肖 敏， 屈小虎， 陳 慧， 金麗琴

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 溫州 325035)

AdipoRon對(duì)小鼠骨骼肌細(xì)胞胰島素敏感性的影響及其機(jī)制*

肖 敏， 屈小虎， 陳 慧， 金麗琴△

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 溫州 325035)

目的觀察脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑AdipoRon對(duì)小鼠成肌細(xì)胞株(C2C12)胰島素敏感性的影響，并探討其作用機(jī)制。方法使用馬血清將C2C12誘導(dǎo)分化為成肌細(xì)胞，分為6組(9個(gè)復(fù)孔)：空白對(duì)照組、AdipoRon(脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑)高劑量組、AdipoRon低劑量組、胰島素組以及AdipoRon低劑量+ PI3K(磷脂酰肌醇 3激酶)抑制劑組和胰島素+ PI3K抑制劑組，作用12 h，收集上清檢測(cè)葡萄糖消耗量，使用CCK8測(cè)定細(xì)胞增殖。六孔板中將C2C12誘導(dǎo)分化為肌管細(xì)胞，加入藥物作用12 h，并用RT-PCR 法檢測(cè)GLUT4的mRNA水平。結(jié)果與空白對(duì)照組相比，AdipoRon高劑量組、AdipoRon低劑量組、胰島素組耗糖量均有所增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。加入PI3K抑制劑組后，耗糖量與空白對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白對(duì)照組相比，AdipoRon高劑量組、AdipoRon低劑量組、胰島素組細(xì)胞均有增殖，但只有胰島素組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照空白組相比，AdipoRon高劑量組、AdipoRon低劑量組、胰島素組GLUT4mRNA水平均有所提高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。加入PI3K抑制劑組后，GLUT4mRNA水平與空白對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論AdipoRon能夠不影響細(xì)胞增殖的情況下增加葡萄糖的消耗量，這可能是通過提高胰島素敏感性發(fā)揮作用的，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。

胰島素敏感性；脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑；PI3K；小鼠成肌細(xì)胞株(C2C12)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一種體內(nèi)胰島素絕對(duì)或相對(duì)分泌不足而引起的以糖、脂肪、蛋白質(zhì)等代謝紊亂的內(nèi)分泌疾病, 會(huì)引起一系列的并發(fā)癥, 是嚴(yán)重危害社會(huì)和人類健康的慢性疾病之一[1]。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)[2]是二型糖尿病發(fā)病的重要因素和顯著特征，機(jī)體內(nèi)胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率下降( 主要是肝臟、肌肉和脂肪[3])，使得機(jī)體代償性的分泌過多胰島素。胰島素敏感用于描述胰島素抵抗的程度，通常胰島素敏感性越低，單位胰島素的作用效果越差，分解糖類的能力也越低。AdipoRon[4](脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑)通過多條信號(hào)通路，提高肌肉組織中游離脂肪酸的氧化和葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)速度，增加胰島素敏感性，從而降低胰島素抵抗的生物學(xué)作用。C2C12 細(xì)胞是來源于C3H 小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)和特性均一，可無限代培養(yǎng)，具有很好的分化能力，分化后細(xì)胞會(huì)發(fā)生明顯的結(jié)構(gòu)與功能性的改變，因此作為研究骨骼肌細(xì)胞增殖[5]代謝[6]損傷[7]等成熟體外模型。本課題通過研究AdipoRon對(duì)肌管細(xì)胞攝取葡萄糖的過程，初步探討AdipoRon的降糖作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

小鼠成肌細(xì)胞株(C2C12),購(gòu)買于上海中科院。

1.2 儀器和試劑

CFX ConnectTM熒光定量 PCR 檢測(cè)系(Bio-Rad)，酶標(biāo)儀；CO2培養(yǎng)箱： 美國(guó)Thermo公司。DMEM 高糖培養(yǎng)基(購(gòu)買于Gibco公司)，胎牛血清(購(gòu)買于Gibco公司)，馬血清(購(gòu)買于Gibco公司)，胰蛋白酶(購(gòu)買于Gibco公司)、DEPC水(購(gòu)買于碧云天公司)，LY294002(購(gòu)買于碧云天公司)，Trizol(購(gòu)買于Invitrogen 公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)買于Takala公司)，GLUT4 及β-actin 引物(上海生工公司)，SYBR Green(購(gòu)買于Bio-Red公司),葡萄糖試劑盒(購(gòu)買于南京建成生物公司)，AdipoRon(購(gòu)買于MCE公司)，CCK8試劑盒(購(gòu)買于日本同仁公司)。

