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(1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山西太原 030001;2.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,山西太原 030001)

光譜法研究高良姜素與人血清白蛋白的相互作用

薛燕斌1,2,喬華1,李波1,丁偉1,2,孫體健1,*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山西太原030001;2.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,山西太原030001)

在模擬生理?xiàng)l件下,采用熒光猝滅、同步熒光、三維熒光和圓二色譜,研究高良姜素與人血清白蛋白(HSA)之間的相互作用。結(jié)果表明:高良姜素對(duì)HSA有較強(qiáng)的熒光猝滅作用,且為靜態(tài)猝滅,結(jié)合過程中氫鍵和范德華力起主要作用。不同溫度下二者的結(jié)合常數(shù)(Ka)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)分別為1.26×106L/mol、1.17(290.15 K),4.34×105L/mol、1.09(296.15 K),1.23×105L/mol、1.00(303.15 K),9.87×104L/mol、0.99(310.15 K)。同步熒光、三維熒光和圓二色譜顯示高良姜素與HSA作用時(shí)更靠近色氨酸殘基,使其周圍的疏水性減弱,而對(duì)蛋白構(gòu)象影響較小。

高良姜素,人血清白蛋白,相互作用,同步熒光光譜,三維熒光光譜,圓二色譜

Abstract:Under the imitated physiological condition,the interaction between galangin and human serum albumin(HSA)was studied by fluorescence quenching,synchronous fluorescence,three-dimensional fluorescence and circular dichroism spectra. The results suggested that galangin had a strong ability to quench the HSA fluorescence in a static mode,during which hydrogen bond and Van Edward force played dominant roles. The binding constants(Ka)and site numbers(n)obtained at different temperatures were 1.26×106L/mol,1.17(290.15 K),4.34×105L/mol,1.09(296.15 K),1.23×105L/mol,1.00(303.15 K),9.87×104L/mol,0.99(310.15 K),respectively. Spectra of synchronous fluorescence,three-dimensional fluorescence and circular dichroism revealed that galangin interacted with tryptophan residues in BSA more strongly than with tyrosine residues,and the vicinity of tryptophan residues was less hydrophobic. However,conformational changes of HAS were slighter.

Keywords:galangin;human serum albumin;interaction;synchronous fluorescence spectra;three-dimensional fluorescence spectra;circular dichroism spectra

高良姜(AlpiniaofficinarumHance)是一種藥食同源中藥材,屬熱帶多年生姜科草本植物。高良姜素是從高良姜中提取的一種黃酮化合物[1],具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]等多種生物活性[4]而受到廣泛關(guān)注,有望開發(fā)為食品強(qiáng)化劑應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。血清白蛋白是血液中含量最豐富的載體蛋白,參與外源性物質(zhì)在體內(nèi)的運(yùn)送、分布、代謝及消除等過程,是生命活性物質(zhì)發(fā)揮生物效應(yīng)的重要載體和靶向分子[5]。目前,關(guān)于天然活性物質(zhì)與血清白蛋白相互作用的研究已有大量文獻(xiàn)記載[6-8],但對(duì)于高良姜素與人血清白蛋白(HSA)相互作用的機(jī)理研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用熒光猝滅法研究高良姜素與HSA的結(jié)合作用,考察了結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合熱力學(xué)參數(shù),并利用同步熒光光譜、三維熒光光譜和圓二色譜探討了HSA在高良姜素作用下構(gòu)象的變化,為進(jìn)一步闡明高良姜素在人體內(nèi)的儲(chǔ)存方式、傳輸機(jī)制及藥理作用等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高良姜素標(biāo)準(zhǔn)品 薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司,批號(hào):EE230130,用10%乙醇溶液配制1.0×10-4mol/L儲(chǔ)備液,保存于4 ℃冰箱中備用;人血清白蛋白(HSA) 北京索萊寶科技有限公司,用pH7.4磷酸鹽緩沖溶液(簡(jiǎn)稱PBS溶液)配制3.0×10-5mol/L儲(chǔ)備液,保存于4 ℃冰箱中備用;其它試劑 均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水 為Milli-Q超純水。

