趙 明， 劉曉翠， 崔曉雪， 邱祥春， 王 羽，3△， 魏成喜，3△

(1. 內(nèi)蒙古民族大學第一臨床醫(yī)院， 2. 內(nèi)蒙古民族大學， 3. 內(nèi)蒙古民族大學醫(yī)學院藥物化學與藥理學研究所， 通遼 028000)

miRNA378*表達對柯薩奇B3病毒感染乳鼠心肌細胞凋亡、網(wǎng)腔鈣結合蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激伴侶蛋白表達的影響*

趙 明1， 劉曉翠2， 崔曉雪2， 邱祥春1， 王 羽2，3△， 魏成喜2，3△

(1. 內(nèi)蒙古民族大學第一臨床醫(yī)院， 2. 內(nèi)蒙古民族大學， 3. 內(nèi)蒙古民族大學醫(yī)學院藥物化學與藥理學研究所， 通遼 028000)

目的研究沉默miRNA378*表達對柯薩奇B3病毒(CVB3)感染心肌細胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、網(wǎng)腔鈣結合蛋白(calumenin)影響。方法原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞分為：對照組(正常細胞)、柯薩奇病毒感染組(正常細胞+柯薩奇B3病毒)、miRNA378*沉默對照組(正常細胞+柯薩奇B3病毒+轉染miRNA378*空質(zhì)粒)、miRNA378*沉默組(正常細胞+柯薩奇B3病毒+轉染miRNA378*沉默質(zhì)粒)，各組細胞分別轉染和感染處理后置37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。檢測細胞α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、細胞凋亡率、網(wǎng)腔鈣結合蛋白、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路因子激活轉錄因子6(ATF6)、轉錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表達。結果通過檢測ɑ-SMA蛋白，證實分離乳鼠細胞為心室肌細胞。TUNEL法檢測不同組心室細胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，柯薩奇病毒感染組心室肌細胞凋亡明顯，與柯薩奇病毒感染組心肌細胞相比較，miRNA378*沉默組心肌細胞凋亡細胞量明顯減少。與柯薩奇病毒感染組比較， Calumenin表達減少(P<0.01)，而GRP78、ATF6、CHOP表達增加(P<0.01)。結論CVB3病毒感染心肌細胞作用與miRNA378*，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激并激活信號通路因子，心肌細胞凋亡增加。

心肌細胞；乳鼠；miRNA378*；柯薩奇B3病毒；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；網(wǎng)腔鈣結合蛋白 ；凋亡

病毒性心肌炎(viralmyocarditis, VMC)是由病毒(主要由柯薩奇病毒)感染引起的心肌局限性或彌漫性的急性或慢性炎性病變[1]，病變可累及心肌細胞實質(zhì)和/或間質(zhì)，導致心肌收縮力減低，射血分數(shù)下降甚至無效射血，最終導致心力衰竭[2]。研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者心臟中存在心肌細胞凋亡, 致使存活的心肌工作細胞數(shù)量減少，心臟射血能力降低，導致心力衰竭[3]。心肌細胞凋亡途徑眾多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應通過其凋亡信號通路所介導心肌細胞凋亡是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡途徑[4]。 網(wǎng)腔鈣結合蛋白(calumenin)是一種位于心肌細胞肌漿網(wǎng)中具有調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)作用的鈣離子結合蛋白。microRNAs (miRNAs)是由內(nèi)源基因編碼的一類長約22個核苷酸的非編碼單鏈分子RNA, 參與轉錄后基因表達調(diào)控，抑制靶mRNA轉錄后的表達[5]。文獻報道：miRNA-378*能夠抑制H9c2心肌細胞calumenin表達[6]。但miRNA-378*對于柯薩奇B組病毒感染的心肌細胞中的凋亡、calumenin、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其凋亡信號通路是否具有作用以及是否通過抑制靶蛋白轉錄后的表達來影響心肌細胞凋亡的整個通路尚不明確。本實驗擬上調(diào)CVB3病毒感染心肌細胞miRNA-378*表達，觀察其對細胞凋亡、calumenin、ERS及其信號通路因子影響，進一步揭示病毒性心肌炎并發(fā)心力衰竭發(fā)病機制，為在臨床工作提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物藥品與儀器