1.3 C2C12 的分化

細(xì)胞用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，在10 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中長(zhǎng)至80%，將細(xì)胞消化下來，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種于六孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)目保持一致，六孔板中細(xì)胞長(zhǎng)至70%，用2%馬血清進(jìn)行分化，每孔加入2 ml 2%馬血清的DMEM培養(yǎng)基，隔天換液，4 d后，小鼠成肌細(xì)胞分化培養(yǎng)為成熟的肌管細(xì)胞。

1.4葡萄糖氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖水平

將分化好的C2C12細(xì)胞接種到96孔板，然后分成兩組，給藥組和對(duì)照組，給藥組分別加入含高劑量組(50 μg/ml的AdipoRon)、低劑量組(20 μg/ml的AdipoRon)、胰島素組(20 μg/ml胰島素)的2%HS DMEM培養(yǎng)基以及低劑量藥物加PI3K抑制劑組(20 μg/ml的AdipoRon和20 μg/ml LY294002(PI3K抑制劑))和胰島素加PI3K抑制劑組(20 μg/ml的AdipoRon和20 μg/ml LY294002)，對(duì)照組(只加DMEM培養(yǎng)基和不給藥組)，每組設(shè)定9個(gè)復(fù)孔。溫育12 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)液離心后留上清，并用gop-pod法檢測(cè)培養(yǎng)基中的葡萄糖量，用只加DMEM組的培養(yǎng)基的平均值減去其余各孔的葡萄糖量，得到各組細(xì)胞的耗糖量。PBS液洗細(xì)胞2次后，每孔加入100 μl配置好的CCK-8溶液，孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定在 450 nm處的吸光度。(本課題的劑量選擇是根據(jù)文獻(xiàn)[4] 和本課題在動(dòng)物水平的研究確定的。)

1.5 RT-PCR 法檢測(cè)GLUT4 mRNA 表達(dá)

采用 Trizol 法提取細(xì)胞的總RNA,并取1 μg 總RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取2 μl cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。GLUT4 和β-actin 引物由上海生工合成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 C2C12 細(xì)胞分化結(jié)果圖

實(shí)驗(yàn)中采用C2C12細(xì)胞傳代后細(xì)胞匯合至70%使用2%馬血清進(jìn)行分化，細(xì)胞在分化后第1天開始融合多核細(xì)胞，細(xì)胞仍保持成纖維細(xì)胞形態(tài)，第3天形成多核肌管，第4天90%以上均分化為成熟的肌管細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞作為藥物處理細(xì)胞(圖1)。

Fig.1Views of C2C12 cells raised in the myogenic differentiation medium under phase contrast microscope A-E: Day 0, 1, 2, 3, 4(×10); F: Day 4(×20)

2.2AdipoRon對(duì)骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖消耗的影響

結(jié)果顯示，干預(yù)12 h 后，AdipoRon高劑量組、AdipoRon低劑量組葡萄糖消耗量明顯增加，但不影響細(xì)胞增殖，且AdipoRon高劑量組細(xì)胞耗糖量較AdipoRon低劑量組顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。胰島素組葡萄糖消耗量顯著增加，且能促進(jìn)細(xì)胞增殖，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但加入PI3K抑制劑后，與AdipoRon低劑量組相比，AdipoRon低劑量+ PI3K抑制劑組(均為20 μg/ml)細(xì)胞耗糖量顯著下降。與胰島素組相比，胰島素+PI3K抑制劑組耗糖量顯著下降，且細(xì)胞活力顯著下降(表1)。

Tab.1Comparison of glu consumption and cell proliferation among six groups

GroupGlucoseconsumption(mmol/L)CellproliferationNC8．686±0．7970．6386±0．0458H12．880±0．315??#0．7255±0．0182L10．370±0．430?0．6625±0．0506L+P8．177±1．037#0．5733±0．0515I12．160±0．188??0．8300±0．0537?I+P10．150±0．548△0．5907±0．0394△

NC: Normal control; H: High AdipoRon; L: Low AdipoRon; L+P: Low AdipoRon with PI3K inhibitors; I： Insulin; L+P: Insulin with PI3K inhibitors

*P<0.05,**P<0.01vsNC group;#P<0.05vsL group;△P<0.05vsI group

2.3AdipoRon對(duì)骨骼肌細(xì)胞GLUT4mRNA表達(dá)的影響

胰島素和AdipoRon干預(yù)骨骼肌細(xì)胞12 h結(jié)果顯示，AdipoRon高劑量組、AdipoRon低劑量組GLUT4 mRNA表達(dá)量顯著增加，且AdipoRon高劑量組GLUT4 mRNA 表達(dá)量較AdipoRon低劑量組顯著增加。胰島素組GLUT4 mRNA 表達(dá)量顯著增加，。但加入LY294002后，與AdipoRon低劑量相比，AdipoRon低劑量+ PI3K抑制劑組(均為20 μg/ml)GLUT4 mRNA 表達(dá)量顯著減少。與胰島素組相比，胰島素+ PI3K抑制劑組(均為20 μg/ml)顯著減少(圖2)。