Cary Eclipse熒光光譜儀 美國Varian公司;MOS 500圓二色光譜儀 法國Bio-Logic公司;pHS-3C型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 在10 mL比色管中,依次加入1.0 mL HSA儲(chǔ)備液,適量PBS溶液,再加入不同體積高良姜素儲(chǔ)備液,并補(bǔ)充適當(dāng)體積10%乙醇溶液(以使各溶液中乙醇含量相同),配制3.0×10-6mol/L HSA的PBS溶液及含不同濃度(0、0.6×10-6、0.8×10-6、1.0×10-6、2.0×10-6、3.0×10-6、4.0×10-6、5.0×10-6、6.0×10-6、7.0×10-6、8.0×10-6、9.0×10-6、10.0×10-6mol/L)高良姜素的PBS溶液。

1.2.2 熒光光譜 激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm,以HSA的最佳激發(fā)波長(zhǎng)280 nm為激發(fā)光源,記錄各待測(cè)樣品溶液300～450 nm波長(zhǎng)范圍熒光發(fā)射光譜,掃描步長(zhǎng)1 nm,實(shí)驗(yàn)溫度為290.15 K。

同步熒光光譜測(cè)定條件:激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)差(Δλ)分別固定在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm,掃描步長(zhǎng)1 nm,實(shí)驗(yàn)溫度為290.15 K。

三維熒光光譜測(cè)定條件:HSA濃度為3.0×10-6mol/L;高良姜素濃度為10.0×10-6mol/L;熒光光譜儀的光源為氙弧燈;激發(fā)光波長(zhǎng)范圍為200～500 nm;發(fā)射光波長(zhǎng)范圍為200～500 nm;激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm;激發(fā)光波長(zhǎng)掃描間隔為5 nm;掃描光譜儀自動(dòng)校正,掃描步長(zhǎng)1 nm,實(shí)驗(yàn)溫度為290.15 K。采用Cary Eclipse軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 圓二色譜 室溫下,利用圓二色光譜儀測(cè)定各樣品在200～250 nm波長(zhǎng)范圍的圓二色譜,比色皿厚度為1 cm,掃描速度60 nm/min,實(shí)驗(yàn)溫度為290.15 K。

2 結(jié)果與分析

2.1 高良姜素對(duì)HSA的猝滅機(jī)理研究

2.1.1 高良姜素與HSA作用的熒光猝滅光譜 HSA分子會(huì)吸收紫外光并發(fā)射熒光,因此可以利用蛋白分子內(nèi)源性熒光的變化,考察高良姜素與HSA的結(jié)合作用,結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同濃度高良姜素對(duì)HSA熒光光譜的影響Fig.1 Effect of galangin on fluorescence spectra of HSA注:曲線1～13表示高良姜素濃度分別為0、0.6×10-6、0.8×10-6、1.0×10-6、2.0×10-6、3.0×10-6、4.0×10-6、5.0×10-6、6.0×10-6、7.0×10-6、8.0×10-6、9.0×10-6、10.0×10-6 mol/L，圖3同。

由圖1可以看出,當(dāng)高良姜素的濃度增大時(shí),在HSA熒光猝滅的同時(shí),熒光峰的峰位由330 nm藍(lán)移到323 nm,說明HSA與高良姜素之間的相互作用使得其表面氨基酸殘基周圍疏水性能及本身構(gòu)象發(fā)生改變。

2.1.2 高良姜素對(duì)HSA的熒光猝滅機(jī)理 為了進(jìn)一步闡明高良姜素對(duì)HSA的熒光猝滅機(jī)理,用Stern-Volmer方程[9]對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

式(1)

式中:F0和F分別是未加入和加入高良姜素時(shí)HSA的熒光強(qiáng)度;KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù);[Q]為高良姜素的濃度;Kq為雙分子猝滅速率常數(shù);τ0為猝滅體不存在時(shí)熒光分子平均壽命。

作出F0/F-[Q]關(guān)系圖并計(jì)算出不同溫度下的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù),結(jié)果見圖2和表1。由圖2和表1可知,猝滅常數(shù)KSV隨著溫度的升高而減小,初步推斷猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅過程。

圖2 高良姜素與HSA作用的Stern-Volmer圖Fig.2 Stern-Volmer plots of the interaction between galangin and HSA

