31例，其中包括癌癥血清20例，正常人血清11例，正常人的年齡在40歲以上(與膀胱癌病人的年齡基本一致)。

BCA蛋白檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；鹽酸(HCl)購于國藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑公司；離心超濾管Amicon Ultra-0.5 10 ku購于美國 Millipore公司；PNGase F酶購自美國New England Biolabs公司；尿素(Urea)、乙酰肼(Acethydrazide)、EDC( N-(3-Dimethylaminoproply) -N’-ethylcarbodlimide hydrochloride)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)、正丁醇(1-Butanol)、甲醇(Methanol)、碳酸氫銨(NH4HCO3)、2，5-二羥基苯酸乙酯(DHB)和 Sepharose CL-4B(瓊脂糖凝膠)購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 膀胱癌血清樣本中蛋白的提取和濃度測定

采集膀胱癌病人的血清于抗凝管中，室溫靜置30 min，待血清凝集后，1000～2000 r/min冷凍離心15 min分層，勿打亂分層效果，吸取液體部分，50 μL分裝血清，避免反復(fù)凍融，保存于-80℃，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，取2 mg血清蛋白進(jìn)行下一步實驗。

1.2.2 樣品中蛋白質(zhì)的變性處理

取2 mg血清蛋白溶液于已加入200 μL 8 mol/L尿素的10 ku超濾管中，12 000 r/min 離心15 min。棄去流出液，加入200 μL的8 mol/L尿素12 000 r/min離心15 min。棄去流出液，加入200 μL的10 mmol/L DTT溶液，于干式恒溫器中56℃ 孵育45 min。反應(yīng)結(jié)束后，12 000 r/min 離心10 min。棄去流出液，加入200 μL 20 mmol/L IAM溶液，混勻后避光靜置反應(yīng)30 min。反應(yīng)完成后，12 000 r/min 離心15 min，棄去流出液。加入150 μL超純水，充分混勻，12 000 r/min離心15 min，棄去流出液，重復(fù)3次，清洗掉溶液中的IAM避免影響之后的反應(yīng)。

1.2.3 糖鏈中唾液酸的乙酰肼修飾及釋放

加入100 μL 1 mol/L乙酰肼，20 μL 1 mol/L鹽酸，20 μL 2 mmol/L EDC，將超濾管置于120 r/min搖床保證蛋白懸浮反應(yīng)，于室溫下反應(yīng)4 h。反應(yīng)完成后，12 000 r/min離心10 min，棄去流出液。加入150 μL 40 mmol/L NH4HCO3溶液，12 000r/min 離心10 min。棄去流出液，用NH4HCO3溶液重復(fù)清洗3次。加入300 μL 40 mmol/L NH4HCO3溶液，2 μL PNGaseF，37 ℃靜置孵育12 h，12 000 r/min 離心15 min，加入200 μL超純水重復(fù)清洗1次，收集流出液，凍干。

1.2.4 N-連接糖糖鏈的純化

分別向1.5 mL的離心管中加入100 μL Sepharose 4B和體積比為1∶1的甲醇/水溶液1 mL，10 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)洗2次。再向離心管中加入5∶1∶1(V/V/V)的正丁醇/甲醇/水溶液1 mL，10 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)清洗2次。向凍干的糖鏈樣品中加入500 μL 5∶1∶1(V/V/V)的正丁醇/甲醇/水溶液，上樣至裝有Sepharose 4B的離心管中，于80 r/min搖床室溫振蕩反應(yīng)1 h。10 000 r/min離心5 min，棄上清，用5∶1∶1(V/V/V)的正丁醇/甲醇/水溶液重復(fù)清洗3 次。再各加入1∶1(V/V) 甲醇/水溶液1 mL，于140 r/min搖床室溫振蕩反應(yīng)30 min，10 000 r/min離心5 min，收集上清液，1∶1 (V/V)甲醇/水溶液1 mL重復(fù)離心1次，合并收集的樣品并于冷凍干燥儀中凍干。

圖1膀胱癌和正常人血清中N-連接糖鏈一級質(zhì)譜圖

Fig 1 MALDI-TOF-MS spectra of N-glycans in normal human and bladder cancer sera Partial information for the N-linked glycans of normal human serum (A) and bladder cancer serum (B)