Fig.2Comparison of GLUT4 expression in the tissues among six groups NC: Normal control; H: High AdipoRon; L: Low AdipoRon; L+P: Low AdipoRon with PI3K inhibitors; I： Insulin; L+P: Insulin with PI3K inhibitors*P<0.05,**P<0.001vsNC group

3 討論

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病, 主要分為1型和2型糖尿病。1型糖尿病是由胰島β細(xì)胞破壞而導(dǎo)致胰島素絕對(duì)缺乏所引起，2型糖尿病是由胰島素相對(duì)不足所致[8]。目前發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素受體激 動(dòng)劑(AdipoRon) 具有抗糖尿病的生物學(xué)活性。本課題前期已經(jīng)在動(dòng)物水平驗(yàn)證了AdipoRon具有降血糖的作用[9]，這篇文章是研究其在細(xì)胞水平的胰島素增敏和降糖作用。

研究顯示[10]，在細(xì)胞水平上，胰島素抵抗表現(xiàn)為胰島素靶組織細(xì)胞(如骨骼肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等)攝取和利用葡萄糖的過程中發(fā)生障礙，骨骼肌(最大的胰島素靶器官)是利用葡萄糖產(chǎn)生ATP，當(dāng)骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用發(fā)生障礙，又沒有外界作用來刺激細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取及利用就會(huì)出現(xiàn)胰島素抵抗。文獻(xiàn)報(bào)道[11]，人體內(nèi)大多數(shù)組織細(xì)胞(如骨骼肌細(xì)胞)，可以利用細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUTs)的作用攝入葡萄糖，而GLUT4通過轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖來改善骨骼肌細(xì)胞的胰島素抵抗。本實(shí)驗(yàn)選用源于小鼠成肌細(xì)胞株C2C12，通過低濃度馬血清的作用，成功將C2C12成肌細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟的骨骼肌細(xì)胞，并用gop-pod法檢測(cè)細(xì)胞的耗糖量，比較細(xì)胞加入高低劑量AdipoRon和胰島素后的培養(yǎng)基的葡萄糖消耗程度，發(fā)現(xiàn)AdipoRon在不影響細(xì)胞的活力的情況下，增加細(xì)胞的耗糖量，從而影響骨骼肌細(xì)胞糖代謝。結(jié)果顯示：AdipoRon和胰島素兩種藥物能增加肌管細(xì)胞的葡萄糖消耗量，且與空白對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

采用gop-pod法檢測(cè)細(xì)胞的耗糖量的目的是觀察藥物如何影響骨骼肌和脂肪等胰島素敏感細(xì)胞的GLUT4 功能。本研究結(jié)果顯示AdipoRon能促進(jìn)分化好的C2C12 細(xì)胞葡萄糖攝取，提高細(xì)胞GLUT4 基因表達(dá)量，與對(duì)照空白組相比，加入AdipoRon和胰島素后，GLUT4 mRNA水平均有所增加，且與空白對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究報(bào)道[12，13]，正常生理?xiàng)l件下，胰島素作用的靶器官在攝取利用葡萄糖時(shí)是經(jīng)一步一步蛋白結(jié)合信號(hào)激活傳導(dǎo)下去的，即從胰島素受體(InsR) 到胰島素受體底物(IRS-1)，再到PI3K，最后傳遞至葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子(GLUT4) 等一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程完成的[14]。而LY294002是一種常用的PI3K抑制劑。LY294002可以通透細(xì)胞，特異性抑制PI3K，抑制PI3K/Akt信號(hào)途徑，包括常見的抑制Akt磷酸化等。本課題中，AdipoRon組和胰島素組加入PI3K抑制劑后，GLUT4mRNA水平均有所下降，且耗糖量也減少，說明AdipoRon發(fā)揮作用可能類似于胰島素，發(fā)揮了胰島素信號(hào)分子的作用，與胰島素受體亞單位結(jié)合，激活PI3K/Akt通路，攝取葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞。

本研究表明AdipoRon能促進(jìn)小鼠骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取，這可能是通過提高胰島素敏感性發(fā)揮作用的，但是關(guān)于AdipoRon是如何增加葡萄糖的攝取的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。

[1] 劉 穎, 金 宏, 許志勤, 等. 南瓜多糖對(duì)糖尿病大鼠血糖和血脂的影響[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2006, 22(3): 358-361.

[2] 陳 莉， 陳冠軍， 陳 兵， 等． 白藜蘆醇改善高脂血癥小鼠脂肪組織胰島素抵抗的機(jī)制探討[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 49(8)： 1104-1109.