為驗(yàn)證猝滅類型,依據(jù)方程(1)計(jì)算出Kq值(表1所示)。由于生物大分子熒光壽命約為10-8s,290.15 K時(shí),Kq計(jì)算值為1.67×1013L/mol·s。而各類猝滅劑與生物分子的最大碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L/mol·s[9],表明高良姜素對(duì)HSA的猝滅過程常數(shù)大于擴(kuò)散控制的速率常數(shù),所以高良姜素對(duì)HSA的猝滅屬靜態(tài)猝滅,即高良姜素與HSA在基態(tài)時(shí)形成了復(fù)合物,并且生成的高良姜素-HSA復(fù)合物不發(fā)光,會(huì)與未反應(yīng)的HSA競(jìng)爭(zhēng)吸收激發(fā)光,從而降低了HSA的熒光強(qiáng)度。

2.1.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 靜態(tài)猝滅的結(jié)合常數(shù)Ka由修正的Stern-Volmer方程[7]計(jì)算而得:

式(2)

表1 不同溫度下高良姜素與HSA作用的猝滅常數(shù)Table 1 Quenching constants for the interaction of galangin with HSA at different temperatures

表2 不同溫度下高良姜素與HSA作用的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)nTable 2 Binding constants(Ka)and site numbers(n)for the interaction of galangin with HSA at different temperatures

式中:F0和F分別是未加入和加入高良姜素時(shí)HSA的熒光強(qiáng)度;Ka為結(jié)合常數(shù);n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù);[Q]為高良姜素的濃度;計(jì)算結(jié)果列于表2。

表2結(jié)果表明,Ka隨溫度升高逐漸減小,說明溫度升高時(shí)高良姜素與HSA形成復(fù)合物的穩(wěn)定性降低。同時(shí),表2顯示n都在1附近,說明高良姜素與HSA結(jié)合時(shí)是1∶1結(jié)合;但隨溫度升高,n逐漸減小,說明溫度升高,高良姜素與HSA結(jié)合程度降低。

2.1.4 高良姜素與HSA的結(jié)合作用力研究 為了考察高良姜素與HSA的結(jié)合作用力,可以通過計(jì)算結(jié)合的熱力學(xué)常數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)。在溫度變化不大時(shí),可以近似認(rèn)為反應(yīng)的焓變(ΔH)為常數(shù),根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)間的關(guān)系式式(3)～式(5)[10]:

式(3)

ΔG=-RTlnKa

式(4)

式(5)

分別計(jì)算得到ΔH,熵變(ΔS)和吉布斯自由能變(ΔG)。式中:Ka為結(jié)合常數(shù);R為氣體摩爾常數(shù);ΔH、ΔS及ΔG計(jì)算結(jié)果見表3。

表3 不同溫度下高良姜素與HSA作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters for the interaction of galangin with HSA at different temperatures

依據(jù)Ross與Subramanian利用小分子與生物大分子反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)的變化判斷其作用力類型的規(guī)律[11],即當(dāng)ΔS>0,ΔH>0為典型的疏水作用力;ΔS<0,ΔH<0為氫鍵和范德華力;當(dāng)ΔS>0,ΔH<0時(shí)為靜電作用力。表3顯示,高良姜素與BSA結(jié)合時(shí)氫鍵和范德華力起主要作用。

2.2 高良姜素對(duì)HSA構(gòu)象的影響

2.2.1 同步熒光光譜 同步熒光光譜能夠提供蛋白質(zhì)分子中酪氨酸殘基和色氨酸殘基的特征信息,可用于蛋白構(gòu)象變化的分析。當(dāng)Δλ=15 nm時(shí)只反映酪氨酸殘基的熒光,當(dāng)Δλ=60 nm時(shí)僅反映色氨酸殘基的熒光[12],實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同濃度高良姜素對(duì)HSA同步熒光光譜的影響Fig.3 Effect of galangin on synchronous fluorescence spectra of HSA

圖3顯示,加入高良姜素,酪氨酸殘基熒光發(fā)射峰保持不變,而色氨酸殘基發(fā)射峰由276 nm紅移至278 nm,說明酪氨酸殘基周圍的疏水微環(huán)境沒有改變,但色氨酸殘基周圍的疏水性有所降低,表明高良姜素與HAS結(jié)合后使得HAS的構(gòu)象發(fā)生改變,但變化不大。同時(shí),HSA的同步熒光峰強(qiáng)度都降低,但降低的幅度不同,說明兩種殘基與高良姜素的作用程度不同。高良姜素對(duì)HSA同步熒光的猝滅百分率由公式(6)[12]計(jì)算:

式(6)

式中:FSF0和FSF分別為未加入和加入高良姜素時(shí)的同步熒光強(qiáng)度。計(jì)算結(jié)果如圖4所示。

圖4 高良姜素對(duì)HSA同步熒光光譜的猝滅百分率Fig.4 Quenching percentage of galangin on synchronous fluorescence intensity of HSA

由圖4可知,隨高良姜素濃度增大,酪氨酸和色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度都逐漸減小,同一濃度時(shí),色氨酸殘基熒光強(qiáng)度降低幅度較酪氨酸殘基的降低幅度更大,表明高良姜素與HSA作用時(shí)更靠近色氨酸殘基。

2.2.2 三維熒光光譜 三維熒光光譜能更加全面地展現(xiàn)樣品的熒光信息,有利于綜合考查樣品的組分分布和構(gòu)型變化,通常用等高線圖的形式描述[13]。高良姜素與HSA作用的三維熒光光譜如圖5所示。

圖5 HSA及高良姜素-HSA的三維熒光圖譜Fig.5 Three-dimensional fluorescence spectra of HSA and galangin-HSA

圖5看出,HSA的三維熒光光譜中有兩個(gè)熒光峰,峰Ⅰ反映HSA的多肽骨架結(jié)構(gòu),峰Ⅱ反映酪氨酸和色氨酸殘基的疏水微環(huán)境[14]。從峰的位置看,加入高良姜素后,峰Ⅰ的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)未發(fā)生移動(dòng),但峰Ⅱ的激發(fā)波長(zhǎng)略顯紅移,發(fā)射波長(zhǎng)略顯藍(lán)移;從峰的強(qiáng)度看,加入高良姜素,峰Ⅰ和峰Ⅱ都有不同程度降低,說明高良姜素對(duì)HAS的構(gòu)象有影響但不顯著,與同步熒光結(jié)論一致。

2.2.3 圓二色譜 圓二色光譜可以簡(jiǎn)單靈敏的地評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化[15]。高良姜素與HSA作用的圓二色譜如圖6所示。

圖6 高良姜素對(duì)HSA圓二色譜的影響Fig.6 Effect of galangin on circular dichroism spectra of HSA注:曲線1～5表示高良姜素濃度分別為0、1.0×10-6、3.0×10-6、5.0×10-6、10×10-6 mol/L。

由圖6可以看出,HSA在210 nm和220 nm有兩個(gè)負(fù)槽,這是典型α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征表現(xiàn)。當(dāng)加入高良姜素時(shí),HSA的CD值減小(靠近0刻線),但形狀和肩峰的位置沒有改變。表明高良姜素的濃度逐漸增加時(shí),能誘導(dǎo)HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生微弱的變化。當(dāng)加入0、1、3、5、10×10-6mol/L高良姜素時(shí),依文獻(xiàn)[16]可計(jì)算出HSA的α-螺旋度分別為58.5%、57.0%、56.2%、55.3%、53.8%。結(jié)果表明高良姜素與HSA結(jié)合時(shí)改變了HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu),但改變幅度不大。

3 結(jié)論

高良姜素與HSA之間通過范德華力和氫鍵產(chǎn)生了較強(qiáng)的結(jié)合作用,結(jié)合常數(shù)在106數(shù)量級(jí),結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1。高良姜素對(duì)HSA熒光猝滅過程是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅,在形成復(fù)合物時(shí)更靠近色氨酸殘基,使其周圍的疏水性減弱,但對(duì)蛋白的構(gòu)象影響不大。

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Spectroscopicanalysisofinteractionbetweengalanginandhumanserumalbumin

XUEYan-bin1,2,QIAOHua1,LIBo1,DINGWei1,2,SUNTi-jian1,*

(1.School of Basic Medicine,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China; 2.College of Pharmacy,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)

TS202.3

A

1002-0306(2017)18-0065-05

2017-02-23

薛燕斌(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail:xueyb2015@126.com。

*通訊作者:孫體健(1960-)，女，大學(xué)本科，教授，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)及藥物分析，E-mail:suntijian@126.com。

山西省自然科學(xué)基金(2015011024)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.013