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(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

超臨界CO2體系中磷脂酶A2催化合成高DHA含量DHA-PC的研究

李珍珍,許飛躍,韓玉謙*,林洪,馮曉梅

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島266003)

以南極磷蝦粉為原料,乙醇浸提后分離純化得到的精制磷脂酰膽堿的純度高達90.8%,以此為原料,在超臨界CO2體系中使用磷脂酶A2(PLA2)催化磷脂酰膽堿(PC)Sn-2位脂肪酸水解,使游離DHA結合到Sn-2位以制備高DHA含量的磷脂酰膽堿(DHA-PC),并研究了不同參數(shù)對該反應的影響。最佳酶解反應條件分別如下:固定化PLA2的添加量15%(占總底物),時間6 h,溫度55 ℃,壓力12 MPa。在此條件下,南極磷蝦磷脂酰膽堿上DHA的含量可達62.3 mol%。由此得出結論,PLA2用于磷脂酰膽堿改性以制備DHA-PC的可行性高。

南極磷蝦,磷脂酰膽堿,DHA-PC,固定化,PLA2,酯交換,超臨界CO2

Abstract:With the raw material of euphausia superba powder,the purity of the refining phosphatidylcholine gained by ethyl alcohol extraction and separation and purification reached 90.8%,then the refining phosphatidylcholine was used as raw material and phospholipase A2was used to catalyze the fatty acid hydrolysis of Sn-2 position of phosphatidylcholine in supercritical CO2system to make the fish oil DHA to Sn-2 position and form the DHA-PC with high DHA contents. Meanwhile,the effects of different parameters on the reaction were surveyed. The results showed that,the best additive amount of immobilization phospholipase A2was 15%(occupied the total substratio),the best enzymolysis was 6 h,the best enzymolysis temperature was 55 ℃,the best enzymolysis pressure was 12 MPa,respectively. Under such condition,the DHA binding ratio of euphausia superba phosphatidylcholine could reach 62.3 mol%. And it could be concluded that immobilization phospholipase A2is highly viable for phosphatidylcholine modification to prepare DHA-PC.

Keywords:antarctic krill;phosphatidylcholine;DHA-PC;immobilisation;phospholipase A2;transesterification;supercritical carbon dioxide

磷脂特定的極性頭部和脂肪酸組成對其生理功能是至關重要的[1]。一些磷脂因為具有特定的結構而具有很高的利用價值,而這樣的磷脂在自然界卻很少存在(如多不飽和磷脂),所以往往需要通過改性獲得。多不飽和磷脂指的是磷脂中含有較多重要的多不飽和脂肪酸,如DHA[2]。Hosokawa等[3]研究表明,以海洋動物磷脂酰膽堿為原料制成的高DHA含量的磷脂酰膽堿(DHA-PC)脂質體在小鼠體內顯示出很好的抗纖維肉瘤活性,而大豆磷脂制成的DHA-PC無此活性。南極磷蝦磷脂中以磷脂酰膽堿為主,且含有豐富的多不飽和脂肪酸[4-5],所以其為制備海洋源高DHA含量DHA-PC的良好來源。

磷脂酶A2(PLA2)可用于水解磷脂酰膽堿制備溶血磷脂酰膽堿,且它特異性地水解磷脂酰膽堿的Sn-2位,接下來進行酯交換反應可以使其Sn-2位結合更多ω-3系列多不飽和脂肪酸,以制備高多不飽和脂肪酸含量的磷脂酰膽堿。

因為超臨界CO2流體具有黏度低、擴散性好且CO2的臨界點溫度和壓力對固定化酶活影響小等諸多利于酶促反應的優(yōu)點[6-7],使超臨界CO2流體成為替代有機溶劑作為酶促反應的介質越來越受到人們關注。再者,沒有有機溶劑參與和殘留,諸如改性磷脂的酶催化反應物在食品、藥品和化妝品等領域的應用將得到大大的拓展[8]。

與游離酶相比較,固定化酶在超臨界流體(SCF)中具有以下幾個優(yōu)點:可重復使用;酶與產(chǎn)物易分離;耐熱性顯著提高;催化穩(wěn)定性有所改善;防止SCF與酶的化學相互作用而可能發(fā)生的酶構象變化[9]。所以為了方便終反應產(chǎn)物的檢測,本研究中磷脂酶被固定在相應載體上。