A：正常人; B：膀胱癌病人

1.2.5 N-連接糖鏈的質(zhì)譜檢測及數(shù)據(jù)分析

用5 μL甲醇∶水(1∶1，V/V)溶解糖鏈，混勻，2 μL上樣至MTP Anchorchip 384 點的靶板上；待樣品干燥結(jié)晶后，再加1 μL含0.1 mmo/L NaCl 的DHB 基質(zhì)，干燥結(jié)晶；用MALDI-TOF/TOF-MS(UltrafleXtreme，Bruker Daltonics)進(jìn)行檢測。一級質(zhì)譜方法參數(shù)如下：離子模式，陽離子；離子源1，7.50 kV；離子源2，6.75 kV，反射電壓1，29.5 kV；反射電壓2，13.95 kV；LIFT1，19 kV；LIFT2，3.7 kV。激發(fā)光源為N2激光(337 nm)，分子質(zhì)量檢測范圍為900～3500 u。從一級圖譜中選擇質(zhì)譜峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，其分析方法參數(shù)如下：離子源1，25 kV；離子源 2，22.40 kV；反射電壓1，26.45 kV；反射電壓2，13.35 kV；LIFT1，19 kV；LIFT2，3.7 kV。分子質(zhì)量檢測范圍為900～3500 u。利用FlexAnalysis 軟件結(jié)合Glycoworkbench 2 軟件手動分析糖鏈結(jié)構(gòu)，選擇GlycomeDB 數(shù)據(jù)庫，離子選擇[M+Na]+和[M+H]+。利用GraphPads Prism 5 軟件，對目標(biāo)糖鏈進(jìn)行統(tǒng)計及t檢驗分析，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2膀胱癌和正常人血清中N-連接糖鏈的二級質(zhì)譜圖

Fig 2 MALDI-TOF/TOF-MS/MS spectra of N-glycans in normal human and bladder cancer sera

A：質(zhì)荷比為2010.734的糖鏈的二級譜圖；B：質(zhì)荷比為2156.801的糖鏈的二級譜圖;C：質(zhì)荷比為2357.176的糖鏈的二級譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 血清臨床樣本中N-連接糖鏈組圖譜分析及結(jié)構(gòu)解析

由于人體血液系統(tǒng)包含所有組織，而血清是腫瘤細(xì)胞和組織隨時間變化的信息庫。蛋白質(zhì)的糖基化修飾與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，利用MALDI-TOF/TOF-MS對兩組臨床樣本的N-糖鏈樣品進(jìn)行檢測，其中包括膀胱癌病人血清20例，正常人血清11例。由于個體差異，使得各糖鏈出現(xiàn)頻率不同。將樣品分為正常組和膀胱組，某個糖鏈在各組中偶然出現(xiàn)，則不具有統(tǒng)計學(xué)意義，所以選取出現(xiàn)概率不小于50%的糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定和解析，一級譜圖如圖1，二級譜圖如圖2。利用一級質(zhì)譜檢測糖鏈樣品獲得糖鏈的分子質(zhì)量及相對豐度，參考GlycoWorkbench軟件中的GlycomeDB 糖鏈數(shù)據(jù)庫，推斷可能出現(xiàn)的所有糖鏈結(jié)構(gòu)通過二級質(zhì)譜獲得不同糖鏈結(jié)構(gòu)的斷裂結(jié)構(gòu)，并結(jié)合已鑒別的人類細(xì)胞中N-連接糖鏈結(jié)構(gòu)特點，從而推斷出糖鏈的完整結(jié)構(gòu)。共鑒定42個N-連接糖鏈結(jié)構(gòu)，然后通過質(zhì)譜檢測到的質(zhì)譜峰面積比值(Area ratio)進(jìn)行相對定量分析，以確定該糖鏈在癌癥組和正常組中的表達(dá)水平結(jié)果如表1。

表1 膀胱癌血清和正常人血清N-糖鏈結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

續(xù)表1(Continued table 1)

