李駿 陳林 范芹 龔曉嬌 楊成雪

3種金屬全冠修復(fù)對(duì)犬牙齦細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

李駿 陳林 范芹 龔曉嬌 楊成雪

目的檢測鈷鉻合金、銀鈀合金及純鈦金屬全冠修復(fù)后犬牙齦細(xì)胞中Bcl-2和Bax基因mRNA的表達(dá)，探討3種材料全冠修復(fù)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。方法選取5只成年雄性實(shí)驗(yàn)犬，將每只犬的牙弓分為4個(gè)區(qū)，以每區(qū)的尖牙為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別行鈷鉻合金（A組）、銀鈀合金（B組）及純鈦（C組）金屬全冠修復(fù)，第4區(qū)為空白對(duì)照（D組）；分別于修復(fù)后1、2、3個(gè)月采集尖牙牙齦組織，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法檢測牙齦細(xì)胞中Bcl-2、Bax基因mRNA的表達(dá)并計(jì)算Bcl-2/Bax的比率。結(jié)果修復(fù)后3個(gè)月，A組Bcl-2/Bax的比率高于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；修復(fù)后2、3個(gè)月，B組Bcl-2/Bax的比率低于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；修復(fù)后1、2、3個(gè)月， C組Bcl-2/Bax的比率與D組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)論鈷鉻合金抑制牙齦細(xì)胞凋亡，銀鈀合金促進(jìn)牙齦細(xì)胞凋亡，而純鈦對(duì)牙齦細(xì)胞的凋亡無明顯影響。

金屬全冠；B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2；Bcl-2相關(guān)蛋白X

作者單位：遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院種植科，貴州 遵義 563003

全冠是一種覆蓋整個(gè)牙冠表面的修復(fù)體，可以用來修復(fù)牙齒的形態(tài)、功能及美觀；可分為金屬全冠和非金屬全冠，近年來已廣泛應(yīng)用于臨床。在口腔環(huán)境中，金屬全冠容易發(fā)生腐蝕，釋放出各種金屬離子及其衍生物，從而對(duì)牙周組織的健康產(chǎn)生不良影響[1]。不同金屬由于成分及金相不同，對(duì)牙周組織細(xì)胞的刺激存在較大差異。隨著細(xì)胞和分子技術(shù)的發(fā)展，有學(xué)者開始從細(xì)胞凋亡的角度研究材料的生物相容性[2]。Bcl-2家族是目前研究較為深入的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因家族[3]，其中B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2）是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡基因，而Bcl-2相關(guān)蛋白X（Bcl-2associated X protein，Bax）則是Bcl-2家族中最具代表性的促進(jìn)凋亡基因。Bcl-2與Bax在功能上互相抑制，Bcl-2與Bax的比率對(duì)細(xì)胞是否發(fā)生凋亡起重要作用[4]。鈷鉻合金、銀鈀合金和純鈦是目前臨床常用的3種金屬材料，本文旨在探討3種材料全冠修復(fù)對(duì)牙齦細(xì)胞凋亡的影響；通過檢測細(xì)胞中Bcl-2和Bax兩種基因mRNA的表達(dá)，計(jì)算Bcl-2/Bax的比率，評(píng)估鈷鉻合金、銀鈀合金和純鈦的生物學(xué)性能。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康成年雄性實(shí)驗(yàn)犬5只（由遵義醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），按部位記錄法將每只犬的牙弓分為4個(gè)區(qū)，以每只犬的尖牙為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按區(qū)為單位隨機(jī)分為A、B、C、D 4個(gè)組，A組行鈷鉻合金全冠修復(fù)，B組行銀鈀合金全冠修復(fù)，C組行純鈦金屬全冠修復(fù)，D組作為空白對(duì)照，每個(gè)組共5顆牙。

1.2 建立全冠修復(fù)模型

1.2.1 犬齒齦上潔治、齦下刮治。

1.2.2 牙體預(yù)備 潔治4周后取犬牙列原始模型并制作個(gè)別托盤，然后按要求備牙：牙合面預(yù)備1.5 mm，軸面預(yù)備1.5 mm，肩臺(tái)寬1.0 mm，頸緣位于齦下0.5 mm。

1.2.3 制取模型 送義齒加工中心制作全冠。

1.2.4 試戴、調(diào)牙合并粘固金屬全冠。

1.3 樣本采集與檢測

1.3.1 牙齦細(xì)胞的采集和保存 將各實(shí)驗(yàn)牙的頰側(cè)齦緣從近中至遠(yuǎn)中3等分，分別于修復(fù)后1、2、3個(gè)月在每個(gè)牙位的相應(yīng)等分部位，由齦緣向根方切取寬1 mm、長2 mm的牙齦組織，放入凍存管，-180℃液氮罐保存。

1.3.2 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）的方法檢測Bcl-2和Bax基因mRNA的相對(duì)表達(dá)。