本研究的主要目的是將PLA2引入南極磷蝦磷脂酰膽堿改性使其結合更多的DHA,以提高其功能價值而達到高值化利用。此外,研究了催化劑PLA2在超臨界狀態(tài)下不同壓力、溫度、添加酶量、時間下的催化效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PLA2(Lecitase? Ultra) 丹麥諾維信公司;南極磷蝦粉 山東科瑞爾生物技術有限公司;大豆磷脂酰膽堿(純度≥99%)、脂肪酸標準品 Sigma Aldrich公司;載體樹脂D380 鄭州勤實科技有限公司;CO2(純度99.9%) 環(huán)宇氣體公司;魚油(該魚油富含DHA和EPA,其含量分別為77%和5.7%。根據(jù)Garcia[10]等人的方法將該魚油皂化以制備富含DHA的游離脂肪酸) 河北海源健康生物科技公司;氫氧化鉀、鹽酸、硫酸、磷酸二氫鉀、硫酸聯(lián)氨、鉬酸鈉、無水硫酸鈉、丙酮、氯仿、甲醇 均為分析純(AR),國藥集團化學試劑有限公司。

BS210S型電子分析天天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;GC-2010pl7s氣相色譜儀 日本島津公司;722S型可見光光度計 上海精密科學儀器有限公司;RE-52A型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;超臨界反應裝置 自組裝,如圖1所示;GF254薄層層析硅膠板 青島圣海精細硅膠化工有限公司。

圖1 超臨界CO2體系酶催化反應裝置Fig.1 Device of supercritical CO2 system for enzyme reaction注:A:CO2罐,B:制冷機,C:高壓泵,D:熱電偶,E:數(shù)顯電熱套,F:超臨界反應罐,G:攪拌器,H:背壓調節(jié)器,P:壓力表。

1.2 實驗方法

1.2.1 南極磷蝦磷脂酰膽堿的制備 采用乙醇提取法,將南極磷蝦粉與乙醇以1∶6 (g/mL)的比例混合攪拌均勻,搖床180 r/min,50 ℃,提取5 h。接下來進行濾膜抽濾至澄清透明,真空濃縮上述提取的南極磷蝦油得南極磷蝦磷脂,接下來按1∶3 (g/mL)的比例加入冷丙酮,脫油處理(每次20 min),振搖,然后靜置分層,溫度維持在0 ℃以下至上層丙酮液澄清,倒去上層丙酮,用氮氣吹除殘余的丙酮,獲得純度較高的南極磷蝦磷脂酰膽堿。將上述樣品再用乙醇溶解,添加氧化鋁,加入量為原料的10%(g/g),攪拌吸附,抽濾至澄清透明,真空濃縮后,再次使用冷丙酮脫油、脫色等,最終得精制磷脂酰膽堿(PC)[11]。

1.2.2 固定化 將PLA2酶液及等體積的緩沖液(0.033 mol/L Tris-HCl,0.01 mol/L CaCl2,pH8.0)混合,然后加入活化后的D380,置于在200 r/min,25 ℃下?lián)u床振蕩吸附12 h;收集過量的酶液,用于樹脂的蛋白吸附量的測定。隨后真空干燥(45 ℃,3 h)并在4 ℃下儲存待用[12]。

1.2.3 超臨界CO2體系中的酶促反應 酶催化反應使用本實驗室自組裝的超臨界裝置,將游離DHA和磷脂酰膽堿按1∶6 (m/m)比例混合,置于搖床上混勻后,與固定化PLA2封閉在反應罐中,迅速密封反應釜,打開CO2罐和進出口閥門吹掃空氣,維持5 s。注意進出口閥門在排空氣時不能開太大,否則會將反應底物隨著氣流吹出。打開加熱開關,待溫度達到預設溫度時,打開加壓。達到預設壓力后,停止加壓,關閉CO2罐。打開攪拌,設置轉速,開始反應。反應停止后,緩慢降壓,從物料口回收反應產(chǎn)物。