No.Experimentalm/zCalculatedm/zGlycanstructureAveragerelativeareamean±SEMNormal(%)Carcinoma(%)PvaluePvaluesummary182010.7341954.67687.112±0.8156.344±0.4610.3822ns192031.7622031.76330.502±0.1950.539±0.1210.8639ns202066.8152067.68682.498±0.4871.036±0.1330.0010**212078.1892079.77323.012±0.8272.552±0.4670.6043ns222156.8012100.73473.527±0.2752.789±0.2090.0428*232172.7352061.73530.161±0.0530.189±0.0510.7276ns242213.4252157.75621.505±0.1831.008±0.1380.0398*252248.7632247.8131.212±0.2691.362±0.2520.7065ns262254.9522198.78270.278±0.0730.296±0.0520.8371ns272275.0852275.86920.554±0.1350.709±0.1580.5161ns282322.7582265.83721.652±0.5941.387±0.2490.6334ns292339.8272339.8740.399±0.1020.646±0.0630.0379*302357.1762245.772238.0921.45446.160±1.3570.0007***312359.4912303.81412.579±1.0243.456±0.7630.4985ns322372.8732371.86381.187±0.3222.277±0.6240.2255ns332378.8472322.85874.202±0.8825.628±0.6280.1925ns342394.8162393.84580.747±0.2560.762±0.1590.9571ns352400.8922344.84061.077±0.4091.501±0.2950.4028ns362412.9152412.89046.789±2.4131.886±0.5650.0164*

續(xù)表1(Continued table 1)

No.Experimentalm/zCalculatedm/zGlycanstructureAveragerelativeareamean±SEMNormal(%)Carcinoma(%)PvaluePvaluesummary372503.8562391.83012.935±0.3092.772±0.2110.6582ns382559.9912448.85160.453±0.1340.128±0.0490.0101*392706.9642594.90951.033±0.1341.126±0.1320.6505ns402722.0832610.90440.536±0.0480.499±0.0440.5948ns413069.2492901.99981.935±0.2862.281±0.3220.4822ns423216.0173048.05770.466±0.1480.839±0.1000.0399*

ns: Means of no significant

2.2 膀胱癌和正常人血清中具有明顯差異的N-連接糖鏈的分析

利用GraphPads Prism 5軟件，對得到的42個糖鏈在不同樣品組中的相對面積進(jìn)行統(tǒng)計分析，P值在統(tǒng)計學(xué)上代表顯著性，P值的結(jié)果≤0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)意義的邊界線，結(jié)果0.05≥P>0.01被認(rèn)為是具有統(tǒng)計學(xué)意義,而0.01≥P≥0.001被認(rèn)為具有高度統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)P值的范圍判斷糖鏈在膀胱癌和正常人中差異的顯著程度。表達(dá)差異為P< 0.05的糖鏈的質(zhì)荷比分別為1485.588、1663.590、2156.801、2213.425、2339.827、2412.915、2559.991、3216.017，表達(dá)差異為P< 0.01的糖鏈的質(zhì)荷比分別為1647.5865、1703.692、1809.637、1865.656、2066.815，表達(dá)差異為P< 0.001的糖鏈的質(zhì)荷比為1541.692、2357.176，統(tǒng)計學(xué)差異如圖3所示。

2.3 不同糖型的N-連接糖鏈在兩組樣本中的比較分析

將鑒定到的42 種N-連接糖鏈分為高甘露型糖鏈、平分型糖鏈、雜合型糖鏈、復(fù)合型糖鏈、二天線型糖鏈、三天線型糖鏈、四天線型糖鏈、唾液酸化糖鏈和巖藻糖化糖鏈9類，累加每個樣本中各類型糖鏈相對峰面積的值。利用GraphPad Prism 5 軟件對膀胱組和正常組的不同糖型分別進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。從表2中可以看出復(fù)合型糖鏈、唾液酸化糖鏈在膀胱癌中有明顯的上調(diào)趨勢，而高甘露糖型、平分型糖鏈在膀胱癌中呈顯著下降趨勢。此外，雜合型、巖藻糖型、二天線型、三天線型和四天線型糖鏈在正常人和膀胱癌病人中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化。由此可以推測出，高甘露糖型、平分型、復(fù)合型糖鏈、唾液酸化糖鏈與膀胱癌的發(fā)生過程密切相關(guān)。而不同糖型的變化與糖鏈合成相關(guān)的酶的表達(dá)有關(guān)，這為研究相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的變化提供了信息基礎(chǔ)。