[3] Guo S. Insulin signaling, resitance,and the metabolic syndrome: insights from mouse models into disease mechanisms [J].JEndocrinol, 2014, 220(2): T1-T23.

[4] Okada-Iwabu M, Yamauchi T, Iwabu M,etal. A small-molecule AdipoR agonist for type 2 diabetes and short life in obesity[J].Nature, 2013， 503(7477) : 493-499.

[5] Diao Y, Guo X, Li Y,etal. Pax3/7BP is a Pax7-and Pax3-binding protein that regulates the prolifertion of muscle precursor cells by an epigenetic mechanism[J].CellStemCell, 2012, 11(2): 231-241.

[6] You GY, Lee JO, Kim JH,etal. Tiam-1, a GEF for Racl, plays a critical role in metformin-mediated glucose uptake in C2C12 cells[J].CellSignal, 2013, 25(12): 2558-2565.

[7] Joshi D, Patel H, Baker DM,etal. Development of aninvitromodel of myotube ischemia[J].LabInvest, 2011, 91(8): 1241-1252.

[8] 鐘 靈, 王振富, 李玉山. 恩施綠茶茶多糖對(duì)糖尿病模型大鼠血糖的影響[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2013, 29(1): 77-80.

[9] 肖 敏， 屈小虎， 李長(zhǎng)西， 等. AdipoRon對(duì)2型糖尿病小鼠的治療及其可能的肝臟機(jī)制[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2016, 32(3): 198-201.

[10]趙丹丹， 穆倩倩， 方 心， 等. 降糖消渴顆粒含藥血清對(duì)C2C12細(xì)胞胰島素抵抗的影響 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2014, 29(5): 1577-1579.

[11]查愛云. 格列喹酮對(duì)小鼠骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取的影響[D]. 江蘇： 東南大學(xué)， 2010： 1-54.

[12]李 凡， 黃 慧， 宋立功， 等. 坎地沙坦改善C2C12細(xì)胞胰島素敏感性的機(jī)制研究 [J]. 中華保健醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 17(1): 21-23.

[13]Schulman IH， Zhou MS. Vascular insulin resistance：a potential link between cardiovascular and metabolic diseases [J].CurrHypertensRep， 2009, 11(1)： 48-55.

[14]康學(xué)東, 張瀚文, 余臣祖. 黃金膠囊對(duì)糖尿病大鼠血糖和肝細(xì)胞PI-3K、GLUT-4蛋白表達(dá)的影響[J]. 中醫(yī)研究, 2016, 29(1): 50-54.

TheeffectofAdipoRononinsulinsensitivityofmouseskeletalmusclecellsanditsmechanism

XIAO Min, QU Xiao-hu, CHEN Hui, JIN Li-qin△

(Department of Biology, School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)

Objective: To observe the effect of AdipoRon, an adiponin receptor agonist, on insulin sensitivity in mouse myoblast cell line (C2C12) and to explore its mechanism.MethodsC2C12 was induced to differentiate into myoblasts by using horse serum. Then the cells were divided into 6 groups (9 double wells): blank control group, high dose AdipoRon group, low dose AdipoRon group, insulin group and the low dose AdipoRon with PI3K inhibitor (phosphatidylinositol 3 kinase) group and the insulin with PI3K inhibitor group. After cultured for 12 h, the supernatant was collected and glucose consumption was measured. Cell proliferation was tested by using CCK8. In the 6-well plate, C2C12 was induced to differentiate into myoblasts. The drug was incubated for 12 h and the mRNA level of GLUT4 was detected by RT-PCR.ResultsCompared with the blank control group, the levels of glucose consumption in high dose AdipoRon group, low dose AdipoRon group and insulin group was increased significantly (P<0.05). After adding PI3K inhibitor, the levels of glucose consumption in the above mentioned three groups were not different from that in blank control group. high dose AdipoRon group, low dose AdipoRon group and insulin group had proliferation, but only the insulin group was statistically significant (P<0.05). Compared with the control group, the levels of GLUT4 mRNA in AdipoRon high dose group, low dose AdipoRon group and insulin group were all higher than those in control group (P<0.05). After adding PI3K inhibitor, GLUT4 mRNA level was not statistically significant compared with blank control group.ConclusionAdipoRon can increase the consumption of glucose without affecting cell proliferation, which may play a role in improving insulin sensitivity, but the specific mechanism remains to be further studied.

insulin resistance; AdipoRon; PI3K; mouse myoblast cell line (C2C12)

R587.1

A

1000-6834(2017)04-319-04

2015年度浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，2015C37099)

2016-11-28

2017-05-15

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Tel： 13857772722； E-mail: liqinjin@126.com

10.12047/j.cjap.5533.2017.078