1.2.3.1 不同壓力下的酶催化反應 溫度50 ℃,反應時間7 h,轉速400 r/min,15%固定化酶添加量,固定化酶分別在10、12、14、16、18、20 MPa下反應。反應結束后,回收樣品,然后將反應混合物溶解在氯仿/甲醇(2∶1,V/V)溶液中,取微量溶液薄層色譜(TLC)展開,展開劑氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4,V/V/V)。從TLC板上回收對應于PC的條帶,提取并甲基化,然后進行色譜分析[13-14]。

1.2.3.2 不同溫度下的酶催化反應 壓力12 MPa,轉速400 r/min,15%固定化酶添加量,反應時間7 h,酶水解溫度分別為30、35、40、45、50、55、60 ℃。反應結束后分離純化方法參照1.2.3.1。

1.2.3.3 不同固定化酶添加量下的酶催化反應 在50 ℃的溫度下,固定化PLA2的添加量(添加量(%)=固定化酶重量/總底物重量×100)為5%、10%、15%、20%、25%、30%,壓力12 MPa,旋轉速度400 r/min,反應進行7 h,反應結束后分離純化方法參照1.2.3.1。

1.2.3.4 不同反應時間下的酶催化反應 在50 ℃,12 MPa和400 r/min下進行反應,加入的PLA2的量為15%。酶水解時間分別為3、4、5、6、7、8、9 h,反應結束后分離純化方法參照1.2.3.1。

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 樹脂的蛋白吸附量和固定化磷脂酶活力測定 樹脂的蛋白吸附量定義為初始酶液中的蛋白量及過量酶液中的蛋白量的差值與固定化使用的樹脂量(mg/g)的比值。測定方法為考馬斯亮藍法,稱取一系列牛血清蛋白(BSA)標準溶液,分別加入5 mL考馬斯亮藍溶液,振蕩搖勻在25 ℃下靜置2 min,測定吸光度,然后繪制BSA標準曲線[15]。

酶活力定義為:在一定條件下1 min水解磷脂產(chǎn)生1 μmol的游離脂肪酸所需要的酶量為一個磷脂酶活力單位(U/g),測定方法參照李響[16]等人。固定條件如下:0.033 mol/L Tris-HCl,0.01 mol/L CaCl2,pH8.0,吸附溫度25 ℃,吸附時間12 h,固定載體D380[17]。

1.2.4.2 磷脂酰膽堿含量測定 自制南極磷蝦磷脂酰膽堿含量測定根據(jù)韓軼等人[18]的方法改進。取100 mg自制磷脂酰膽堿和相應的標準品溶于氯仿配制成一定濃度的磷脂酰膽堿溶液,準備110 ℃活化1 h的硅膠板,將磷脂酰膽堿氯仿溶液用此硅膠板進行層析。標準品溶液與樣品溶液點于同一硅膠板,配制好展開劑氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4,V/V/V)后,轉移至層析缸里飽和0.5 h達到平衡即可使用[18]。硅膠板下端留出1.5 cm的距離,點樣直徑3 mm左右為宜,待展開劑移動至硅膠板距離上邊緣1 cm處結束層析。取出硅膠板,避光干燥后,放入碘缸內,密封。升華的碘蒸汽遇到磷脂酰膽堿后,顯出黃色的斑點。通過磷脂酰標準品的Rf值為樣品定性。快速將磷脂酰膽堿的斑點從硅膠板刮下,使用鉬藍比色法測定其中的磷含量,再通過轉換系數(shù)換算成相應的磷脂酰膽堿的含量,磷脂的換算系數(shù)為26.31[19]。

計算公式為:

1.2.4.3 樣品中脂肪酸含量的測定 從硅膠板刮下的磷脂酰膽堿的斑點用氯仿溶解,0.22 μm濾膜過濾后用氮氣小心吹干,得到磷脂酰膽堿純品。甲酯化方法和氣相色譜條件參照Xi等人[20]的方法,之后使用氣相色譜-火焰離子化檢測器(GC-FID)對樣品進行脂肪酸分析。

氣相色譜條件為:RTX-WAX石英毛細管柱(30 m);進樣口溫度260 ℃,檢測器溫度260 ℃,進樣量1 μL,分流比1∶15;載氣為高純氮氣;升溫程序:60 ℃,1 min;10 ℃/min升溫至190 ℃,2 ℃/min升溫至236 ℃后保持2 min[20]。