圖3 不同組樣本中差異N-糖鏈的 t-test分析圖

A:P< 0.05的糖鏈；B：P< 0.01的糖鏈；C：P< 0.001的糖鏈

3 討論

糖類和蛋白質(zhì)組成的糖復(fù)合物通過復(fù)雜的分子機(jī)制，包括直接的和間接的聚糖識別糖復(fù)合物的構(gòu)象和表達(dá)而發(fā)揮其生物學(xué)功能。多糖能夠被糖蛋白直接識別，糖蛋白和聚糖的相互作用可促進(jìn)細(xì)胞黏附、胞外基質(zhì)的相互作用、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、蛋白折疊和內(nèi)/外靶向細(xì)胞器等過程[13]。聚糖在癌癥中的作用即聚糖在糖基化中的改變調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)生和發(fā)展，聚糖作為重要的生物標(biāo)志物為治療和干預(yù)癌癥提供一組特異的目標(biāo)標(biāo)志物[14]。根據(jù)細(xì)胞表面的糖鏈結(jié)構(gòu)的變化能夠預(yù)測癌癥的發(fā)生與發(fā)展。例如，O-連接糖鏈的水平升高(T抗原)預(yù)示著某些類型癌癥的存活率較低[15]。N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)與人類細(xì)胞中唾液酸N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)具有一個氧原子的差別[16]，而Neu5Gc不能在人體內(nèi)合成，往往是通過攝入外源肉類而積累獲得，因此Neu5Gc含量的增加伴隨抑制N-羥乙酰神經(jīng)氨酸的抗體增加，因此，Neu5Gc抗體的表達(dá)可作為腫瘤生物標(biāo)志物[17]。

表2 不同類型糖鏈在兩種臨床樣本中含量的t test分析結(jié)果

ns: Means not significant

本研究利用質(zhì)譜技術(shù)對癌癥組和正常組的N-連接糖鏈進(jìn)行相對定量分析，獲得N-連接糖鏈的譜圖，鑒定出42種N-連接糖鏈。通過對兩組臨床樣本的相對面積進(jìn)行比較，確定15個N-連接糖鏈在膀胱組和正常組的表達(dá)差異，為膀胱癌發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物提供理論基礎(chǔ)。人體唾液酸水平的異常升高往往與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，測定血清中的唾液酸含量對惡性腫瘤的早期診斷與預(yù)后具有重要的臨床價值。本研究利用乙酰肼修飾糖鏈唾液酸，對糖鏈上的唾液酸進(jìn)行了保護(hù)。將鑒定到的糖鏈進(jìn)行分類，累加每個樣本中各類型糖鏈相對峰面積的值，對獲得的糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行糖型分析后發(fā)現(xiàn)，高甘露糖型和平分型糖鏈的整體表達(dá)水平在膀胱癌中顯著下降，而復(fù)合型糖鏈、唾液酸化糖鏈則在膀胱癌中有明顯的上調(diào)趨勢。糖基化大多是由細(xì)胞高爾基體中不同的糖基轉(zhuǎn)移酶催化的，糖基轉(zhuǎn)移酶的活性和基因表達(dá)受癌癥影響。因此，推測唾液酸化N-連接糖鏈在膀胱癌血清中高表達(dá)與唾液酸化糖鏈合成相關(guān)的唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶的高表達(dá)有關(guān)。綜合前期工作和以上研究結(jié)果，細(xì)胞和血清中唾液酸呈顯著上升趨勢，推測唾液酸化糖鏈的高表達(dá)與唾液酸化糖鏈合成相關(guān)的唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶高表達(dá)有關(guān)，這為研究唾液酸分子生物學(xué)提供了理論基礎(chǔ)。

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Analysis of N-linked glycans in bladder cancer

WANG Wen-wen1, SUN Cheng-wen2, YANG Gang-long1, GUAN Feng1

(1. Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry & Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122; 2. Department of Urology, Affiliated Hospital of Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

R737.14

A

2095-1736(2017)05-0007-08

2016-09-02；

2016-09-14

國家自然科學(xué)基金(81672537); 國家自然科學(xué)基金(81402115)

王雯雯，碩士研究生，專業(yè)方向為輕工技術(shù)與工程，E-mail: 6140206015@vip.jiangnan.edu.cn

關(guān) 鋒，博士，教授，研究方向為糖生物學(xué)，E-mail: fengguan@jiangnan.edu.cn

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.05.007