1～3 d Balb/c新生乳鼠購置吉林大學基礎醫(yī)學院動物中心, 許可證號：scxk(吉)2011-0004； Calumenin antibody購于Bioss公司, GRP78 antibody，PERK antibody，P-PERK antibody，eIF2ɑ antibody，ATF4 antibody，CHOP antibody，購于Boster公司，內(nèi)參抗體β-actin購于wanleibio公司，慢病毒轉染miRNA-378*沉默質(zhì)粒由沈陽萬類生物科技公司合成；柯薩奇B3病毒，Woodruf親心肌株由吉林大學農(nóng)牧學院提供。

1.2 乳鼠心肌細胞的分離與培養(yǎng)

將乳鼠心臟放入培養(yǎng)皿中，將清洗后的心臟組織剪碎至1～3 mm3小塊。加入0.1%Ⅱ型膠原酶以及0.1%胰蛋白酶混合液，37℃消化25 min。離心7 min去上清。用PBS重懸沉淀，離心5 min，用培養(yǎng)基重懸細胞，過200目篩網(wǎng)去除大塊組織。離心去上清后加入1 ml的培養(yǎng)基重懸細胞，放置到培養(yǎng)板中。2 h差速貼壁法可去除大量的成纖維細胞，將剩余較純的心肌細胞放置在培養(yǎng)板。24 h后按實驗內(nèi)容將細胞接種于6孔板中，細胞濃度為5×104cells/ml，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，24 h可進行轉染。

1.3 免疫組織化學方法鑒定乳鼠培養(yǎng)心肌細胞

各組乳鼠培養(yǎng)心肌細胞進行免疫組化鑒定: 0.1%TritonX-100孵育;3%過氧化氫孵育;血清封閉; 一抗孵育;二抗孵育;辣根酶標記;DAB顯色;蘇木素復染;鏡檢。

1.4 細胞接種與培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。隔天換液處理，接種密度為70%為宜，便于病毒感染。

1.5 慢病毒轉染

(1)準備病毒：取出4℃保存的病毒，使用前輕輕搖勻。(2)感染目的細胞：病毒準備好之后，從培養(yǎng)箱中拿出細胞開始實驗。(3)使用移液器吸取準確體積(病毒數(shù)與細胞數(shù)比值為100∶ 1)的病毒液加入準備好的培養(yǎng)基中。(4)在培養(yǎng)基中加入ploybrene(6 μg/ml)來提高病毒的感染效率。(5)吸去細胞中剩的培養(yǎng)基，在目的細胞和對照組細胞中分別加入計算好的病毒液。(6)混勻后放于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜。(7)24 h后將含有慢病毒的培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液(含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基)，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 感染CVB3的乳鼠心肌細胞及實驗分組

乳鼠心肌細胞按照細胞濃度為5×104cells/ml接種于6孔板，并將其置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，心肌細胞隨機分成4組，每組3孔，對照組(正常細胞)、柯薩奇病毒感染組(正常細胞+柯薩奇B3病毒)、miRNA378*沉默對照組(正常細胞+柯薩奇B3病毒+轉染miRNA378*空質(zhì)粒)、miRNA378*沉默組(正常細胞+柯薩奇B3病毒+轉染miRNA378*沉默質(zhì)粒)。其中兩組細胞分別轉染miRNA378*空質(zhì)粒和miRNA378*沉默質(zhì)粒，處理24 h后，取3組細胞(1組正常細胞和2組轉染后細胞)與100 PFU的CVB3共同孵育1 h，棄上清，加入正常培養(yǎng)液作為CVB感染組；設立細胞對照組(僅加入培養(yǎng)液，不進行病毒感染)，將4組心肌細胞在37℃，置于CO2培養(yǎng)箱中3 d。

1.7 TUNEL法檢測各組心肌細胞凋亡

各組心肌細胞經(jīng)過TUNEL法標準實驗步驟：透化；PBS漂洗；封閉；滴加TUNEL反應液50 μl；保濕、避光、37℃孵育60 min；滴加Converter-POD 50 μl；保濕、37℃孵育30 min；DAB顯色：加DAB底物50 μl；蘇木素復染；顯微鏡下觀察染色效果，400×鏡下拍照。

1.8Westernblot檢測各組心肌細胞calumenin蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激伴侶蛋白GRP78及ATF6、CHOP表達