根據(jù)37種脂肪酸甲酯混標的保留時間來確定樣品中脂肪酸組成,通過外標法計算出不同脂肪酸甲酯的相應因子,從而對樣品中的DHA進行定量分析。

DHA含量(mol%)=[樣品中的DHA含量(mol)/樣品中的脂肪酸總量(mol)]×100

反應完成后,將酶促反應產(chǎn)物從取樣口排出,濾膜過濾后氮氣保護,冷凍保存,脂肪酸分析方法同1.2.4.3,磷脂酰膽堿得率計算公式如下:

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復三次,采用Origin 8.5和Excel 2013作圖。

2 結果與分析

2.1 樹脂的蛋白吸附量和固定化磷脂酶活力

BSA標準曲線如圖2所示。

圖2 BSA標準曲線Fig.2 Standard curve of BSA solution

從圖2可以看出蛋白的含量與吸光度呈現(xiàn)線性關系,R2=0.9981,線性方程為:Y=5.365x-0.0191。

經(jīng)計算,PLA2的樹脂蛋白吸附量為66.23 mg/g,酶活為568.13 U/g,該固定化酶酶活表現(xiàn)良好,可以用于接下來的酶促反應。

2.2 磷標準曲線

橫坐標為磷含量,縱坐標為吸光度,繪制標準曲線,如圖3。磷的含量與吸光度呈良好的線性關系,R2=0.9991,線性方程為:Y=7.2116X+0.0054。

圖3 磷標準曲線Fig.3 Standard curve of the phosphorus content

通過換算,得出精制的南極磷蝦磷脂酰膽堿含量達到90.8%,可見分離純化方法可靠。純化后的南極磷蝦磷脂酰膽堿的純度高于市售大豆磷脂酰膽堿的純度(80%左右),這對接下來的反應是十分有利的。

2.3 反應壓力的影響

如圖4所示,最佳酶解壓力為12 MPa,此時樣品中DHA的含量最高,為59.3 mol%。當壓力低于12 MPa時,DHA含量呈增加的趨勢,但是當壓力高于12 MPa時,DHA的含量反而降低,壓力10 MPa時的DHA含量高于14 MPa時的含量,在20 MPa時磷脂酰膽堿中DHA的含量僅為36.6 mol%。然而磷脂酰膽堿的得率卻呈現(xiàn)與此相反的趨勢,在12 MPa時磷脂酰膽堿的得率最低,而20 MPa時得率最高。這可能是因為磷脂酰膽堿在PLA2催化下的酸解反應與其在超臨界環(huán)境中的水解反應有一定內在的聯(lián)系,當條件對酸解反應有利時,水解反應也會加劇。

超臨界CO2流體的溶劑化能力可以根據(jù)反應性能來定制,壓力通過直接改變反應物的溶解度或反應常數(shù)來影響反應速率[21-22]。在超臨界環(huán)境中由于較高的流體密度,物質的溶解度隨著壓力的增加而增加。此時,反應速率隨著壓力增加而增加。因此,在壓力比較低時,壓力增加對于酶促反應是有利的,但在超過一定閾值之后,可能反應的活化能增加也可能是酶在高壓下失水過多,導致酶構象發(fā)生改變,而逐步喪失活性。

圖4 壓力對DHA含量和PC得率的影響Fig.4 Effects of pressure on DHA contents and yields of PC

2.4 反應溫度的影響

如圖5所示,PLA2的活性在55 ℃達到最大值61.1 mol%。這一結果與其他研究結論一致,即在恒定壓力下溫度升高可以激活酶[23],溫度升高,流體的傳質速率和擴散系數(shù)增加,使得酶與底物可以進行充分有效的接觸[24]。55 ℃為最佳酶分解溫度,繼續(xù)升溫,DHA含量緩慢下降,這與酶活性受到高溫影響有關。

PC得率在55 ℃也同樣發(fā)生了明顯轉折,溫度高于55 ℃時,PC得率不再增加反而為迅速降低。溫度升高,使磷脂酰膽堿穩(wěn)定性降低,且此時體系內水分活度增加,這些都會加劇它的PC的水解。