（1）引物設(shè)計(jì)合成：

（2）提取總RNA。

（3）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

（4）實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：①每個(gè)樣本分別用待檢測基因和內(nèi)參基因引物擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，反應(yīng)體系在ABI7900 qPCR儀上進(jìn)行：95℃、2 min，94℃、20 s，65℃、20 s，72℃、30 s，40個(gè)循環(huán)；②用CT值（每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）代表實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果，采用△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，A、B、C三組分別與D組比較，采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA的質(zhì)量檢測

用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的純度，OD 260 nm/280 nm比值在1.8～2.0之間?？俁NA電泳，從上往下分別為28S和18S條帶，可以看出，28S和18S條帶比較完整，說明純度符合要求，見表1。

圖1 RNA電泳圖

2.2 全冠修復(fù)前后各組牙齦細(xì)胞中Bcl-2和Bax的表達(dá)及Bcl-2/Bax的比率

（1）修復(fù)后1個(gè)月，A、B、C組Bcl-2和Bax的表達(dá)及Bcl-2/Bax的比率，與D組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

（2）修復(fù)后2個(gè)月，B組Bax的表達(dá)與D組相比有所增加，Bcl-2/Bax的比率與D組相比有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A、C組Bcl-2和Bax的表達(dá)及Bcl-2/Bax的比率和D組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

（3）修復(fù)后3個(gè)月，A組Bcl-2和Bax的表達(dá)及Bcl-2/Bax的比率與D組相比有所增加；B組Bcl-2和Bax的表達(dá)與D組相比有所增加，Bcl-2/Bax的比率與D組相比有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組Bcl-2和Bax的表達(dá)及Bcl-2/Bax的比率，與D組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

3 討論

隨著金屬全冠修復(fù)廣泛應(yīng)用于臨床，認(rèn)識(shí)和防治全冠金屬材料對(duì)牙周組織細(xì)胞的影響越來越受到學(xué)者的關(guān)注。傳統(tǒng)的檢測牙周組織健康狀況的方法，主要是依賴一些臨床參數(shù)，如探診深度、牙齦指數(shù)等。這些參數(shù)只能描述牙周組織改變的結(jié)果，而不能反映牙周組織目前的活動(dòng)狀態(tài)和未來的活動(dòng)。近年來，一些學(xué)者開始從細(xì)胞和分子的領(lǐng)域研究修復(fù)體材料對(duì)牙周組織的影響，以期更好的評(píng)估材料的生物學(xué)性能。

細(xì)胞凋亡是一種廣泛存在的由特定基因編碼的以細(xì)胞DNA降解為特征的無明顯細(xì)胞溶解的細(xì)胞自殺過程。凋亡可以從形態(tài)、蛋白、基因等不同水平進(jìn)行檢測，具有良好的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，可作為評(píng)價(jià)口腔材料生物學(xué)性能的新方法[5]。Pioletti[6]應(yīng)用RTPCR法檢測口腔種植材料對(duì)成骨細(xì)胞Bcl-2和Bax基因mRNA表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)對(duì)Bcl-2和Bax表達(dá)的觀察能夠有效評(píng)估材料與細(xì)胞間的相互作用。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最具有代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因。Bcl-2是從淋巴瘤中分離出來的原癌基因[7]，Bcl-2基因編碼相應(yīng)的Bcl-2蛋白，Bcl-2蛋白能夠抑制細(xì)胞凋亡，參與調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡，同細(xì)胞分化、成熟及腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Bax為凋亡誘導(dǎo)因子[8]，Bax基因編碼相應(yīng)的Bax蛋白，當(dāng)Bax蛋白形成同源二聚體時(shí)，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]；當(dāng)Bax蛋白與Bcl-2蛋白形成異源二聚體時(shí)，則抑制細(xì)胞凋亡。Siqueira等[10]研究凋亡抑制因子Hsp27在多形性腺瘤中高表達(dá)并伴有Bcl-2/Bax的比率升高，證實(shí)了Bcl-2/Bax的比率與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。

表1 修復(fù)后1個(gè)月牙齦細(xì)胞中Bcl-2、Bax的表達(dá)及Bcl-2/Bax的比率（±s，n=5）

表1 修復(fù)后1個(gè)月牙齦細(xì)胞中Bcl-2、Bax的表達(dá)及Bcl-2/Bax的比率（±s，n=5）

組別Bcl-2 Bax Bcl-2/BaxA組 1.050±0.216 1.149±0.328 0.991±0.170 B組 1.062±0.277 0.928±0.198 1.173±0.148 C組 1.116±0.326 0.936±0.196 1.191±0.171 D組 1.033±0.044 1.017±0.016 1.004±0.049

表2 修復(fù)后2個(gè)月牙齦細(xì)胞中Bcl-2、Bax的表達(dá)及Bcl-2/Bax的比率（±s，n=5）

表2 修復(fù)后2個(gè)月牙齦細(xì)胞中Bcl-2、Bax的表達(dá)及Bcl-2/Bax的比率（±s，n=5）

注：與D組相比，*P＜0.05

組別Bcl-2 Bax Bcl-2/BaxA組 1.242±0.254 1.305±0.283 0.957±0.310 B組 1.304±0.227 1.656±0.482* 0.722±0.237*C組 1.005±0.182 0.974±0.192 1.104±0.102 D組 1.026±0.014 1.047±0.043 1.010±0.038