各組乳鼠心肌細胞經(jīng)下列實驗步驟：蛋白質(zhì)抽提；蛋白質(zhì)定量；取15 μl的樣品進行SDS-PAGE；轉印至PVDF膜；封閉；孵育一抗；孵育二抗；ECL底物發(fā)光；圖像保存。普通抗體的封閉液、一抗孵育液、二抗孵育液為5%脫脂奶粉溶液。檢測各組心肌細胞calumenin蛋白(1∶1 000)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)(1∶1 000)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路因子激活轉錄因子6(activation transcription factor 6, ATF6)(1∶1 000)、轉錄因子C/EBP同源蛋白(transcription factors c/ebp homologue protein，CHOP)(1∶1 000)表達。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 乳鼠心肌細胞鑒定

培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞經(jīng)免疫組化實驗，檢測出心肌細胞特有的ɑ-SMA蛋白，確定為心室肌細胞(圖1)

Fig.1Mouse myocardium celle(×400) A： Primary culture observed under microscope; B： Immunocytochemistry of culturing myocardial cell

2.2 心肌細胞凋亡的比較

用TUNEL 法檢測對照組心肌細胞僅有少量凋亡的細胞(凋亡率6.83%±0.71%)，柯薩奇病毒感染組心肌細胞凋亡明顯，凋亡率60.37%±7.20% (P<0.01), 與柯薩奇病毒感染組心肌細胞相比較，miRNA378*沉默組心肌細胞凋亡細胞量明顯減少，凋亡率為46.6%±8.3%(P<0.01，圖2)。

Fig.2Myocardial apoptosis in each group(×200) A： Control group; B： Coxsackie virus B3 infecton group; C： miRNA378*silence control group; D： miRNA378*silence group

2.3心肌細胞calumenin蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激伴侶蛋白GRP78及ATF6、CHOP表達

與對照組相比較，柯薩奇病毒感染組心肌細胞calumenin蛋白表達減少(P<0.01)，GRP78、ATF6、CHOP表達增加(P<0.01)；與柯薩奇病毒感染組相比較，miRNA378*沉默組calumenin蛋白表達顯著減少(P<0.01)； miRNA378*沉默組GRP78、ATF6、CHOP表達顯著增加(P<0.01，圖3，表1)。

Fig.3Expression change of Calumenin, GRP78 ATF6 and CHOP A： Control group; B： Coxsackie virus B3 infecton group; C： miRNA378*silence control group; D： miRNA378*silence group; GRP78: Glucose regulated protein 78; ATF-6: Activation transcription factor 6; CHOP: Transcription factors c/ebp homologue protein

GroupCalumeninGRP78 ATF6 CHOP A2265±192880±79753±82673±42B1335±119??1693±141??1355±121??1288±137??C1541±1341625±1331091±117716±126D613±42##2502±315##2611±221##2698±244##

A： Control group; B： Coxsackie virus B3 infecton group; C：miRNA378*silence control group; D： miRNA378*silence group; GRP78: Glucose regulated protein 78; ATF6: Activation transcription factor 6; CHOP: Transcription factors c/ebp homologue protein

**P<0.01vsA group;##P<0.01vsB group

3 討論

心肌細胞calumenin與RyR2通道及鈣泵(SERCA2a) 相互作用來調(diào)節(jié)心肌細胞鈣釋放、回攝與儲存，共同維持鈣循環(huán)穩(wěn)態(tài)[7]。文獻報道，病毒性心肌炎時，心肌細胞calumenin蛋白不但表達明顯減少，而且與SERCA2a結合能力減弱，從而使心肌細胞鈣循環(huán)穩(wěn)態(tài)失衡，心臟功能降低[8]。同時，病毒性心肌炎又可以導致心肌細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)，并激活ERS凋亡信號通路引起心肌細胞凋亡，引發(fā)心力衰竭[9]。研究發(fā)現(xiàn)calumenin可以緩解心肌細胞ERS并減少ERS介導的心肌細胞凋亡數(shù)量[10]，重度心力衰竭患者miRNA-378*表達顯著下降，隨著患者心功能好轉，miRNA-378*表達也明顯增加[11]。

miRNA-378 和miRNA-378*是一個基因出來的產(chǎn)物，叫正義鏈和反義鏈 。microrna前體有發(fā)卡結構，在成熟過程中發(fā)卡結構被剪掉，形成miRNA-378 和miRNA-378*，也叫左臂和右臂。通常正義鏈有功能，反義鏈無功能被降解。但是近年來，人們發(fā)現(xiàn)反義鏈有時候有功能，可以協(xié)助正義鏈功能，也可以拮抗正義鏈，或者和正義鏈功能毫無關系。本研究根據(jù)上述資料和本課題組研究結果，提出如下科學假說：柯薩奇B3病毒通過干預心肌細胞miRNA-378*表達來影響calumenin表達，進而引起ERS并通過ERS凋亡信號通路：ATF6→CHOP介導心肌細胞凋亡。