圖5 溫度對DHA含量和PC得率的影響Fig.5 Effects of temperature on DHA contents and yields of PC

2.5 固定化酶添加量的影響

如圖6所示,在低添加量時,增加酶劑量帶來更高的DHA含量。當酶添加量為15%時,DHA的含量達到最大值59.3 mol%,為最佳添加量。在一定范圍內,磷脂酶的濃度越大,活性中心越多,底物與酶的活性中心結合的概率越大,反應速度也會越快;但酶相對于底物接近飽和時,濃度對反應速度的影響減小,當酶濃度過于飽和時,DHA的含量變現(xiàn)為下降,因為酶濃度的增加導致水解也隨之增加。

圖6 固定化酶添加量對DHA含量和PC得率的影響Fig.6 Effects of immobilised enzyme to total substrates ratio on DHA contents and yields of PC

而固定酶添加量從5%增加到30%時,PC得率下降了30%,這極有可能是因為加酶量增加導致水解副反應增加。

2.6 反應時間的影響

反應時間越長,結合在磷脂酰膽堿上的酰基供體越多,然而長時間的反應也可導致?；w移等一些副反應增加,PC得率逐漸下降,如圖7所示,反應時間6 h為最佳酶解溫度,此時DHA的含量達到最大值59.6 mol%,之后呈現(xiàn)下降的趨勢。另外朱珊珊[25]在使用PLA1進行催化合成富含共軛亞油酸磷脂的實驗中反應進行72 h后共軛酸含量才達到27.6 mol%,說明超臨界作為該反應的介質有明顯的優(yōu)勢。

圖7 反應時間對DHA含量和PC得率的影響Fig.7 Effects of time on DHA contents and yields of PC

2.7 改性磷脂的脂肪酸組成

在酶促反應之前,原料磷脂酰膽堿上的主要脂肪酸是肉豆蔻酸(C14∶0=6.4 mol%),棕櫚酸(C16∶0=19.7 mol%),油酸(C18∶1n-9=8.9 mol%),EPA(C20∶5n-3=22.2 mol%)和DHA(C22∶6n-3=17.3 mol%)。與原料相比,在最優(yōu)的超臨界反應條件下,改性磷脂酰膽堿的上述脂肪酸含量有所降低,但是其中EPA從22.2 mol%略微增加至24.0 mol%,DHA的含量從17.3 mol%上升至62.3 mol%。這說明超臨界反應介質中在PLA2催化下DHA成功地結合到磷脂酰膽堿上了。

注:每個分析都重復三次,結果取平均值。

3 結論

使用PLA2在超臨界CO2體系中催化磷脂酰膽堿的Sn-2位脂肪酸水解,使游離DHA結合到磷脂酰膽堿的Sn-2位制備高DHA含量的DHA-PC,并研究了酶添加量、時間、溫度和壓力參數(shù)對該工藝的影響。得到最佳酶分解條件分別為:固定化PLA2的添加量15%(占總底物),時間為6 h,溫度為55 ℃,壓力為12 MPa。在此條件下,南極磷蝦磷脂酰膽堿中DHA的含量從17.3 mol%(原料)上升至62.3 mol%,說明固定化PLA2可用于高DHA含量DHA-PC的制備實驗中,且在超臨界CO2體系中有較好的催化活性。

此外,磷脂酶的作用機制是復雜的。有很多因素影響酶發(fā)揮作用,這些影響因素相互作用,表現(xiàn)出協(xié)同或拮抗作用。例如,據(jù)報道,底物和產(chǎn)物的在體系中的濃度取決于壓力/溫度組合,并且物質在超臨界CO2中的溶解度的增加是隨著溫度的升高實現(xiàn)的[26]。因此,進一步的實驗研究將涉及多因素相互作用對該酶催化反應的影響。

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CatalyticsynthesisofDHA-PCwithhighDHAcontentsbyphospholipaseA2insupercriticalCO2system

LIZhen-zhen,XUFei-yue,HANYu-qian*,LINHong,FENGXiao-mei

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

TS218

A

1002-0306(2017)18-0085-06

2017-04-05

李珍珍(1990-),女,在讀碩士研究生,研究方向:食品加工與功能食品,E-mail:lixueping0628@163.com。

*通訊作者:韓玉謙(1962-),男,博士,教授,從事超(亞)臨界方面的研究,E-mail:hanyuqian@ouc.edu.cn。

國家自然科學基金(31071541);長江學者與創(chuàng)新研究團隊發(fā)展計劃(TRT1188)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.017