表3 修復(fù)后3個(gè)月牙齦細(xì)胞中Bcl-2、Bax的表達(dá)及Bcl-2/Bax的比率（±s，n=5）

表3 修復(fù)后3個(gè)月牙齦細(xì)胞中Bcl-2、Bax的表達(dá)及Bcl-2/Bax的比率（±s，n=5）

注：與D組相比，*P＜0.05

組別Bcl-2 Bax Bcl-2/BaxA組 3.937±0.582* 1.978±0.085* 2.010±0.377*B組 2.095±0.438* 3.454±0.592* 0.623±0.252*C組 1.129±0.302 1.097±0.253 1.191±0.171 D組 1.066±0.071 1.046±0.040 1.101±0.099

本實(shí)驗(yàn)以犬為研究對(duì)象，按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)行金屬全冠修復(fù)，避免了臨床患者個(gè)體差異大、修復(fù)后回訪率過低等問題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：銀鈀合金金屬全冠修復(fù)后2個(gè)月，Bax基因mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比有所增加，Bcl-2/Bax的比率下降；修復(fù)后3個(gè)月，Bcl-2和Bax兩種基因mRNA的表達(dá)與D組相比均有所增加，而Bcl-2/Bax的比率下降；提示銀鈀合金在口腔環(huán)境中會(huì)析出一定量的金屬離子及其衍生物，這些產(chǎn)物具有一定的細(xì)胞毒性，可促進(jìn)牙齦細(xì)胞的凋亡。鈷鉻合金金屬全冠修復(fù)后3個(gè)月，Bcl-2和Bax兩種基因mRNA的表達(dá)與D組相比均有所增加，而Bcl-2/Bax的比率升高；提示鈷鉻合金會(huì)抑制牙齦細(xì)胞的凋亡，可能的原因依然是析出的金屬離子及其衍生物，對(duì)正常細(xì)胞的周期產(chǎn)生了影響，但其機(jī)制尚不能明確。純鈦金屬全冠修復(fù)前及修復(fù)后第1、2、3個(gè)月，牙齦細(xì)胞中Bcl-2和Bax兩種基因mRNA的表達(dá)與D組相比無明顯改變，提示純鈦不會(huì)對(duì)牙齦細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生明顯影響；劉婷等[5]通過Western blot技術(shù)檢測4種烤瓷合金浸提液培養(yǎng)72 h的人牙齦成纖維細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá)強(qiáng)度，提示純鈦具有較好的生物相容性，其結(jié)果與本研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)研究周期終止于全冠修復(fù)后3個(gè)月，由于各種合金在口腔環(huán)境中均會(huì)逐漸鈍化，生成的鈍化膜對(duì)材料起保護(hù)作用而使合金的腐蝕速度減慢；因此，三種金屬材料對(duì)牙齦細(xì)胞凋亡的遠(yuǎn)期影響還有待進(jìn)一步研究。

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Influence onBcl-2andBaxin Gingival Cells of the Dogs After Restored With Three Types of Full Metal Crown

LI Jun CHEN Lin FAN Qin GONG Xiaojiao YANG Chengxue Implant Department, Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical College,Zunyi Guizhou 563003, China

ObjectiveTo observe the expression ofBcl-2andBaxgene in gingival cells of the dogs after restored with cobalt-chrome alloy full crown and palladium-silver alloy full crown and pure titanium full crown.Investigate the effects of three materials on apoptosis of the gingival cells.Methods5 adult male dogs were chosen for the experiment, each dog’s dental arch was divided into 4 sections. Each of the fang of each area was restored with cobalt-chrome alloy crown, palladium-silver alloy crown and pure titanium crown respectively, the fourth area is for control group. To collect the gingival tissue of fangs in 1, 2 and 3 months after restoration.The level ofBcl-2and Bax gene expression were detected by RT-PCR.ResultsAfter 3 months restoration, the group A was superior to group D on theBcl-2/Baxratio with statistically significant difference(P<0.05). After 2 and 3 months restoration, the group B was inferior to group D on theBcl-2/Baxratio with statistically significant difference (P<0.05). After 1, 2 and 3 months restoration, the group C had no statistically significant difference with group D on theBcl-2/Baxration (P>0.05).ConclusionThe cobaltchromium alloy inhibits the apoptosis of gingival cells, the palladium-silver alloy promotes the apoptosis of gingival cells, while the pure titanium has no obvious effect on the apoptosis of gingival cells.

full metal crown;Bcl-2;Bax

R783

A

1674-9308（2017）21-0085-04

10．3969/j．issn．1674-9308．2017．21．043

遵義醫(yī)學(xué)院2012年度碩士啟動(dòng)科研基金（ZYKQS-2）

陳林