本實驗在成功培養(yǎng)原代培養(yǎng)乳鼠的心室肌細胞的基礎上，采用干擾技術下調(diào)miRNA-378*的表達，并與CVB3病毒感染處理后的心室肌細胞。TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)感染CVB3病毒的心室肌細胞凋亡率提高，而下調(diào)miRNA-378*后，心室肌細胞的凋亡率有所下降。證明下調(diào)miRNA-378*的表達可緩解CVB3病毒所致的心室肌細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是誘發(fā)凋亡的機制之一。本研究進一步探討miRNA-378*的作用是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分子伴侶GRP78及效應蛋白ATF6，CHOP，發(fā)現(xiàn)GRP78，ATF6，CHOP在CVB3病毒感染的心室肌細胞中均上調(diào)，而下調(diào)miRNA-378*后，3個蛋白表達量增加。說明miRNA-378*緩解心室肌細胞凋亡不通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路。最后，calumenin蛋白的表達也進行了檢測，下調(diào)miRNA-378*的心室肌細胞可提高因感染CVB3病毒而導致的表達減少。本研究結果部分揭示miRNA-378*可緩解病毒性心肌炎所致的凋亡，而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激無關，具體作用還需以后的實驗中進一步闡明。

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ThecorrelationresearchonmiRNA378*andcalumenin，endoplasmicreticulumstress，apoptosisinsucklingmousemyocardialcellsinfectedwithcoxsackievirusB3

ZHAO Ming1, LIU Xiao-cui2, CUI Xiao-xue2, QIU Xiang-chun1, WANG Yu2,3△, WEI Cheng-xi2,3△

(1. The Inner-Mongolia National University First Clinical Hospital, 2. The Inner-Mongolia National University, 3. The Inner-Mongolia National University Medical Chemistry and Pharmacology Institute, Tongliao 028000, China)

Objective: To investigate the effects of silencing miRNA378*on apoptosis, endoplasmic reticulum stress and calumenin of cardiomyocyte with coxsackie virus B3 (CVB3) infection.MethodsPrimary cultured suckling mouse myocardium were divided into control group (normal cell), coxsackie virus infection group (normal cell and coxsackie virus B3), miRNA378*control group (normal cell +coxsackie virus B3+miRNA378*empty plasmid), miRNA378*silencing plasmid group(normal cells + coxsackie virus B3 + miRNA378*silencing plasmid). Four groups of cells were transfected, infected and treated in CO2incubator at 37℃. The α-SMA protein, cell apoptosis rate, calumenin, glucose regulated protein 78 (GRP78) , activation transcription factor 6(ATF6) and transcription factors c/ebp homologue protein (CHOP) in endoplasmic reticulum were analyzed.ResultsBy detecting α-SMA protein, the isolated suckling mouse ventricular myocardium were confirmed. TUNEL detection of different groups of ventricular cell apoptosis found that coxsackie virus group of ventricular myocytes apoptosis was significant. Compared with the coxsackie virus infection group of myocardial cells, miRNA378*silencing plasmid expression of cardiomyocyte apoptosis cells significantly reduced(P<0.01). The expressions of GRP78, ATF6 and CHOP were increased compared with those infected by Coxsackie virus infection (P<0.01), while the expressions of calumenin were decreased (P<0.01).ConclusionCVB3 infected myocardial cells effected miRNA378*expression. It can trigger endoplasmic reticulum stress and activates signaling pathway factor and increase myocardial cell apoptosis.

cardiomyocytes; suckling mice; miRNA378*; coxsackie virus B3; endoplasmic reticulum stress; calumenin; apoptosis

R331.3；R-332

A

1000-6834(2017)04-304-04

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金(2015MS08153)

2016-06-07

2016-11-21

△

Tel: 0475-8314234； E-mail: shen348@126.com； weichengxi1224@163.com

10.12047/j.cjap.5461.2017.074